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Genetic diversity of clones of acerola assessed by ISSR molecular markers/ Diversidade genetica de clones de aceroleira avaliada por meio de marcadores moleculares ISSR.

Introducao

A aceroleira (Malpighia emarginata) e originaria de regioes da America Central, Noroeste da America do Sul e Antilhas (Maciel et al., 2010). E uma importante frutifera tropical, que se caracteriza por um crescimento rapido e desordenado dos pomares, com mudas obtidas por via sexuada, originando alta segregacao no porte e na producao da planta, no tamanho, forma, cor e teor de vitamina C dos frutos (Maciel et al., 2008).

Nos pomares brasileiros observa-se alta variabilidade entre os materiais cultivados no que se refere a importantes caracteristicas como produtividade, habito de crescimento e porte da planta, arquitetura da copa, cor, sabor, consistencia e tamanho do fruto, alem do rendimento de polpa, entre outras, resultado da propagacao seminal. Esta alta variabilidade dos materiais geneticos acarreta serios problemas ao sistema de producao, pois dificulta a execucao racional de todas as praticas culturais, desorganizando, principalmente, o sistema de comercializacao do produtor, com prejuizos (Oliveira et al., 2009).

Entretanto, a criacao de programas de melhoramento genetico para essa cultura proporcionou o desenvolvimento de clones, os quais minimizam os problemas da grande variabilidade observada nos pomares. Mas, por outro lado, a utilizacao de poucos clones por muitos anos pode resultar em uma maior vulnerabilidade genetica desses materiais as pragas e doencas. Em razao disso, a preservacao da variabilidade genetica da acerola, mediante a constituicao de bancos de germoplasma, tem grande importancia tanto do ponto de vista da conservacao biologica como da aplicacao no melhoramento genetico (Salla et al., 2002). Assim, o conhecimento da variabilidade genetica e da relacao entre diferentes acessos de aceroleira e importante para maximizar o uso de recursos geneticos para futuros programas de melhoramento (Oliveira et.al, 2009).

Os marcadores morfologicos contribuiram significativamente para o estabelecimento dos principios teoricos do mapeamento genetico e das analises de ligacao genica (Lanza et al., 2000; Eloi, 2010). Entretanto, a caracterizacao de genotipos, bem como o estudo da variabilidade com base nestes caracteres, apresenta uma serie de limitacoes, tais como: a demora na avaliacao; o fato de nao poder ser realizada em qualquer periodo do ano; em plantas frutiferas muitas avaliacoes somente sao possiveis de serem realizadas quando estas entram em producao, requerendo, assim, um custo elevado e tempo prolongado para analise; acesso de pequena porcao do genoma da planta; os marcadores morfologicos sao dependentes e influenciados pelo ambiente (Yamagishi et al., 2005; Franzon et al., 2010). Alem disso, essas avaliacoes sao realizadas de forma subjetiva, e o resultado pode variar de acordo com a percepcao dos avaliadores (Franzonet al., 2010). Com o advento da biologia molecular, tornou-se possivel a manipulacao do DNA, que culminou no surgimento dos varios tipos de marcadores moleculares (Souza et al., 2008). Segundo Ferreira & Grattapaglia (1998), um marcador molecular e definido como todo e qualquer fenotipo molecular proveniente de um gene expresso, como no caso de isoenzimas, ou de um segmento especifico de DNA (correspondendo a regioes expressas ou nao do genoma). Diversas tecnicas moleculares estao disponiveis para a avaliacao da diversidade genetica em nivel de sequencia de DNA, ou seja, para a determinacao do polimorfismo genetico, permitindo a obtencao de um numero ilimitado de marcadores moleculares cobrindo todo o genoma do organismo.

