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Generalidades del sistema de la coagulacion y pruebas para su estudio.

Overwiew of the Coagulation System and laboratory tests for its study

INTRODUCCION

La hemostasia es un mecanismo de defensa del organismo, necesario para mantener la integridad de la pared vascular, evitar la perdida de sangre ante una lesion vascular y restablecer el flujo sanguineo cuando se ha reparado la lesion. Su funcion involucra a cuatro componentes que actuan de manera localizada, amplificada y modulada, estos son los sistemas: vascular, plaquetario, de coagulacion y fibrinolitico (1).

Ante una lesion vascular, ocurre una vasoconstriccion local a nivel del endotelio, que limita el flujo de sangre a la zona lesionada. Ademas, se exponen a la sangre moleculas adhesivas presentes en el subendotelio como el colageno, el factor von Willebrand y otras proteinas que favorecen la adhesion, activacion y agregacion plaquetaria, con liberacion de diversos mediadores y factores procoagulantes que aseguran la formacion del tapon hemostatico primarios o tapon plaquetario. Adicionalmente, la lesion endotelial provoca la exposicion del factor tisular presente en los fibroblastos del subendotelio, lo que inicia el proceso de coagulacion y lleva a la formacion de la malla de fibrina alrededor del tapon plaquetario, que en conjunto con otros elementos formes de la sangre y proteinas adhesivas, conforman el tapon hemostatico secundario o coagulo de fibrina. En simultaneo, con la formacion de fibrina se inicia la reparacion del tejido lesionado y la liberacion a partir del endotelio de activadores del plasminogeno, lo que inicia la activacion del sistema fibrinolitico con formacion de la plasmina, enzima que limita el crecimiento de la malla de fibrina y restablece el flujo sanguineo una vez que el tapon hemostatico secundario cumple su funcion hemostatica y ocurre la cicatrizacion de la lesion, evitando la formacion de un trombo. Ante un desbalance de cualquiera de los componentes de la hemostasia aumenta el riesgo de manifestaciones hemorragicas o tromboticas (2-4).

En el presente trabajo se presenta una vision detallada y actualizada, del sistema de la coagulacion sanguinea y de las pruebas de laboratorio mas utilizadas para su estudio.

Sistema de la Coagulacion

El sistema de la coagulacion esta integrado por una serie de proteinas plasmaticas, a las que se les asigno un numero romano segun el orden en el cual fueron descubiertas. La mayoria de estas proteinas o factores de la coagulacion, existen bajo condiciones fisiologicas en forma inactiva, como cimogenos, que son convertidos a enzimas activas por ruptura de una o dos uniones peptidicas. Para indicar la forma activa de los factores de la coagulacion se adiciona el sufijo "a" despues del numero romano (5). No obstante, a algunos factores de la coagulacion, entre ellos la precalicreina (PK), tambien llamada Factor Fletcher, y los quininogenos de alto peso molecular (QAPM), no se les asigno ningun numero, mientras que los fosfolipidos plaquetarios, componentes muy importantes del proceso, no estan incluidos en esta clasificacion.

La Tabla I resume el peso molecular, las concentraciones plasmaticas y el tiempo de vida media de los factores de la coagulacion, agrupados en diversas categorias, segun sus caracteristicas bioquimicas y funcionales.

Las proteinas de la coagulacion, segun sus funciones o caracteristicas bioquimicas, se clasifican de la siguiente forma:

Factores de Contacto: representados por los factores XI, XII, PK y QAPM. Inicialmente se relacionaron con la activacion del FXII o Factor

Hageman, por contacto con superficies cargadas negativamente, como el colageno subendotelial que se expone ante una lesion vascular. La deficiencia de alguno de estos componentes se manifiesta por un alargamiento del tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa), sin embargo, su deficiencia in vivo se ha asociado con riesgo de trombosis, lo cual se explica por la participacion de estos factores en la fibrinolisis, al activar al plasminogeno, bien sea de manera directa por accion del FXIIa o indirecta por activacion de la prouroquinasa mediada por la calicreina (4, 6-8).

2) Factores Dependientes de la Vitamina K: son una serie de proteinas que comparten caracteristicas bioquimicas y estructurales especiales. Entre estas, la carboxilacion de los residuos de acido glutamico en el extremo amino terminal a traves de la enzima glutamato-carboxilasa, en una reaccion dependiente de la vitamina K. Como resultado de la carboxilacion estas proteinas poseen en la region amino-terminal un dominio conocido como "Dominio Gla", compuesto por 8 a 12 residuos de acido [gamma]-carboxiglutamico, los cuales favorecen la formacion de complejos enzimaticos por su union a los fosfolipidos de la membrana plaquetaria mediante iones calcio. Otra caracteristica comun de estos factores es que son sintetizados en el higado y que en todos se producen cambios post-transcripcionales como la eliminacion del propeptido senal y el proceso de carboxilacion. Entre estos factores se encuentran el factor II (mejor conocido como protrombina) y los factores VII, IX y X (los dos ultimos tambien llamados Factor Christmas y Factor Stuart-Power, respectivamente) y las proteinas C, S y Z. En casos de deficiencia de vitamina K o de tratamiento con anticoagulantes que actuan como antagonistas de la vitamina K, estos factores son sintetizados, pero carecen de los residuos de acido y-carboxiglutamico, por lo que no son funcionales (9,10).

3) Cofactores: son componentes de los complejos enzimaticos que no poseen actividad catalitica per se, sino que actuan acelerando la velocidad de reaccion de la enzima presente en el complejo, asegurando una eficiencia catalitica adecuada. Entre estos se encuentran los QAPM, los factores V, VIII, la proteina S, la trombomodulina y el factor tisular (6).

4) Cimogenos o Sustratos: estan representados por las proteinas que se sintetizan como proenzimas, que en su mayoria al ser activadas se convierten en proteasas tipo serina, entre estas se encuentra la protrombina que es transformada en trombina. El FXIII y el fibrinogeno representan dos excepciones, debido a que el FXIII al ser activado se convierte en una transglutaminasa plasmatica, el FXIIIa, que cataliza la reaccion de entrecruzamiento de la fibrina; y el fibrinogeno que por accion de la trombina es transformado en fibrina, una proteina estructural sin funcion catalitica (6).

5) Inhibidores: la mayoria de los inhibidores de la coagulacion se asocian a una superfamilia de proteinas denominada serpinas o inhibidores de proteasas de serina, que regulan ademas otros procesos como: angiogenesis, fibrinolisis e inflamacion, entre otros. Uno de sus principales representantes es la antitrombina III (ATIII), que actua junto al heparan sulfato para inhibir a la trombina, asi como a los factores VIIa, IXa, Xa, XIa, XIIa y a la calicreina. El cofactor II de la heparina es otra serpina, que inhibe a la trombina en presencia de heparan o dermatan sulfato. El inhibidor del componente C1 del complemento tambien conocido como inhibidor de la proteina C, es una serpina que inhibe a la trombina, la proteina Ca, la calicreina, los factores XIa y XIIa, y al componente C1 del complemento, de donde proviene su nombre. Finalmente, el inhibidor de proteasas dependiente de la proteina Z (ZPI), es otro representante del grupo de las serpinas que inhibe al FXa en presencia de la proteina Z, fosfolipidos y calcio. El ZPI tambien inhibe al FXIa en ausencia de cofactores.

