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Fundamentos de criopreservacion.

RESUMEN

El entender y aplicar adecuadamente la criopreservacion de material biologico es fundamental en laboratorios y bancos de celulas. Sin embargo aunque se han implementado protocolos para criopreservacion, aun no se tienen los ideales en la mayoria de los casos.

El objetivo de esta revision es dar a conocer ciertos parametros inherentes al proceso de criopreservacion y la importancia de conocer ciertas caracteristicas de la celula que pueden incidir con la viabilidad del producto congelado para lograr la tecnica adecuada. Para alcanzar este proposito, el documento se basara en el conocimiento de las propiedades fisicoquimicas de la celula y/o el tejido, pues este proceso es afectado por diferentes variables como permeabilidad celular, volumen osmoticamente inactivo y relacion superficie/area de la celula, la cual es variable de acuerdo a la especie, tipo y estadio de la celula a congelar. La estructura y composicion de las membranas plasmaticas determinan los principales eventos celulares que tienen lugar durante los procesos de criopreservacion; las bajas temperaturas afectan la difusion y osmosis a traves de las membranas y cada celula maneja su propio perfil biofisico el cual interactua con diferentes criopreservantes celulares. El hallar el protocolo adecuado sera lo que garantice la viabilidad y funcionabilidad celular.

Palabras clave: criopreservacion celular, celulas madre, Colombia.

SUMMARY

The appropriate understanding of and applying cryopreservation to biological material is fundamental for laboratories and cell-banks. However, although protocols have been implemented for cryopreservation, ideal standards are still not being achieved or complied with in most cases. A suitable cryopreservation technique must be based on knowledge of a particular cell and/or tissue's physicochemical properties because cryopreservation is affected by different variables such as cellular permeability, osmotic inactive volume and a cell's surface/area relationship which varies according to the species, type and state of the cell to be frozen. Plasmatic membrane structure and composition determine the main cellular events taking place during cryopreservation; a drop in temperature affects diffusion and osmosis through membranes and each cell manages its own biophysical profile interacting with different cellular cryoprotectors. Cell viability and functionality can only be guaranteed by ensuring that an appropriate protocol is implemented and followed.

Key words: cellular cryopreservation, stem cells, Colombia.

INTRODUCCION

La criopreservacion tiene como objetivo el mantenimiento de la viabilidad y uncionabilidad celular a temperaturas bajas. La criobiologia se refiere a entender los efectos de las temperaturas bajas sobre los sistemas celulares ya que el tiempo biologico es una consecuencia de determinadas reacciones bioquimicas y el frio prolonga el tiempo biologico puesto que enlentece estas reacciones. Sin embargo, este no es un proceso exento de problemas ya que puede inducir variaciones extremas en las propiedades quimicas, termicas y electricas las cuales pueden alterar las membranas celulares, los organelos y la delicada interaccion celula-celula inherente en las celulas y tejidos a criopreservar. (1)

La estructura y composicion de las membranas plasmaticas determinan los principales eventos celulares que tienen lugar durante los procesos de criopreservacion, su comportamiento durante la congelacion y descongelacion definira los indices de supervivencia de la celula congelada. Los periodos criticos para la sobrevida celular durante la criopreservacion son la fase inicial del congelamiento y el periodo de retorno a condiciones fisiologicas. (2)

El entender y aplicar adecuadamente la criopreservacion de material biologico es fundamental para los bancos de celulas de humanos y de celulas animales, los laboratorios de cultivo celular (mantener una linea celular en cultivo continuo por largos periodos de tiempo es costosa, hay un gran riesgo de contaminacion asi como la posibilidad de una alteracion genetica) y los laboratorios de farmacia, por lo cual hay una especial atencion a la conservacion de tejidos, organos y embriones humanos para ser utilizados en investigacion y su posterior aplicacion terapeutica (trasplantes) llegando a crear verdaderos archivos biologicos. (3) Sin embargo, aunque desde hace mucho tiempo se han implementado protocolos para criopreservacion, estos son aun suboptimos en la mayoria de los casos.