Dentre as diversas tecnicas moleculares, os marcadores ISSR (Inter Simple Sequence Repeats), tem sido utilizado com bastante sucesso pra relevar o polimorfismo molecular em diversas especies vegetais (Almeida Junior et al., 2008), sendo considerado como um dos marcadores amplamente variaveis devido grande ocorrencia e distribuicao no genoma (Ellegren, 2004). Alem disso, e um marcador que possui a vantagem de nao requerer informacoes previas do genoma revelando padroes altamente polimorficos (Zietkiewcz et al., 1994), mostrando-se uteis em estudo geneticos, especialmente no estudo da diversidade genetica e das relacoes de individuos proximamente relacionados (Salimath et al., 1995).

O objetivo do presente estudo foi estimar a variabilidade genetica de clones de aceroleira da colecao de germoplasma da Embrapa Agroindustria Tropical utilizando-se marcadores ISSR.

Material e Metodos

Para a realizacao desse trabalho foram utilizados 56 clonesde aceroleira, sendo 38 clones provenientes do jardim de sementes e 18 clones do jardim clonal. Todos os clones encontram-se no Campo Experimental de Pacajus da Embrapa Agroindustria Tropical, que esta localizado no municipio de Pacajus-CE e constituem a colecao de germoplasma de acerola da Embrapa--CNPAT.

Para a realizacao da extracao de DNA, foram coletadas folhas jovens de cada clone. As folhas foram acondicionadas em sacos plasticos e mantidas resfriadas durante o transporte, em caixa de isopor com gelo, ate o Laboratorio de Biologia Molecular da Embrapa Agroindustria Tropical, onde foram mantidas congeladas a temperatura de -20[degrees]C ate o inicio das extracoes de DNA.

As extracoes de DNA foram efetuadas usando o protocolo de Doyle & Doyle (1987), adaptado a partir do metodo utilizando-se o detergente CTAB (Cationic Hexadecyl Trimethyl Ammonium Bromide). Apos as extracoes, a qualidade do DNA extraido foi verificada em gel de agarose 1% e a quantificacao foi realizada em espectrofotometro NanoDrop 2000. Adotouse como parametro de definicao da pureza das amostras de DNA extraido o desempenho constatado para a relacao [A.sub.260]/[A.sub.280], considerado ideal quando dentro do intervalo de 1,8 a 2,0. Depois da quantificacao da concentracao de acidos nucleicos extraidos, as amostras de DNA foram diluidas para a concentracao de 10 ng [micro]L-1 e armazenadas em freezer a -20[degrees]C.

Foram realizados testes preliminares de amplificacao com 56 iniciadores ISSR da marca IDT (Integrated DNA Technologies), utilizando quatro genotipos selecionados ao acaso, onde foram feitas reacoes de PCR com os quatro genotipos e os 56 iniciadores, foram observados os iniciadores cuja apresentava as bandas padroes (presenca e ausencia). Desses, 25 iniciadores apresentaram os melhores resultados quanto a amplificacao em termos de quantidade, nitidez de bandas e polimorfismo gerado pelas bandas. A partir dos resultados iniciais obtidos, esses iniciadores foram selecionados para realizar a caracterizacao dos 56 genotipos de aceroleira.

Os padroes de fragmentos que cada iniciador produziu, em cada combinacao de fatores, foram avaliados visualmente, tendo-se observado a reprodutibilidade e a intensidade dos fragmentos e a presenca de polimorfismo. Finalmente, foram escolhidos 20 iniciado resentre os 25 testados.

As reacoes de ISSR foram realizadas em um volume final de 25 [micro]l, compostas por: 2,5 [micro]l de tampao de reacao 10x, 1,0 [micro]l de Mg[Cl.sub.2] 50 mM, 0,2 [micro]l de dNTPs (10 mM por nucleotideo), 2,0 [micro]l de DNA (10 ng [micro][l.sup.-1]), 2 [micro]l de cada iniciador (10 [micro]M),0,2 [micro]l de Taq DNA polymerase (1,0 U) e agua ultra pura para completar o volume da reacao. Todos os reagentes usados foram da marca Invitrogen.