Adicionalmente, existen otros importantes inhibidores de la coagulacion que no pertenecen al grupo de las serpinas, como el inhibidor tipo "KUNITZ" denominado Inhibidor de la via del factor tisular (TFPI), por las siglas de su nombre en ingles Tisular Factor Pathway Inhibitor, que inhibe al FXa en presencia de la Proteina S y al complejo FXa/FT/FVIIa(11-15). Asi como el sistema formado por la Proteina C/Trombomodulina/Trombina, que inhibe por proteolisis a los factores Va y VIIIa.

Mecanismos propuestos de la Coagulacion Sanguinea

La coagulacion de la sangre es un proceso dinamico que requiere la participacion e interaccion de celulas y proteinas plasmaticas y/o transmembranas, que tiene como funcion, generar la trombina, enzima central del sistema de la coagulacion que tiene como funcion hemostatica central transformar el fibrinogeno enfibrina. Esta polimeriza espontaneamente y junto con el tapon plaquetario, otras proteinas plasmaticas y elementos formes de la sangre, forman el tapon hemostatico secundario o coagulo. Este ademas de evitar la perdida de sangre, forma la matriz provisional para iniciar el proceso de cicatrizacion y regeneracion del vaso sanguineo lesionado.

Teoria clasica: la cascada de la coagulacion

En la decada entre 1960 y 1970, dos grupos propusieron el modelo de la Cascada de la Coagulacion, el cual explica el funcionamiento de este mecanismo como un proceso enzimatico secuencial y limitado, sobre la superficie de las plaquetas, con el cual se favorece la generacion de trombina (16,17). Este modelo se explica a traves de dos vias conocidas como: Intrinseca y Extrinseca.

La via intrinseca se inicia tras un dano vascular, con la exposicion de superficies cargadas negativamente que interaccionan con los factores de contacto (FXII, FXI, PK y QAPM) e inician el proceso de activacion secuencial, donde el FXII funciona como verdadero iniciador, puesto que si bien es una proenzima, posee una pequena actividad catalitica que alcanza para activar a la PK, convirtiendola en calicreina. En segunda instancia la calicreina, potenciada por los QAPM, actua sobre el factor XII para convertirlo en XIIa, una enzima mucho mas eficiente que actua sobre el factor XI para generar FXIa, que en presencia de iones de [Ca.sup.++] activa al FIX. El factor IXa generado junto al FVIIIa, iones [Ca.sup.++] y fosfolipidos conforman el complejo "Tenasa Intrinseco", el cual asegura la eficiencia catalitica para activar al FX a la velocidad requerida en el momento de activarse el proceso de la coagulacion. La via extrinseca se inicia con la formacion del complejo "Tenasa Extrinseco" conformado por el factor tisular (FT), el FVIIa circulante, iones de [Ca.sup.++] y fosfolipidos, el cual activa tanto al FX, como al FIX. Finalmente, en la via comun, convergen las dos vias antes mencionadas, a nivel del FXa que conforma junto con el FVa, la protrombina, iones de [Ca.sup.++] y fosfolipidos, el complejo "Protrombinasa", encargado de generar trombina, la cual actua sobre el fibrinogeno transformandolo en monomeros de fibrina que se polimerizan y se estabilizan por accion del FXIIIa, formando junto con los elementos formes de la sangre, el tapon hemostatico o coagulo (Fig. 1).

El modelo clasico es muy util para describir la interaccion entre las proteinas con actividad procoagulante y para interpretar las pruebas de laboratorio mas utilizadas para la evaluacion de desordenes de la coagulacion. Entre estas pruebas estan el Tiempo de Protrombina (TP), para evaluar la via extrinseca; el Tiempo de Tromboplastina Parcial activado (TTPa) para la via intrinseca y el Tiempo de Trombina (TT), que evalua la via comun (Fig. 1). Sin embargo, este modelo falla en explicar hallazgos in vivo, entre estos; el hecho de que el deficit de algun factor de la via intrinseca prolonga el TTPa, pero no cursa con riesgo hemorragico, o como las deficiencias de los factores VIII y IX, asociadas a la hemofilia A y B, respectivamente, cursan con hemorragias severas, a pesar de no haber alteraciones de la via extrinseca, por la cual tambien se genera trombina. Mas aun, el hecho de que el complejo FT/VIIa actua sobre los factores FX y FIX, condujo a la conclusion que in vivo la via extrinseca seria la mas relevante para iniciar la coagulacion. Asi surgio el modelo actual de este sistema, mejor conocido como el Modelo Celular de la Coagulacion, desarrollado por Hoffman y Monroe (18,19), el cual resalta la importancia de la participacion de diversas celulas, como: fibroblastos, monocitos, celulas endoteliales y plaquetas, que son fundamentales para el funcionamiento del sistema hemostatico en condiciones normales y en diversos estados patologicos.

Modelo Celular de la Coagulacion

Segun este modelo, la coagulacion ocurre en tres fases (Fig. 2). La primera de ellas, denominada Fase de Iniciacion, comienza tras la exposicion del FT, una proteina transmembrana que se expresa constitutivamente en los fibroblastos expuestos luego de una lesion vascular, en celulas musculares lisas y que puede ser inducida en celulas endoteliales, monocitos y macrofagos, entre otros tipos celulares, por accion de diversos estimulos proinflamatorios (20-22). El FT se une al FVII, que circula en pequenas cantidades (cerca del 1 %) en su forma activada, formando junto con iones calcio y fosfolipidos el complejo "Tenasa Extrinseco", que genera mas FVIIa y activa a los factores X y IX. El FXa generado se une sobre una superficie fosfolipidica con su cofactor, el FVa (liberado en su forma activa de los granulos plaquetarios o activado por el FXa u otras enzimas), para producir pequenas cantidades de trombina, que seran insuficientes para completar el proceso de formacion de la fibrina, pero que sirven para estimular la sobreexpresion del FT y activar a las plaquetas y al FV, asi como para disociar al FVIII del Factor von Willebrand y activar al FVIII (23).

Luego, se inicia la Fase de Amplificacion, que es dependiente de la adhesion de las plaquetas al colageno sub-endotelial y su activacion por las trazas de trombina que se forman durante la fase de iniciacion. Las plaquetas activadas experimentan un cambio morfologico, con la subsecuente exposicion de fosfolipidos cargados negativamente y ademas, liberan el contenido de sus granulos, los cuales almacenan sustancias que inician el proceso de la agregacion y por ende, la formacion del tapon hemostatico primario. Mas aun, otros factores procoagulantes, como el FV y el FIX, se liberan de los granulos plaquetarios. Los factores XI, VIII y V son activados por la trombina generada para formar los complejos enzimaticos requeridos en la siguiente fase (25,26).

En la Fase de Propagacion, el FIXa generado en la fase de iniciacion, forma junto con el FVIIIa, sobre una superficie fosfolipidica y en presencia de iones de calcio, el complejo "Tenasa Intrinseco". Este complejo produce grandes cantidades de FXa, el cual a su vez, al unirse al FVa sobre una superficie celular en presencia de iones de calcio, forma el complejo "Protrombinasa" que activa a la protrombina y asegura la generacion de grandes cantidades de trombina, fenomeno denominado "explosion de trombina". Estas cantidades de trombina son suficientes para liberar los fibrinopeptidos A y B de los extremos N-terminales de las cadenas Aa y Bp del fibrinogeno y generar monomeros de fibrina, que luego se polimerizan y entrecruzan por accion del FXIIIa, lo que genera un coagulo de fibrina estable y resistente a una lisis prematura. Una vez cumplida su funcion hemostatica, la generacion de trombina es atenuada y neutralizada por la accion de inhibidores, como: la antitrombina III, el TFPI y el sistema de la Proteina C activada (PCa) (4, 27,28).