La obtencion de un protocolo ideal para criopreservar es dependiente del conocimiento de las propiedades fisicoquimicas de la celula y o el tejido puesto que este proceso esta afectado por diferentes variables como especie, tipo y estadio de la celula a congelar. (4) Las celulas tienen diferente tamano y manejan diferente composicion de solutos y en general el exito de la criopreservacion es inversamente correlacionado con la complejidad de los sistemas biologicos congelados. Criopreservar celulas suele ser mas facil a diferencia de hacerlo en ciertos tejidos como el testicular o el tejido ovarico pues su compartimentalizacion lo hace mucho mas complejo. (3)

La membrana plasmatica de la celula eucariota, independientemente de su composicion, tiene una estructura organizada segun el modelo de mosaico fluido. (5) Estas membranas se componen basicamente de lipidos amfipaticos, proteinas y un pequeno porcentaje de carbohidratos que es variable de acuerdo al tipo y especie celular. A modo de ejemplo, la membrana plasmatica de los eritrocitos se compone de un 9% de proteina, un 43% de lipidos y un 8% de carbohidratos. (6) Se debe tener en cuenta que el tamano de particula, la polaridad y la carga ionica determinan el paso a traves de las membranas y de esa forma, pequenas moleculas como las de agua (peso molecular PM: 18), etanol (PM: 46), glicerol (PM: 92) y oxigeno pasan a traves de la membrana mientras que la glucosa (PM: 180) no lo hace. Cuanto menos polar es una molecula mas rapido puede pasar la membrana.

Los lipidos (colesterol y acidos grasos) como componentes mas abundantes de la membrana plasmatica, determinan la fluidez y resistencia de la membrana durante los procesos de criopreservacion. El empaquetamiento y la posicion de estas moleculas en las bicapas determinaran la rigidez de las membranas y por tanto el transporte de moleculas. Este transporte a traves de las membranas es el punto critico para la supervivencia celular posdescongelacion.

En las bicapas, los acidos grasos de los fosfolipidos se posicionan en paralelo los unos a los otros mientras que el colesterol se intercala entre ellos. Este empaquetamiento de las cadenas hidrofobicas hace que interaccionen entre ellas y se estabilicen por fuerzas de van der Waals. Cuanto mas dificil sea este empaquetamiento mas fluida sera la membrana. Cuanto mas larga es la cadena del acido graso, mas facilmente se forman estas uniones y mas rigida es la membrana, la existencia de dobles enlaces en las cadenas hidrofobicas de los fosfolipidos de la membrana introduce cambios de orientacion en las cadenas y hace que estas moleculas no interaccionen tan facilmente entre si y por tanto que la membrana sea mas fluida. La presencia de moleculas de colesterol en la bicapa le proporciona rigidez a temperaturas fisiologicas por la union de sus anillos a las cadenas de acidos grasos (impide su libre movimiento y por tanto disminuye la fluidez) pero impide, por razones estericas, que las cadenas de acidos grasos se empaqueten libremente (cristalicen) al disminuir la temperatura aumentando, en ese momento, la fluidez de las membranas. (7)

Las membranas celulares son las estructuras que sufren mayor dano en los procesos de congelacion en general debido a la perdida de fluidez de sus componentes lipidicos, la transicion de lipidos fluidos a solidos se da a una temperatura de 10[grados]C - 16[grados]C alterando de esta manera las funciones de la membrana y dandole un alto grado de fragilidad, durante la deshidratacion celular que tiene lugar en el proceso de congelacion se puede presentar una perdida de lipidos lo cual afectaria la integridad de la membrana plasmatica por perdida de su capacidad de expansion durante la rehidratacion al volver a condiciones isotonicas. (8)

FUNDAMENTOS DE CRIOPRESERVACION

Transporte a traves de las membranas durante la congelacion y descongelacion

La bajas temperaturas (asociadas al aumento de la rigidez de la membrana) y la rapidez (decimas de segundo) con la que suceden los cambios osmoticos en los procesos de congelacion y descongelacion hacen muy dificil el movimiento de moleculas a traves de la membrana mediante procesos de transporte activo (dependientes de ATP), la disminucion de temperatura desde 25[grados]C a 10[grados]C reduce en un 60% la actividad de las bombas dependientes de ATP y la difusion facilitada o como transporte (transporte concomitante de dos moleculas a traves de la membrana dependiente una de ellas de ATP y/o iones [H.sup.+]), en consecuencia, los procesos de difusion y osmosis son los que predominan en los momentos de estres osmotico. (9)

La difusion es un proceso mediante el cual las moleculas de una sustancia tienden a alcanzar una distribucion homogenea en todo el espacio que les es accesible. La magnitud de la tendencia a difundir desde una zona a otra si esta presente una membrana que separe las dos zonas esta definida por la ley de difusion de Fick, que relaciona el gradiente entre las dos zonas (gradiente quimico o de concentracion), las caracteristicas de la membrana (grosor, area de seccion transversa y permeabilidad para un determinado soluto), es directamente proporcional a la superficie (area) de la membrana y a la diferencia de concentracion del soluto entre los dos lados e inversamente proporcional al espesor (grosor) de la membrana. La velocidad de la difusion es proporcional a una constante de difusion que depende de las propiedades de la membrana y de cada soluto en particular, un equilibrio puede conseguirse en segundos si la distancia es de micras, pero puede subir a varias horas si la distancia de difusion se incrementa a milimetros. (7)