As condicoes de PCR utilizadas foram: 5 minutos a 94[degrees]C (desnaturacao inicial), seguindose de 40 ciclos de desnaturacao (94[degrees]C por 1 minuto), anelamento (47-55[degrees]C, dependendo do iniciador, por 1 minuto) e extensao (72[degrees]C por 1 minuto) seguindo-se de uma etapa de extensao final (72[degrees]C por 5 minutos). Todas as reacoes de PCR foram realizadas no termociclador TECHNE, modelo TC 512. As reacoes foram preparadas isoladamente. Os produtos amplificados foram separados em gel de agarose (1,8%) corados com brometo de etideo (0,5 [micro]g [micro][L.sup.-1]) e submetidos a eletroforese a 90 volts por 3 horas. Posteriormente, os geis foram visualizados sob luz UV e fotografados em fotoducumentador digital Canon PowerShot A620. Para a analise dos resultados, foram utilizados os recursos computacionais do programa Genes (Cruz, 2008). A analise estatistica foi feita com base na matriz de dados binarios formada por meio da analise dos geis de ISSR, onde, para a presenca de banda, foi atribuido o valor 1, enquanto a ausencia desta foi atribuido o valor zero. A distancia genetica foi calculada aos pares entre os genotipos, pelo complemento aritmetico do indice de Jacard (Cruz & Carneiro, 2003). Com base na matriz de dissimilaridade, utilizou-se dos metodos de agrupamento de otimizacao de Tocher.

Resultados e Discussao

Na analise de pureza do DNA extraido, verificadas pelas relacoes A260/ A280, constatouse que foram obtidas amostras de boa qualidade variando de 1,70 a 2,00. A integridade do DNA e fundamental para a nitidez e reprodutibilidade dos produtos de amplificacao via PCR (Ferreira & Grattapaglia, 1995). As quantidades extraidas foram suficientes para realizacao de todas as reacoes.

A analise dos dados com os 20 iniciadores selecionados revelou variacao no numero de fragmentos amplificados, totalizando 186 fragmentos de DNA. Foi possivel identificar 148 (79,57%) fragmentos polimorficos (Tabela 1), com uma media de 9,3 marcadores por iniciador ISSR. O numero de bandas polimorficas por iniciador variou de tres (I 822 e I 812) a doze (I 808), e o polimorfismo variou de 42,85% (I 812) a 100% (I 827). Salla et al., (2002) ao avaliarem a diversidade genetica de 24 genotipos de Malpighia emarginata utilizando 37 iniciadores RAPD, obtiveram 164 fragmentos de DNA, onde 149 foram polimorficas (90,8%).

Salla et al., (2002), citam que a variabilidade detectada com marcadores de DNA concorda igualmente com as informacoes existentes sobre a origem dos genotipos de acerola cultivados no Brasil. No entanto, apesar de ter uma base genetica estreita, uma elevada segregacao genetica pode ainda ser observada em pomares onde sementes sao intensamente utilizadas na producao de mudas (Carvalho, 1998). Na Figura 1 encontra-se o padrao obtido a partir do iniciador de codigo I 841.

A partir do polimorfismo identificado foi possivel determinar a matriz de distancias entre os acessos. As distancias geneticas entre os 56 clones variaram entre 0,358 e 0,766. A menor distancia genetica (0,358) foi obtida entre os genotipos 8 (26/6/5) e 9 (26/8/7). A maior distancia genetica (0,766) foi observada entre os genotipos 32 (68/1/15) e 36 (12/7/15).

A utilizacao do metodo de otimizacao de Tocher, fundamentado na dissimilaridade, possibilitou a distribuicao dos genotipos estudados em 28 grupos distintos (Tabela 2). Verifica-se uma grande distribuicao dos genotipos em grupos diferentes, indicando uma ampla diversidade entre os genotipos avaliados. Oliveira et al., (2009), estudando a divergencia genetica utilizando marcadores moleculares RAPD entre 48 acessos de aceroleiras pelo metodo de Otimizacao de Tocher, agrupou os mesmos em 13 grupos distintos. Por outro lado, Filho et al., (2010), avaliando a diversidade genetica de 25 acessos de goiabeiras, pelo metodo de Tocher foi possivel separar em 12 grupos distintos.