El modelo celular de la coagulacion asegura que la hemostasia se localice en el sitio donde ocurre la lesion vascular y que este proceso ocurra sobre superficies celulares esenciales para el ensamblaje de las diversas reacciones enzimaticas que modulan la formacion del coagulo.

Formacion de fibrina

La malla de fibrina es esencial para estabilizar el tapon hemostatico primario o tapon plaquetario. La formacion de fibrina estable depende de la habilidad de la trombina para liberar adecuadamente los fibrinopeptidos A y B de la molecula del fibrinogeno e inducir la formacion del polimero de fibrina, el cual se estabiliza por el FXIII activado por la trombina. El fibrinogeno esta constituido por tres pares de cadenas: dos Aa, dos Bp y dos y, que se enrollan formando una helice alfa. La estructura terciaria del fibrinogeno esta representada por tres dominios: un nodulo central o dominio E, constituido por los extremos N-terminales de las cadenas y dos nodulos laterales o dominios D, formados por los extremos C-terminales (Fig.3). Los fibrinopeptidos A y B ubicados en el dominio central E son ricos en residuos de acido glutamico y acido aspartico que le confieren una alta densidad de cargas negativas inducen la repulsion entre moleculas de fibrinogeno adyacentes. La formacion de fibrina estable depende de la habilidad de la trombina para escindir los enlaces [Arg.sub.16]-[Gly.sub.17] y [Arg.sub.14]-[Gly.sub.15], en los extremos N-terminales de las cadenas Aa y Bp del fibrinogeno y liberar los fibrinopeptidos A y B, respectivamente. Esto causa la perdida de las cargas negativas presentes en los dominios E y favorece la formacion de los monomeros de fibrina que se asocian entre si por uniones electrostaticas debiles, para formar los polimeros de fibrina, que se estabilizan por el FXIII activado (29).

El FXIII es activado por la trombina en presencia del fibrinogeno, que sirve de cofactor, y de iones de calcio. El FXIIIa actua como una transglutaminasa al inducir la formacion de enlaces covalentes entre: las cadenas a de moleculas de fibrina adyacentes formando los polimeros a; entre las cadenas [gamma] formando los dimeros [gamma]; y entre las cadenas a y [gamma] formando los heteropolimeros [alfa]/[gamma], lo que origina una estructura de fibrina estable y resistente a la lisis prematura por la plasmina. Ademas, el FXIIIa entrecruza a las cadenas [alfa] de la fibrina con la [alfa]2-antiplasmina, principal inhibidor de la plasmina y con la fibronectina, una proteina adhesiva importante, que actua como cofactor de la fibrina, en el proceso de cicatrizacion del tejido lesionado. Las cadenas [gamma] de la fibrina tambien se entrecruzan con la integrina plaquetaria [alfa]IIb[beta]3 lo que favorece la retraccion del coagulo (29).

Funciones de la Trombina

La trombina tiene numerosas funciones dentro de la hemostasia, las cuales pueden ser clasificadas como: procoagulantes, anticoagulantes, profibrinoliticas y antifibrinoliticas (Fig. 4). Esta enzima posee tambien una gran cantidad de efectos pleiotropicos sobre una gran variedad de celulas, tales como: celulas endoteliales, monocitos, fibroblastos, celulas de musculo liso, etc. Estos efectos celulares son mediados por la activacion de los receptores PARs e incluyen entre otros, efectos quimiotacticos directos, regulacion de la expresion genetica, secrecion de citoquinas y otros mediadores bioquimicos de interes para el proceso de la hemostasia (21, 29, 30). En esta revision se han enfocado unicamente los efectos de la trombina sobre la hemostasia. Los efectos procoagulantes de la trombina incluyen la conversion del fibrinogeno en fibrina, asi como la activacion de los factores X, XI y XIII y de los cofactores V y VIII. La trombina tambien induce la agregacion plaquetaria, por su accion sobre los receptores [PAR.sub.1] y [PAR.sub.4]. Estos efectos procoagulantes representan un sistema de retroalimentacion positiva que favorece la generacion de mas trombina (27, 31-33).

Por otra parte, la principal funcion anticoagulante de la trombina ocurre, tras su union a un receptor de membrana presente en las celulas endoteliales, la trombomodulina (TM), para formar el complejo trombina-TM. Cuando la trombina se une a la TM, ocurre un cambio en su conformacion, que frena su accion sobre el fibrinogeno y las plaquetas y facilita su accion sobre la Proteina C, la cual en su forma activa, en presencia de la Proteina S, regula negativamente el sistema de la coagulacion por degradacion de los cofactores FVa y FVIIIa (34). Esto se explica con mas detalle en la seccion correspondiente a Inhibicion de la coagulacion. Otra funcion anticoagulante de la trombina es disminuir la union del Factor von Willebrand (FvW) a la glicoproteina Ib (GPIb) de las plaquetas (35).

La accion profibrinolitica de la trombina consiste en inducir la secrecion del activador de plasminogeno tisular (t-PA) por las celulas endoteliales (36), mientras que su principal efecto antifibrinolitico viene dado por la activacion del Inhibidor de la Fibrinolisis Activable por Trombina (TAFI, por las siglas de su nombre en ingles thrombin-activable fibrinolysis inhibitor). El TAFI activado modula negativamente la fibrinolisis al remover residuos de lisina expuestos en la fibrina, parcialmente degradada por la plasmina, los cuales son requeridos para la formacion del complejo Fibrina/Plasminogeno/tPA, lo que asegura que la fibrinolisis ocurra a una velocidad adecuada y de manera localizada (4, 28, 37).

Inhibicion de la Coagulacion

El sistema de la coagulacion en condiciones normales es finamente regulado por diversos mecanismos que aseguran que la generacion de trombina y la posterior formacion de la fibrina, sean procesos localizados. Bajo condiciones fisiologicas, el mantenimiento del flujo sanguineo adecuado y la actividad anticoagulante del endotelio vascular, limitan la acumulacion local de factores de la coagulacion activados y la formacion de los complejos procoagulantes, evitando asi que se active el sistema de la coagulacion y ocurra la oclusion de algun vaso sanguineo (38).

Entre los mecanismos anticoagulantes naturales, el mas importante es el constituido por la Antitrombina III (ATIII), una glicoproteina plasmatica perteneciente a la familia de las serpinas (Fig.5). La ATIII inhibe a la trombina y al FXa y en menor extension tambien a los factores FIXa, FXIa, calicreina, plasmina y uroquinasa, entre otras proteasas de la hemostasia. El mecanismo de inhibicion involucra la formacion de un complejo estable 1:1 entre la ATIII y la proteasa blanco. La velocidad de inhibicion es incrementada en presencia de glicosaminoglicanos, tales como las moleculas de heparan sulfato presentes en la superficie de las celulas endoteliales, o la heparina usada frecuentemente como anticoagulante. La ATIII posee un dominio de union a la heparina, que se fija especificamente a una secuencia pentasacarida presente en esta molecula, lo que induce un cambio conformacional en la ATIII, que acelera la inhibicion del FXa. Sin embargo, la inhibicion de la trombina requiere que la ATIII se una tanto a la heparina como a la trombina, para formar un complejo ternario. La secuencia de eventos propuesta, describe que primero la ATIII interacciona con el dominio pentasacarido y luego, la trombina se une a la heparina; de esta manera, la orientacion de estas moleculas en el complejo, favorece la inhibicion de la trombina por la formacion de un complejo enzima-inhibidor irreversible y muy estable, el cual sera finalmente removido de la circulacion (38-41).