La osmosis es un caso especial de difusion en el que es el movimiento del disolvente el que se estudia, y se define en funcion de los solutos. La osmosis es el movimiento del agua desde soluciones con baja concentracion de soluto hasta soluciones con alta concentracion de soluto y la presion osmotica es la presion hidrostatica que se genera a traves de una membrana semipermeable con un gradiente de concentracion al lado y lado, depende del numero de particulas de la solucion. (7)

La presion osmotica se suele expresar en osmoles y depende exclusivamente del numero de particulas disueltas (moles) por unidad de volumen, con independencia de su carga electrica, peso o formula quimica, es por tanto una propiedad coligativa (es decir las propiedades colectivas que una solucion tiene cuando estos compuestos estan presentes), los productos criopreservados se deben almacenar a temperaturas desde -133[grados]C (vapores de nitrogeno liquido) a -196[grados]C (nitrogeno liquido). A estas temperaturas no existen fenomenos de difusion ni energia termica suficiente para llevar a cabo las reacciones quimicas y por tanto las dificultades de la congelacion no derivan de la permanencia a temperaturas bajas sino de los procesos de congelacion y descongelacion. (10)

La lesion celular crio inducida se explica en funcion de la formacion de hielo intracelular y el estres osmotico al que se ven sometidas las membranas celulares durante la congelacion, Merryman propone la hipotesis del volumen celular minimo que relaciona el efecto de la deshidratacion producida durante la concentracion de solutos y la muerte celular con la vuelta a las condiciones isotonicas despues de la congelacion (choque osmotico), el volumen celular minimo se basa en que el volumen se reduce en relacion al aumento de la osmolaridad extracelular, a medida que la celula pierde volumen por la perdida de agua, la compresion del contenido citoplasmatico aumenta la resistencia de la celula a seguir perdiendo volumen, y al excederse la resistencia fisica de la membrana se produciran cambios irreversibles en su permeabilidad, en este caso los crioprotectores actuarian reduciendo por sus propiedades coligativas la cantidad de hielo formado a una temperatura determinada. (11)

Agentes crioprotectores (ACP)

Los criopreservantes son sustancias hidrosolubles y de baja toxicidad, que disminuyen el punto eutectico de una solucion dada, (punto en el cual una composicion dada de A y B solidifica como un elemento puro), el descenso del punto eutectico implica que se alcanzara una concentracion dada de solutos a una temperatura menor, de forma que la celula estara mas deshidratada y el gradiente osmotico al que estara sometido sera menor.

Bioquimicamente es posible distinguir tres tipos de crioprotectores, los alcoholes (metanol, etanol, propanol, 1-2 propanediol y glicerol), azucares (glucosa, lactosa, sucrosa, sacarosa) y el dimetil sulfoxido, los crioprotectores pueden clasificarse tambien en agentes penetrantes y no penetrantes de acuerdo a la permeabilidad celular. (12,13)

Los crioprotectores penetrantes

Son de bajo peso molecular y permeables a traves de la membrana celular. Son utilizados: el glicerol, el dimetilsulfoxido (DMSO) y propanediol (PROH).

El dimetil sulfoxido es un solvente bipolar aprotico, hidrosoluble, de bajo peso molecular; desde el descubrimiento de sus propiedades crioprotectoras por Lovelock en 1959, (14) el DMSO se ha usado como un crioprotector. Su accion crioprotectora se atribuye principalmente a su habilidad de prevenir acumulacion excesiva de electrolitos y otras sustancias durante el proceso de congelamiento, y la formacion de cristales de hielo que rompen la estructura de la membrana, su bajo peso molecular permite la entrada rapida traves de la membrana celular, (12) modula la estabilidad y fases de la bicapa de los fosfolipidos, asi como tambien afecta los procesos de solvatacion de agua. Se han sugerido las interacciones electrostaticas de DMSO con fosfolipidos lo cual parece ser critico para la crioproteccion de la membrana. (13) El 1-2. propanediol ha sido utilizado principalmente para congelacion de blastocistos y embriones en estado de preimplantacion de humanos y otras especies. (13)

Agentes crioprotectores no-penetrantes

Son sustancias de alto peso molecular, efectivas a velocidades altas de congelacion, son importantes por ejercer su accion crioprotectora promoviendo la rapida deshidratacion celular y suelen usarse asociados a los agentes penetrantes. Los mas utilizados son: sacarosa, glucosa, dextrosa y dextrano. Estos compuestos generalmente son polimeros que forman puentes hidrogeno con el agua, reduciendo la actividad de agua a una magnitud mucho mayor que la que se predeciria por su concentracion molar (ellos no obedecen la ley de Raoult).