No primeiro grupo observa-se a presenca de tres clones (5, 36%)(Tabela 02). Este grupo foi o que concentrou mais individuos. Geralmente, os grupos maiores, formados por mais acessos, agrupam os pares que apresentam menores distancias, uma vez que o tamanho do grupo e delimitado por uma distancia media entre os pares de individuos (Oliveira et al., 2009).

Os grupos (I, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XM,XMI, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII, XIX, XX, XXI, XXII, XXIII, XXIV, XXV, XXVI, XXVII) apresentaram dois acessos cada. Por outro lado, o grupo XXVIII foi formado por apenas um clone 55 (FLORIDA T). Segundo Vieira et al., (2008) grupos formados por apenas um individuo apontam na direcao de que tais individuos sejam mais divergentes em relacao aos demais, como pode ser observado neste trabalho. Caixeta et al. (2003), estudando variacoes geneticas em populacoes de Eucalyptus spp. por meio de marcadores RAPD, observaram a formacao de dois grupos isolados, sendo os mesmos considerados os mais divergentes entre os 44 genotipos estudados.

De acordo com Fonseca et al., (2006), alta variabilidade genetica possibilita a identificacao de genotipos divergentes e, por conseguinte, possiveis combinacoes hibridas de maior efeito heterotico, e assim, permitindo em suas geracoes segregantes o desenvolvimento de genotipos superiores. Devendo-se, portanto, na selecao de genitores para cruzamentos, procurar sempre aliar o bom desempenho fenotipico dos genotipos com a divergencia genetica.

Lopes et al., (2002), estudando o polimorfismo isoenzimatico de aceroleira, sugerem que o alto grau de polimorfismo observado nesta cultura seja um indicativo de consideravel taxa de cruzamento, confirmando a predominancia de alogamia da aceroleira. Segundo Oliveira et al., (2007), estudos de diversidade sugerem que ha uma tendencia em germoplasma de plantas arboreas e arbustivas, alogamas ou autogamas com alta taxa de alogamia, especialmente naquelas pouco melhoradas, apresentarem alto polimorfismo. Portanto, de acordo com os resultados obtidos neste trabalho constata-se a possibilidade de se obter ganhos geneticos significativos com o emprego dos clones considerados nesta avaliacao a partir do seu emprego em futuros programas de melhoramento genetico.

Conclusao

Ha significativa variabilidade genetica entre os clones estudados. O clone 55 (FLORIDA T) foi o mais divergente, podendo ser indicado para cruzamentos em programa de melhoramento da cultura da aceroleira. Entretanto, o mesmo necessita de analises morfologicas para que seja verificado os seus atributos de qualidade.

Recebido: 25 Maio 2013

Aceito: 08 Maio 2015

Referencias

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Eveline Nogueira Lima (1) *, Maria Emilia Bezerra de Araujo (1), Candida Herminia Campos de Magalhaes Bertini (1), Carlos Farley Herbster Moura (2), Maraisa Crestani Hawerroth (3)

(1) Universidade Federal do Ceara, Fortaleza, CE, Brasil.

(2) Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria, Brasilia, DF, Brasil.

(3) Empresa de Pesquisa Agropecuaria e Extensao Rural de Santa Catarina, Cacador, SC, Brasil.