Otro de los mecanismos anticoagulantes que controlan la coagulacion sanguinea es el Sistema de la Proteina C, el cual se inicia por la formacion del complejo Trombina/TM a nivel de las celulas endoteliales. En este complejo, la trombina pierde la mayoria de sus funciones procoagulantes y asume funciones anticoagulantes al activar a la Proteina C (PC) a Proteina C activada (PCa), en una reaccion que se incrementa en presencia del receptor endotelial de la PC (EPCR; por las siglas de su nombre en ingles Endothelial cell Protein C Receptor) (42,43). Una vez que la PCa se disocia del EPCR, se une a la proteina S y este complejo "PCa-PS" inactiva por proteolisis, a las formas activadas (unidas a la membrana) de los cofactores V y VIII, mientras que tiene poco efecto sobre los cofactores nativos circulantes. En el caso del FVIIIa, su inactivacion aumenta en presencia del FVa (44). En pacientes con deficiencia de PC o con resistencia a la PCa, como en los casos de Factor V Leiden, una mutacion en el FV, que lo hace resistente a la proteolisis por la PCa, se ha observado un incremento en el riesgo de sufrir trombosis (45). Ademas, la union de la trombina a la TM hace que esta proteasa sea mas sensible a la inhibicion por la ATIII, en comparacion con la trombina libre. La PCa tambien tiene una importante funcion en los procesos inflamatorios y en la fibrinolisis (4, 46).

La fase de iniciacion del proceso de la coagulacion se encuentra regulada por el Inhibidor de la via del factor tisular (TFPI), el cual se sintetiza principalmente en las celulas endoteliales y circula unido a lipoproteinas que incluyen las LDL, las HDL y la Lp(a) (47). El TFPI bloquea al complejo FT/ FVIIa inmediatamente despues que se genera FXa, formando un complejo cuaternario TFPI/FXa/FT/ FVIIa. Inicialmente, el TFPI se une al FXa y lo inhibe de manera reversible en un proceso que no requiere de Ca++, sin embargo, en presencia de superficies fosfolipidicas, este ion potencia la inhibicion del FXa por el TPFI. Posteriormente, el complejo TFPI/FXa se une al complejo FT/FVIIa en un proceso dependiente de [Ca.sup.++], formando el complejo cuaternario inactivo TFPI/FXa/FT/FVIIa (48-50). La proteina S tambien muestra actividad anticoagulante en ausencia de PCa por varios mecanismos, uno de ellos es facilitando la interaccion FXa-TFPI.

Pruebas de Coagulacion

Las pruebas de coagulacion son ensayos funcionales que tienen como objetivo replicar in vitro la activacion del sistema de la coagulacion y evaluar la funcionalidad del mismo, lo que permite fundamentar y orientar el diagnostico clinico. Las pruebas clasicas son: el Tiempo de Tromboplastina Parcial activado (TTPa) que evalua la via intrinseca; el Tiempo de Protrombina (TP) el cual evalua la via extrinseca y el Tiempo de Trombina (TT) que evalua la via comun. Estas pruebas de laboratorio son utiles para detectar deficiencias congenitas o adquiridas de factores de la coagulacion, de alli que se usen para estudiar pacientes con manifestaciones hemorragicas. En contraste, la deficiencia congenita de la mayoria de las proteinas anticoagulantes como ATIII, PC y PS esta asociada a la aparicion de un estado de hipercoagulabilidad, protrombotico o trombofilico, sin embargo, en estos casos no se observan alteraciones en las pruebas clasicas, por lo que estas no se emplean en el estudio de pacientes con trombofilias primarias (51-54).

Las pruebas para evaluar la coagulacion emplean plasma fresco citratado, el cual debe ser procesado lo mas rapidamente posible y mantenerse en frio, sin ser expuesto a contacto directo con hielo. Para la obtencion de plasma citratado se extrae sangre por puncion venosa, de voluntarios aparentemente sanos, con agujas de 21 G. La sangre se mezcla suavemente en tubos de plastico con citrato de sodio al 3,8% en una proporcion 1:9 e inmediatamente se centrifuga a 4[grados]C a 1400 g durante 15 o 20 minutos para obtener Plasma Pobre en Plaquetas (PPP). Las pruebas se deben realizar lo mas rapido posible, sobre todo si se evaluan factores labiles como el FVIII o FV. Los plasmas no deben almacenarse por mas de dos semanas a -20[grados]C o de 6 meses a -70[grados]C (55-56).

Los resultados obtenidos en las diversas pruebas de coagulacion de una muestra de plasma en estudio, se comparan con los tiempos de coagulacion obtenidos con un plasma control, el cual se prepara mezclando el plasma de al menos tres personas aparentemente sanas, cuyos tiempos de coagulacion individuales esten dentro de los valores normales establecidos por cada laboratorio. Los ensayos con ambas muestras se deben realizar en paralelo y por el mismo operador. La sensibilidad de estas pruebas esta vinculada al reactivo y a la tecnica utilizada, de alli que es importante establecer los rangos de referencia de cada laboratorio e indicar la fuente de los reactivos empleados (55-56).

Cuando el tiempo de coagulacion de la muestra en estudio es muy prologado debe realizarse la correccion con plasma control, es decir, mezclar plasma del paciente con plasma control en una proporcion 1:1. Si la alteracion en el tiempo de coagulacion se corrige, se esta ante la deficiencia de algun factor de la coagulacion, mas si no se corrige, se esta ante la posible presencia de algun inhibidor.

Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa)

El TTPa evalua el funcionamiento de la via intrinseca de la coagulacion y emplea como activadores acido elagico, celite, silica o caolin, en presencia de fosfolipidos. Esta prueba detecta la deficiencia de los factores VIII, IX, XI y XII. Adicionalmente, el TTPa se prolonga por deficiencia de los factores de la via comun como V, X, II y el fibrinogeno en menor grado. El TT Pa no se altera cuando las deficiencias de los factores son moderadas (>40%). Esta prueba tambien es muy util para evaluar el tratamiento con anticoagulantes no orales tipo heparina y para rastrear el anticoagulante lupico (56,57).

El TTPa tambien resulta prolongado ante la deficiencia de los factores que intervienen en la fase de contacto, como la precalicreina o los QAPM, a menos que la prueba utilice un reactivo que contenga acido elagico como activador. En ese caso, esta prueba sera normal, incluso ante la ausencia total de dichos factores (57).

Entre los metodos reportados para medir el TTPa estan:

a) Tiempo de Tromboplastina con cefalina: Este metodo fue descrito inicialmente por Langdell y col. en 1953 (58). El procedimiento es el siguiente: Se incuban 0,1 mL de PPP fresco citratado del paciente o del control y 0,1 mL de solucion de cefalina a 37[grados]C durante el tiempo recomendado por el fabricante de este reactivo, luego se agregan 0,1 mL de Ca[Cl.sub.2] 25 mM preincubado a 37[grados]C y se determina el tiempo de coagulacion.

b) Tiempo de Tromboplastina con caolin: tiene como finalidad unificar la activacion por contacto, teniendo en cuenta que los tiempos de incubacion cortos son mas sensibles para detectar defectos de los factores de contacto. En este metodo descrito por Proctor y Rapaport en 1961 (59), se sigue el procedimiento siguiente: 0,1 mL de PPP fresco citratado se incuba a 37[grados]C; luego se agregan 0,1 mL de una mezcla de caolin (5%) y cefalina (1/10), se mantiene a 37[grados]C, finalmente se agrega 0,1 mL de Ca[Cl.sub.2] 25 mM, se mezcla y se determina el tiempo de coagulacion. Este metodo es sensible para seguir tratamientos con anticoagulantes (cumarinicos o heparina) y para evaluar los niveles de los factores de la via intrinseca, pero no para diagnosticar deficiencias de fibrinogeno y protrombina (55).