La adicion del criopreservante per se genera estres osmotico sobre las celulas porque aumenta la osmolaridad del medio. Las celulas inicialmente se deshidratan para compensar la fuerza osmotica inducida por la presencia de los ACP y despues se hidrata. La definicion de los parametros biofisicos de cada celula y el estudio de la interaccion con los ACP durante la congelacion y descongelacion de las celulas deben ser definidos para establecer los limites fisicos que aseguren la supervivencia de la celula.

Estudio de los parametros biofisicos de las celulas

Las celulas se comportan como osmometros, por lo tanto variaran su volumen en respuesta a los cambios osmoticos extracelulares, asi las celulas pierden o captan agua segun se expongan a condiciones hipo o hiper osmoticas, respectivamente; los movimientos de agua y crioprotectores a traves de la membrana celular durante la criopreservacion se rigen por diversos parametros biofisicos que deben ser definidos para cada tipo celular a diferentes temperaturas.

Los mas estudiados son: 1.) el volumen osmoticamente inactivo (que se define como el agua que nunca dejara el interior celular en respuesta a un aumento de concentracion de solutos en el espacio extracelular por estar asociado a las macromoleculas y estructuras intracelulares) que esta relacionado con la hipotesis de volumen minimo de Meryman (11) y que se puede conocer mediante micro perfusion en un sistema de micro manipulacion, (15) 2.) la permeabilidad de la membrana celular (al agua, criopreservantes, solutos) que puede ser estudiada entre otras por un contador electronico de particulas con un software especifico, criomicroscopia (15-17) y la tecnica de escaneo calorimetrico diferencial (DSC) basada en que durante la deshidratacion de la celula, sin congelacion intracelular, se aumenta la concentracion de electrolitos, sustratos, cofactores, proteinas celulares y asimismo se aumenta el transporte de agua al medio externo en congelacion, este ultimo fenomeno genera liberacion de calor de fusion proporcional a la cantidad de agua removida de la celula. La celula es entonces lisada y el DSC mide repetidamente el calor de fusion emitido, estas diferencias son utilizadas para calcular el volumen de agua que ha atravesado la membrana; de esta ultima se puede deducir el volumen como una funcion de temperatura subcero, (18) 3.) la relacion area de superficie celular a volumen que es variable entre las celulas. En la tabla 1 se observa el perfil biofisico de la celula CD34+.

Un banco de celulas debe tener disponible los ensayos de viabilidad ya que estos son necesarios y pueden ser predictivos de la calidad de una muestra entendiendo que la viabilidad no es sinonimo de la vida. Los indices de viabilidad son especificos al mecanismo asi como a la muestra biologica y la funcion moderada (una muestra particular puede tener mas de un indice de viabilidad). La funcion que debe mantener la celula descongelada in vivo es la funcion ideal para medir un indice de viabilidad. La medicion de esa viabilidad debe ser realizada por estudios de citometria mediante la incorporacion del 7AAD y, en algunos casos, por ensayos de cultivos clonogenicos que aseguren la funcionabilidad del producto descongelado. (20)

Metodos de criopreservacion

Podemos clasificarlos de acuerdo a la velocidad de congelamiento y descongelamiento en protocolos de congelacion lenta-descongelacion lenta, congelacion lenta-descongelacion rapida en las cuales la adicion del crioprotector suele hacerse por pasos y el descenso de la temperatura se realiza lentamente en un congelador programable. La descongelacion rapida se hace rapidamente a temperatura ambiente o en un bano de agua a 30[grados]C para evitar la recristalizacion.

La congelacion ultrarrapida fue originalmente descrita para la congelacion de embriones, por Trouson en 1986. Implica la rapida deshidratacion celular, utilizando altas concentraciones de crioprotector, usualmente DMSO y sacarosa, seguida de inmersion en nitrogeno liquido.