* Autor correspondente: e-mail: evelinenlima@gmail.com

Tabela 1. Sequencia do iniciador, bandas geradas e bandas
polimorficas obtidas a partir da adocao dos 20 iniciadores ISSR
utilizadas na caracterizacao dos genotipos de aceroleira

Iniciador   Sequencia                    BG   BP
            (5' [right arrow] 3')

808         5' AGA GAG AGA GAG AGA GC    14   12
822         5' TCT CTC TCT CTC TCT CA     4    3
826         5' ACA CAC ACA CAC ACA CC     9    6
816         5' CAC ACA CAC ACA CAC AT     8    7
811         5' GAG AGA GAG AGA GAG AC     9    7
846         5' CAC ACA CAC ACA CAC ART   15   11
817         5' CAC ACA CAC ACA CAC AA     9    8
827         5' ACA CAC ACA CAC ACA CG    10   10
812         5' GAG AGA GAG AGA GAG AA     7    3
857         5' ACA CAC ACA CAC ACA CYG   12   10
828         5' TGT GTG TGT GTG TGT GA     8    7
829         5' TGT GTG TGT GTG TGT GC     7    5
834         5' AGA GAG AGA GAG AGA GYT   10    6
818         5' CAC ACA CAC ACA CAC AG     9    8
830         5' TGT GTG TGT GTG TGT GG     8    7
848         5' CAC ACA CAC ACA CAC ARG   11    9
821         5' GTG TGT GTG TGT GTG TT     8    6
841         5' GAG AGA GAG AGA GAG AYC   11    8
823         5' TCTCTCTCTCTCTCTCG          8    7
844         5' CTC TCT CTC TCT CTC TRC    9    8

TOTAL                                    186  148

Iniciador   Polimorfismo (%)   Temp. anelamento
                                 ([degrees]C)

808              85,71                 50
822                 75                 46
826              66,66               51,8
816               87,5                 47
811              77,77                 51
846              73,33               51,8
817              88,88               49,3
827                100               52,8
812              42,85               50,4
857              83,33               54,3
828               87,5               50,0
829              73,43               53,4
834                 60               49,2
818              88,88                 50
830               87,5               52,7
848              81,81               52,7
821                 75               50,3
841              72,72                 51
823               87,5               47,1
844              88,88               48,6

BG = Bandas Geradas; BP= Bandas Polimorficas.

Tabela 2. Agrupamento dos 56 clones de aceroleiras, pelo metodo de
Tocher, com base na dissimilaridade expressa pelo Complemento
Aritmetico do Indice de Jaccard.

Grupos   Clones

I        1 (8/4/1), 2 (8/4/8) e 4 (20/4/5)
II            3 (12/7/3) e 5 (20/6/1)
III           6 (23/7/90) e 8 (26/6/5)
IV            7 (26/6/3) e 9 (26/8/7)
V            10 (38/6/1) e 12 (91/7/9)
VI           11 (38/7/1) e 13 (47/5/2)
VII          14 (51/3/4) e 16 (56/6/5)
VIII         15 (56/3/4) e 17 (56/7/7)
IX           18 (72/3/3) e 20 (71/7/4).
X            19 (72/3/8) e 21 (72/7/4)
XI          22 (79/10/9) e 24 (23/7/16)
XII         23 (79/10/9) e 25 (26/2/12)
XIII        26 (26/2/16) e 28 (87/11/15)
XVI         27 (51/7/16) e 29 (66/7/14)
XV          30 (66/7/15) e 32 (68/1/15)
XVI          31(68/1/14) e 33 (26/5/13)
XVII        34 (51/3/17) e 36 (12/7/15)
XVIII       35 (26/8/14) e 37 (20/4/17)
XIX         38 (56/7/10) e 40 (BRS 152)
XX            39 (C71) e 41 (BRS 235)
XXI         42 (BRS 236) e 44 (BRS 238)
XXII       43 (BRS 237) e 45 (F. Branca)
XXIII       46 (Okinawa) e 48 (Mineira)
XXIV        47 (Barbados) e 49 (II 47/1)
XXV         50 (Camta 40-2) e 52 (BV 7)
XXVI           51(BV1) e 53 (Monami)
XXVII          54 (FP 19) e 56 (C69)
XXVIII                55 (f.t)
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Author:Lima, Eveline Nogueira; de Araujo, Maria Emilia Bezerra; de Magalhaes Bertini, Candida Herminia Camp
Publication:Comunicata Scientiae
Date:Apr 1, 2015
Words:3471
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