Tiempo de protrombina (TP)

El TP evalua el funcionamiento de la via extrinseca de la coagulacion. Esta prueba mide el tiempo de formacion de un coagulo en presencia de un exceso de factor tisular (FT), representado por la tromboplastina o una mezcla comercial que contiene FT recombinante o de origen tisular, con diferente composicion de fosfolipidos y cuya heterogeneidad determina diferentes respuestas ante la disminucion en los niveles de algun factor. Es una prueba empleada para la evaluacion prequirurgica, para el seguimiento de pacientes con hepatopatias o con deficiencias de factores de la coagulacion. Ademas, es muy usada para evaluar la terapia anticoagulante con cumarinicos, para lo cual se debe determinar el Indice de Sensibilidad Internacional (ISI) de la tromboplastina a emplear para poder unificar los resultados. El fabricante de la tromboplastina calcula el valor ISI comparado con una tromboplastina de origen humano estandar internacional a la cual se le asigna un ISI de 1,0; lo que garantiza compensar las distintas sensibilidades de los reactivos disponibles en el mercado (55, 60).

El TP en una etapa reportado por Arocha Pinango y col. (60), fue modificado del metodo originalmente descrito por Quick en 1935 (61) y es sensible para determinar la deficiencia de los factores VII, X, V y en menor medida las deficiencias de protrombina. Sin embargo, no detecta deficiencias de fibrinogeno, incluso cuando estas son moderadas.

Para realizar el TP se aplica el siguiente procedimiento: se mezclan 0,1 mL de PPP fresco citratado con 0,1 mL de tromboplastina tisular y 0,1 mL de Ca[Cl.sub.2] 25 mM (estos ultimos preincubados a 37[grados]C), se agita y se determina el tiempo de coagulacion. Las variaciones entre los duplicados no deben ser mayores a 0,5 seg en tiempos cortos y no mas de 2 a 3 seg en tiempos mayores a 30 seg. Los resultados deben expresarse como la relacion o cociente entre el tiempo de coagulacion obtenido con el plasma del paciente y el plasma control (60).

En pacientes tratados con cumarinicos, el resultado debe expresarse como INR o International Normalized Ratio, en espanol Razon Internacional Normalizada, que se obtiene elevando la relacion (r) obtenida entre el paciente y el control al ISI (INR= r [sup.ISI]), lo que permite comparar los resultados obtenidos con diferentes tromboplastinas comerciales. La OMS recomienda emplear tromboplastinas con un ISI menor a 2,5. El valor del INR tomado como rango terapeutico depende de la patologia que motive el tratamiento (60).

Tiempo de trombina (TT)

El TT mide el tiempo de formacion de fibrina a partir del fibrinogeno presente en el plasma, en presencia de una cantidad estandarizada de trombina. Esta prueba es muy util para determinar la presencia de fibrinogenos anormales (disfibrinogenemias) o bajos niveles de fibrinogeno circulante (hipofibrinogenemias); tambien da tiempos prolongados en cuadros de coagulacion intravascular diseminada, asi como tambien en presencia de heparina, en hiperfibrinolisis primaria y en presencia de productos de degradacion de fibrinogeno/fibrina (56, 62).

Para el ensayo, inicialmente se debe preparar una solucion de trombina estandar entre 2-3 UI/ mL, que debe dar un tiempo de coagulacion con un plasma control entre 18 y 22 seg. Con tiempos de coagulacion menores a 15 seg debe hacerse una mayor dilucion de la trombina (54). En general, se aplica el siguiente procedimiento: se mezclan 0,1 mL de PPP fresco citratado y 0,1 mL de la solucion de trombina y se determina el tiempo de coagulacion a 37[grados]C.

Tiempo de reptilasa (TR)

Es una prueba especial que emplea la reptilasa, una enzima similar a la trombina obtenida del veneno de la serpiente Bothrops atrox, que actua directamente sobre las cadenas [alfa] del fibrinogeno lo que libera el fibrinopeptido A, sin que su accion sea inhibida por la antitrombina, por lo que esta prueba no es afectada por la presencia de heparina. Si el TT esta prolongado y el TR es normal, probablemente el plasma evaluado contiene heparina. Si ambos tiempos dan prolongados, pero en mayor proporcion el TT, debe sospecharse de la presencia de productos de degradacion del fibrinogeno/fibrina. En casos de disfibrinogenemias, esta prueba es mas sensible que el TT.

Los valores de TR normales deben encontrarse similares a los obtenidos con una muestra de plasma control, con diferencias dentro de los 3 seg, de alli que deben informarse los valores obtenidos con el plasma del paciente y con el plasma control. La prueba se realiza de manera similar al TT, ajustando el TR del control entre 15 y 18 seg (56).

Tiempo de coagulacion por ecarina (ECT)

El ECT (por las siglas de su nombre en ingles Ecarin Clotting Time) es una prueba de coagulacion basada en la activacion de la protrombina por accion de la ecarina, una enzima aislada del veneno de la serpiente Echis carinatus, generando meizotrombina, un precursor cataliticamente activo de la trombina capaz de transformar el fibrinogeno en fibrina (63).

Esta prueba de coagulacion, descrita originalmente por Nowak y Bucha en 1993 (64), exhibe una correlacion lineal entre la concentracion de inhibidores directos de trombina presentes en el plasma y su tiempo de coagulacion. Por esta caracteristica favorable en comparacion a los metodos descritos anteriormente, el ECT ha sido ampliamente usado en la caracterizacion bioquimica y farmacologica de inhibidores directos de trombina y para controlar los niveles de estos compuestos en la terapia anticoagulante (65-68).

Lopez y Nowak en el ano 2008 (68) describieron una modificacion a este metodo que permite cuantificar inhibidores directos de trombina en sangre. Para ello se prepara una solucion de ecarina a una concentracion final de 1 U/mL en tampon Tris/HCl 50 mM pH 7,5 con NaCl 0,154 M y Ca[Cl.sub.2] 10 mM, que se preincuba por 5 min a 37[grados]C. Para determinar el ECT, se incuban 0,1 mL de sangre citratada con 0,1 mL de la solucion de ecarina, se agita y se determina el tiempo de coagulacion. La concentracion del inhibidor se determina por comparacion con una curva de calibracion realizada usando concentraciones conocidas del compuesto en estudio.

Determinacion de factores de la coagulacion

La cuantificacion de un factor especifico del sistema de la coagulacion se puede realizar por medio de la evaluacion de su actividad funcional por metodos cromogenicos o mas comunmente, por algun metodo coagulante antes mencionado. Tambien, se puede evaluar el nivel de proteina circulante por metodos inmunologicos como: ELISA, pruebas de aglutinacion, inmunoelectroforesis, entre otros.

Metodos cromogenicos

Estos metodos evaluan la actividad enzimatica del factor en estudio, por medio del uso de sustratos cromogenicos. Estos sustratos son peptidos sinteticos cuya secuencia de aminoacidos es similar a la que precede al sitio de corte del sustrato natural de la enzima en estudio, a la cual se le ha acoplado un cromoforo como la paranitroanilina (pNA). Cuando la enzima escinde el enlace amida libera el cromoforo que puede ser detectado por cambios en la absorbancia a una determinada longitud de onda, en el caso de la pNA, se detecta a 405 nm. Los sustratos cromogenicos muestran una alta selectividad por las enzimas que los activan. Existen diversos sustratos cromogenicos para los distintos factores activados del sistema de la coagulacion y de la fibrinolisis y se pueden elaborar curvas de calibracion empleando estandares comerciales. Los sustratos cromogenicos son utilizados tambien para evaluar algunas sustancias terapeuticas, como niveles de heparina no fraccionada y de bajo peso molecular (69). Estos ensayos requieren un volumen de muestra bajo, lo que facilita el estudio en pacientes pediatricos.

Los sustratos cromogenicos tambien permiten detectar la presencia de inhibidores de factores de la coagulacion de manera indirecta y evaluar su actividad funcional. En el caso de la ATIII, esta prueba se basa en la funcion antitrombinica de este inhibidor en presencia de heparina (70,71). La ATIII presente en el plasma en estudio se pone en contacto con una cantidad fija y en exceso de trombina en un tampon heparinizado. Una parte de la trombina en el medio se neutraliza por la ATIII presente en el plasma en estudio y la cantidad residual de trombina se determina por medio de su actividad amidolitica sobre un sustrato cromogenico especifico. La concentracion de ATIII se determina a partir de una curva de calibracion empleando estandares comerciales o diluciones de un plasma control en tampon heparinizado (71).

La Proteina C puede ser dosificada por el metodo cromogenico descrito por Bertina y col. en 1984 (72), que consiste en adsorber la PC con hidroxido de aluminio, luego activar esta proteina con trombina y medir la actividad de la PCa generada con un sustrato cromogenico. Brevemente, se mezclan 0,4 mL de plasma pobre en plaquetas con 40 [my]L de una suspension acuosa de Al[(OH).sub.3] a temperatura ambiente y se agita por 15 minutos; luego se centrifuga a 4[grados]C por 15 minutos a 3000 g y se descarta el sobrenadante. Al precipitado se le agrega 0,2 mL de tampon citrato trisodico (0,313 %; pH 7,4) y se agita durante 15 minutos, luego se agrega 40 [my]L de una solucion de trombina (20 UI/ mL en agua destilada) y se incuba por 1 h a 37[grados]C con agitacion continua. Al cabo de este tiempo, la trombina se neutraliza con 100 [my]L de heparina a 25 UI/mL en NaCl 0,15 M y se incuba por 15 minutos mas y luego se centrifuga a 3000 g por 5 minutos a 4[grados]C. Finalmente, se toma 50 pL del sobrenadante y se le agrega 50 pL de sustrato cromogenico S-2366 (1 mg/mL en agua destilada), se mezcla e incuba por 20 minutos a 37[grados]C, luego se detiene la reaccion agregando 200 [my]L de acido acetico glacial y se determina la densidad optica a 405 nm. Para determinar la actividad de la PC en la muestra del paciente, se emplea una curva de calibracion que se realiza con un plasma control a diferentes diluciones. Las determinaciones deben realizarse por triplicado.

Metodos Coagulantes

La actividad coagulante para determinar la concentracion de factores de la coagulacion se realiza generalmente por el metodo en una etapa, el cual es rapido, sencillo y cuyos resultados muestran una buena correlacion con la clinica y la respuesta a tratamientos.

En el caso de deficiencia en algun factor de la via de intrinseca o la presencia de algun inhibidor de estos, se emplea el TTPa. Para la cuantificacion se emplea un plasma deficiente del factor en estudio, el cual aporta la actividad coagulante de los demas factores. Por ejemplo, en el caso de pacientes donde se sospeche la presencia de una patologia como la hemofilia, se emplea un plasma deficiente de FVIII, un plasma control a diferentes diluciones en tampon imidazol salino, pH 7,4, por ejemplo: 1/2, 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/200, una mezcla de cefalina-caolin o "cefalina activada", una solucion de cloruro de calcio y el plasma en estudio. El procedimiento es el siguiente: se incuban 0,1 mL del plasma deficiente de FVIII con 0,1 mL de la dilucion del plasma en estudio o de las diferentes diluciones del plasma control y 0,1 mL del reactivo de cefalina activada, se incuba por 3 min a 37[grados]C. Posteriormente, se agregan 0,1 mL de Ca[Cl.sub.2] 25 mM, se mezcla suavemente y se determina el tiempo de formacion del coagulo. Las determinaciones se realizan por duplicado y la concentracion del factor en el plasma en estudio se calcula extrapolando su tiempo de coagulacion a una curva estandar realizada con el tiempo de coagulacion de las diferentes diluciones del plasma control (73,74).

La cuantificacion de los inhibidores, por ejemplo del FVIII, se realiza mediante la prueba Bethesda, en la cual, se incuba el plasma en estudio con plasma control a una relacion 1:1 y luego de 2 h a 37[grados]C se determina la actividad residual del FVIII en la mezcla. Paralelamente, se incuba un control consistente de plasma control diluido con tampon de coagulacion para considerar el deterioro del FVIII durante el tiempo de incubacion. La diferencia entre ambas muestras, tomando en cuenta el factor de dilucion, se utiliza para calcular las unidades del inhibidor. El porcentaje de FVIII residual (FVIIIR) se expresa en Unidad Bethesda (UB), que se calcula con la siguiente formula:

% FVIIIR = [FVIII.sub.Mezcla plasma paciente-Plasma control]/[FVIII.sub.Plasma control incubado con tampon] x 100

El plasma del paciente que presenta una actividad residual del FVIII de 50% equivale a una UB de inhibidor (75).

En el caso de deficiencia en algun factor de la via de extrinseca, se emplea el TP en una etapa, el cual utiliza tromboplastina como fuente de factor tisular. Para la cuantificacion se emplea un plasma deficiente del factor en estudio, el cual aporta la actividad coagulante de los demas factores, por ejemplo; para la determinacion de protrombina, se emplea plasma deficiente en este factor, diluciones del plasma control y del plasma en estudio con tampon imidazol salino, pH 7,4; tromboplastina y solucion de cloruro de calcio. El procedimiento que se emplea es el siguiente: se incuban 0,1 mL del plasma deficiente de protrombina, 0,1 mL de la dilucion del plasma en estudio o del plasma control y 0,1 mL de tromboplastin^ se incuba por 1 min a

37[grados]C. Posteriormente, se anaden 0,1 mL de Ca[Cl.sub.2] 25 mM, se mezcla suavemente y se determina el tiempo de formacion del coagulo. Los ensayos se realizan por duplicado y la concentracion del factor en la muestra problema se calcula extrapolando el tiempo de coagulacion del plasma en estudio en una curva estandar realizada con el plasma control (76,77).

Determinacion de fibrinogeno

El nivel de fibrinogeno circulante en plasma se puede determinar por varios metodos, entre estos: el metodo gravimetrico, el metodo coagulante de Clauss y el metodo derivado del Tiempo de Protrombina empleado ampliamente en equipos automatizados, asi como por metodos turbidimetricos e inmunologicos (78).

El metodo gravimetrico descrito por Ingram (79), se basa en la conversion de fibrinogeno en fibrina mediante una solucion de trombina/calcio. Una vez que el coagulo se ha formado se seca, se pesa y se deduce la concentracion de fibrinogeno segun el peso del coagulo y el volumen del plasma utilizado. El procedimiento empleado es el siguiente: se mezclan 0,5 mL de plasma y 0,5 mL de una solucion de trombina/calcio (2,5 UI de trombina/mL Ca[Cl.sub.2] 25 mM), luego, se coloca dentro un aplicador de madera o vidrio y se incuba en bano de Maria a 37[grados]C, por 30 min. El coagulo formado se enrolla sobre el aplicador y se incuba por 15 min adicionales a 37[grados]C; luego se lava con agua destilada durante 30 min, se desprende del aplicador y se coloca en acetona por 10 min. Posteriormente, el coagulo se coloca en una estufa a 37[grados]C durante 24 h y finalmente, se pesa en una balanza de precision analitica. La concentracion de fibrinogeno se determina aplicando la formula:

Concentracion de Fibrinogeno(mg/L) = [Peso del coagulo(mg)/0,5 x 1000

El metodo coagulante de Clauss (80) se fundamenta en la coagulacion del plasma en estudio, con un exceso de trombina, lo que asegura que la concentracion de fibrinogeno es el unico factor limitante del tiempo de coagulacion observado. Es un metodo donde el tiempo de coagulacion es inversamente proporcional a la concentracion del fibrinogeno funcional en el plasma en estudio. En caso de muestras con elevadas concentraciones de fibrinogeno, los tiempos de coagulacion son muy cortos, por lo que deben hacerse diluciones de la muestra problema. La determinacion de fibrinogeno se realiza por medio de curvas de calibracion con un fibrinogeno de referencia y los valores se reportan en mg/dL.

Los metodos turbidimetricos miden la cantidad de fibrinogeno que precipita por accion de sales como sulfato de amonio y su concentracion se determina a una longitud de onda determinada, tras comparar con el grado de turbidez producida por un patron de fibrinogeno de concentracion conocida tratado en iguales condiciones que el plasma. Por otra parte, en los metodos inmunologicos se detectan determinantes antigenicos en presencia de anticuerpos antifibrinogeno mediante inmunoelectroforesis o ELISA (78).

Actualmente, una de las metodologias disponibles y frecuentemente empleada es el metodo derivado del tiempo de protrombina, este no mide directamente la concentracion de fibrinogeno, la calcula a traves de una curva de coagulacion a partir del TP en coagulometros fotoopticos. No obstante, diferentes estudios han demostrado que sus resultados varian ampliamente segun los analizadores y reactivos, por lo que se observan discrepancias con otros ensayos empleados para determinar la concentracion de fibrinogeno (78, 81,82).

Determinacion de factor XIII

El polimero de fibrina formado por accion de la trombina sobre el fibrinogeno, es entrecruzado por accion del factor XIIIa o transglutaminasa plasmatica. El Factor XIIIa introduce enlaces covalentes entre los grupos e-amina y g-glutamina de determinados aminoacidos en las cadenas a y g de los monomeros de fibrina. La prueba clasica que permite medir la actividad funcional del FXIIIa se fundamenta en la solubilidad de coagulos de fibrina en soluciones de acidos mono o tricloroacetico al 1% o en solucion de urea 5 M. Sin embargo, esta prueba resulta anormal solo con niveles inferiores al 2 o 3% de la proteina, donde aparecen manifestaciones clinicas hemorragicas. Esta prueba se realiza induciendo la coagulacion del plasma en estudio, con una solucion de cloruro de calcio al 25 mM. El coagulo formado se deja estabilizar por 30 min a 37[grados]C y luego se coloca en una solucion de urea 5 M o acido mono o tricloroacetico al 1%. Se observa durante 24 h para evaluar si hay disolucion. La prueba se considera normal cuando el coagulo no se disuelve en este tiempo (83).

Existen otros metodos cuantitativos para determinar la actividad funcional del FXIII, que se fundamentan en la incorporacion de aminas flourescentes a sustratos como la caseina, asi como metodos basados en la liberacion del amonio producido en la reaccion de transglutaminacion inducida por el FXIIIa. Es importante resaltar que cada laboratorio debe tener los valores de referencia normales para cada grupo poblacional, segun el metodo de estudio empleado (84).

Ensayos de generacion de trombina:

Estos ensayos miden la capacidad del plasma de generar trombina luego de que el proceso de coagulacion sea activado por el FT o algun otro activador. Dado que la trombina es el mayor efector del proceso de coagulacion, los ensayos de generacion de trombina muestran mayor potencial para evaluar la tendencia de un individuo a desarrollar eventos tromboticos o hemorragicos.

Los principales ensayos de generacion de trombina descritos hasta el momento son los siguientes:

a) Trombografia calibrada automatica: En un inicio, la generacion de trombina inducida por FT era determinada en muestras de PPP, usando un sustrato cromogenico (85). Este ensayo requeria la remocion del fibrinogeno del plasma, lo que lo hacia un sistema muy distinto al proceso fisiologico de la coagulacion. La sustitucion del sustrato cromogenico por un sustrato fluorescente, cuya senal no es afectada por la turbidez del plasma, permitio la determinacion continua de generacion de trombina en plasma rico en plaquetas (PRP). En este ensayo, la concentracion de trombina puede ser calculada a partir de curvas de calibracion. Sin embargo, este metodo tiene la desventaja que la senal fluorescente generada por escision del sustrato no es lineal a la concentracion del producto, debido al llamado "efecto de filtro interno" del sustrato fluorescente. Para compensar esto, se desarrollo el trombograma automatizado calibrado (CAT por Calibrated Automated Thrombography) que compara continuamente la senal de muestras experimentales a una actividad de trombina conocida (86). Las curvas de generacion de trombina pueden ser descritas en terminos de tiempo de latencia, tiempo para llegar al pico, altura del pico y area bajo la curva; este ultimo parametro define el Potencial endogeno de trombina (ETP por endogenous thrombin potential). En contraste con el TP, TTPa, TT, que solo evaluan la fase inicial de la coagulacion (pues solo son necesarias trazas de trombina para inducir la coagulacion de un plasma), estos ensayos de generacion de trombina evaluan tambien las fases de amplificacion y propagacion, asi como la inhibicion de la trombina por las diferentes vias anticoagulantes. Recientemente, este metodo fue adaptado para medir generacion de trombina en muestras de sangre total (87).

b) THROGA (por THROmbin Generation Assay): Es un metodo que se basa en inducir la coagulacion por activadores de la via extrinseca e intrinseca en una muestra de sangre o plasma citratado que contiene una cantidad definida de hirudina. Dado que la trombina formada se unira a la hirudina formando un complejo con estequiometria de 1:1, es posible calcular las unidades de trombina generadas en funcion de las unidades de hirudina consumidas en la muestra activada, es decir, al determinar la diferencia de hirudina libre remanente en la muestra estudiada, en comparacion con una muestra control preparada en las mismas condiciones pero donde no se indujo el proceso de coagulacion (88). Para esto, se debe emplear un metodo que permita la determinacion precisa de hirudina en muestras de sangre y plasma, como el ECT, descrito anteriormente (64).

En conclusion, es importante resaltar la importancia actual de ambos modelos; la cascada de la coagulacion que facilita la interpretacion in vitro de las pruebas de laboratorio mas utilizadas para orientar y fundamentar el diagnostico clinico, asi como, el modelo celular que explica el proceso fisiologico in vivo, donde interactuan ademas de los factores solubles, diversas celulas y mecanismos reguladores altamente eficientes, que garantizan que la coagulacion sea un proceso localizado y bien controlado. Finalmente, el uso de las diferentes pruebas de coagulacion y de metodos mas sofisticados y completos como los cromogenicos y los ensayos de generacion de trombina, permiten establecer deficiencias de factores de la coagulacion especificos, asi como la existencia de alguna anormalidad en el sistema de la coagulacion que incremente la tendencia a sufrir eventos tromboticos o hemorragicos. El oportuno analisis del sistema de la coagulacion de un individuo permitira tomar medidas preventivas o correctivas, segun cada caso particular.

AGRADECIMIENTO

Los autores expresan su gratitud al Lic. Jesus Valero por su colaboracion en la preparacion de las figuras de este trabajo.

Recibido: 02-10-2014 Aceptado: 29-01-2015

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Belsy Guerrero [1] y Mercedes Lopez [2]

[1] Laboratorio de Fisiopatologia, Seccion Coagulacion, Centro de Medicina Experimental y [2] Laboratorio de Hemostasia y Genetica Vascular. Centro de Biofisica y Bioquimica. Instituto Venezolano de Investigaciones Cientificas. Caracas, Venezuela.

Autor de Correspondencia: Mercedes Lopez. Instituto Venezolano de Investigaciones Cientificas. Carretera Panamericana Km11. Centro de Biofisica y Bioquimica. Lab. de Hemostasia y Genetica Vascular. 1020a Caracas, Venezuela Tel: +58-212-504-1218/1903. Correo Electronico: melopez73@hotmail.com

Leyenda: Fig. 1. Cascada de la coagulacion. Consiste en la confluencia de la via extrinseca e intrinseca en una via comun. El TP se usa como ensayo para evaluar la actividad de la via extrinseca, el TTPa para la via intrinseca y para la via comun se emplean el TT, TR y ECT. Los factores de la coagulacion aparecen representados por numeros romanos, para indicar su forma activa se les adiciona el sufijo "a".

TP, Tiempo de Protrombina; TTPa, Tiempo de Tromboplastina Parcial activada; TT, Tiempo de Trombina; TR, Tiempo de Reptilasa; ECT, Tiempo de Coagulacion por Ecarina.

Leyenda: Fig. 2. Modelo Celular de la coagulacion: consiste de 3 Fases o etapas: Iniciacion: La exposicion de FT conlleva a la formacion del complejo tenasa extrinseco, en esta etapa se forman trazas de trombina. Amplificacion: la trombina activa a las plaquetas y otros factores, como el FV, el FVIII y el FIX. Propagacion: La formacion de los complejos "Tenasa intrinseco" y "Protrombinasa", aseguran la generacion de grandes cantidades de trombina. Esta fase culmina con la formacion de fibrina entrecruzada, resultando en un coagulo estable.

FT, Factor Tisular; FvW, Factor von Willebrand; C., Complejo; C.T., Complejo Tenasa

Leyenda: Fig. 3. Formacion de fibrina. El Fibrinogeno esta compuesto por 3 dominios globulares, uno central denominado Dominio E (en rojo) y dos dominios D (en negro) a cada lado. Luego de la liberacion de los fibrinopeptidos A y B por la trombina. Los monomeros de fibrina polimerizan formando un polimero de fibrina soluble, el cual sera estabilizado gracias a la accion del FXIIIa, formando un polimero insoluble o coagulo estable.

Leyenda: Fig. 4. Funciones de la trombina. La trombina tiene numerosas funciones dentro de la hemostasia, las cuales pueden ser clasificadas como: procoagulantes, anticoagulantes, profibrinoliticas y anfibrinoliticas. TM, Trombomodulina; PC, Proteina C; FvW, Factor von Willebrand; GPIb, Glicoproteina Ib de las plaquetas; t-PA, activador de plasminogeno tisular; TAFI, Inhibidor de la Fibrinolisis Activable por Trombina.

Leyenda: Fig. 5. Inhibicion de la coagulacion. Los tres principales mecanismos que regulan la coagulacion son: A) El complejo trombina-TM-EPCR, que transforma a la PC en PCa, la cual junto a la PS inactiva a los factores Va y VIIIa. B) La ATIII que inhibe a la trombina, al FIXa, y al FXa en presencia de heparina. C) El TFPI, que se une al complejo TF-FVIIa-FXa. La PS tambien puede unirse al TFPI para inhibir la actividad del FXa. TM, Trombomodulina; EPRC, Receptor endotelial de la PC; Proteina C; PS, Proteina S; ATIII, Antitrombina III; TFPI, Inhibidor de la via del factor tisular; TF, Factor Tisular.
TABLA I
CARACTERISTICAS BIOQUIMICAS Y FUNCION DE LOS FACTORES
DE LA COAGULACION

                                         Concentracion   Tiempo de
                                          Plasmatica     vida media
Nombre                        PM (kDa)      (mg/dL)       (horas)

Factores de contacto

  Factor XI                     160         0,4-0,6        45-80

  Factor XII                     80         1,5-4,5        50-70
  Precalicreina                  85         1,5-4,5          36
Quininogenos de alto peso       120           8-9         144-156
  molecular (QAPM)

Factores dependientes de vitamina K

  Factor II                      72          10-12         60-72
  Factor VII                   48-50       0,05-0,06        4-6

  Factor IX                    55-57        0,4-0,5        18-25

  Factor X                      58,9        0,7-1,2        24-40

  Proteina C                     62        0,39-0,59        8-14

  Proteina S                     69           2,5          40-60
  Proteina Z                     62          0,22            60

  Cofactores

  Factor V                      330         0,4-1,4        12-36
  Factor VIII                   330          0,5-1          8-12

  Trombomodulina                 74            0
  Factor Tisular               35-46           0

Cimogenos o Sustratos

  Fibrinogeno                   340         200-400          90
  Factor XIII                   320           1-2         168-288
  Inhibidores
  Antitrombina III               58          15-20           68

Cofactor II de la heparina      66,5        6,1-8,2          60
Inhibidor de la Proteina C       57           0,5           23,4

Inhibidor de la proteina Z       72        0,1-0,16
TFPI o Inhibidor de la via       40          0,006          1-2
  del factor tisular

Nombre                                       Funcion

Factores de contacto

  Factor XI                   En su forma activada es el activador
                                intrinseco del FIX
  Factor XII                  Iniciador de la via intrinseca
  Precalicreina               Precursor de la Calicreina
Quininogenos de alto peso     Cofactores en la activacion de
  molecular (QAPM)              Precalicreina, FXI y FXII

Factores dependientes de vitamina K

  Factor II                   Precursor inactivo de la trombina
  Factor VII                  Junto al Factor Tisular inicia la via
                                extrinseca
  Factor IX                   En su forma activa es la enzima del
                                complejo tenasa intrinseco
  Factor X                    En su forma activa es la enzima del
                                complejo protrombinasa.
  Proteina C                  En su forma activa inactiva al FVa
                                y FVIIIa
  Proteina S                  Cofactor de la PCa
  Proteina Z                  Incrementa la inhibicion del FXa por
                                el Inhibidor de la Proteina Z
  Cofactores

  Factor V                    Cofactor del complejo protrombinasa
  Factor VIII                 Cofactor del complejo tenasa
                                intrinseco
  Trombomodulina              Cofactor de la trombina
  Factor Tisular              Inicia la via extrinseca al unirse
                                al FVIIa
Cimogenos o Sustratos

  Fibrinogeno                 Precursor de la fibrina
  Factor XIII                 Transaminasa que entrecruza la fibrina
  Inhibidores
  Antitrombina III            Serpina que inhibe a la trombina y a
                                los factores VIIa, IXa, Xa, XIa,
                                XIIa y calicreina.
Cofactor II de la heparina    Serpina que inhibe a trombina
Inhibidor de la Proteina C    Serpina que inhibe PCa, trombina,
                                calicreina, FXIa, FXIIa y al
                                componente C1
Inhibidor de la proteina Z    Serpina que inhibe FXa y FXIa
TFPI o Inhibidor de la via    Inhibidor tipo Kunitz de los complejos
  del factor tisular            TF/ FVIIa/FXa y del PS/FXa
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Author:Guerrero, Belsy; Lopez, Mercedes
Publication:Investigacion Clinica
Date:Dec 1, 2015
Words:12773
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