La vitrificacion tampoco requiere la utilizacion de un congelador programable; se basa en la congelacion rapida en una mezcla de altas concentraciones de crioprotectores, que a bajas temperaturas aumentan su viscosidad formando un solido amorfo, sin formacion de hielo. (4)

Bancos de criopreservacion

Criopreservacion de ovocitos: la condicion de esterilidad iatrogenica posterior a quimioterapia o radioterapia en patologias neoplasicas, puede ser evitada con la criopreservacion de ovocitos, adicionalmente, mujeres que sufren otras patologias del sistema reproductivo (falla ovarica prematura, endometriosis, quistes, infecciones pelvicas), o mujeres quienes desean postergar la maternidad pueden asegurar su potencial de fertilidad usando esta tecnica. (13)

La ovogenesis involucra cambios bioquimicos y estructurales en el nucleo, el oolema y el complejo oocito-granulosa, por lo tanto los elementos del citoesqueleto, la progresion del ciclo celular, la morfogenesis del huso, entre otros, son importantes factores determinantes para el desarrollo de protocolos de criopreservacion especificos para cada estado de madurez.21 El almacenamiento y criopreservacion del ovocito han sido mucho mas complejos que los del gameto masculino y de embriones. Los ovocitos son extremadamente sensibles a la temperatura con eventual despolimerizacion de los microtubulos del huso causados por los crioprotectores o los cristales de hielo formados durante la congelacion y descongelacion, la separacion normal de las cromatidas puede ser afectada durante estos procesos induciendo asi aneuploidias; el bajo numero de embarazos posterior a la criopreservacion de ovocitos refleja las dificultades tecnicas de los procedimientos de congelacion. (22)

Por otra parte, el ovocito es una gran celula y por lo tanto tiene una baja relacion de area de superficie a volumen, esto impide la sobrevida post criopreservacion viendose alterada principalmente la zona pelucida por liberacion prematura del contenido de los granulos corticales, disrupcion de la membrana plasmatica, desorganizacion extensiva del ooplasma y alteraciones en el citoesqueleto. (3) La evidencia de los danos presentados en ovocitos congelados condujo al desarrollo de congelacion de ovocitos en estados mas inmaduros como es el caso de los foliculos primordiales y vesiculas germinales, con tasas de exito aun limitadas , ya que resulta dificil lograr su desarrollo in vitro en estadios mas maduros. Esta misma dificultad llevo a los investigadores a disenar protocolos de congelacion para ovocitos en metafase II. Variedad de metodos han sido expuestos, algunos utilizando DMSO y posteriormente el 1,2 PROH, como tambien tasas de congelamiento lentas de 0,3-0,5[grados]C/min hasta llegar a -40[grados]C o -80[grados]C. (23,24) Otras tecnicas varian la temperatura, el tiempo de exposicion al crioprotector, la temperatura para realizar el seeding y la utilizacion de sucrosa en conjunto con otros CPA. Actualmente se han desarrollado protocolos de congelacion ultrarrapida-descongelacion rapida, utilizando altas concentraciones de crioprotectores previniendo asi la formacion de cristales de hielo y la induccion de un medio amorfo y vitreo. Trounson fue el primero en aplicar esta estrategia a la criopreservacion de ovocitos por la inmersion directa del ovocito en el nitrogeno liquido (congelacion ultrarrapida) y la subsiguiente descongelacion hecha a 37[grados]C en un bano de agua.25 En otro proceso llamado vitrificacion, una solucion de crioprotectores altamente concentrados se solidifica durante la congelacion sin la formacion de cristales de hielo, en un fluido altamente viscoso y super enfriado, este metodo demostro algunas ventajas claras compradas con la congelacion lenta debido a que es evitada la formacion de hielo extracelular. La combinacion de una alta tasa de enfriamiento (cerca de los 1.500[grados]C/min) y altas concentraciones de crioprotector tales como DMSO, acetamida, polietilenglicol (PEG), son requeridos para la vitrificacion. Trounson reporta aceptables tasas de sobrevida y fertilizacion pero bajas tasas de clivaje, quizas debido a danos en el citoesqueleto.

En terminos generales el crioprotector en la solucion determina una leve disminucion en el punto crioscopico de esta (-2[grados]C o -3[grados]C). El efecto protector es principalmente un resultado de la capacidad de estas moleculas de formar uniones de hidrogeno que alteren la estructura cristalizada normal del agua. A traves de sus grupos OH, el glicerol y el PROH por ejemplo, pueden formar uniones de hidrogeno con el agua mientras que el DMSO lo hace a traves de los atomos de oxigeno. Los CPA reducen el efecto danino de la alta concentracion de electrolitos en la porcion de agua en su estado liquido. En sistemas que son constituidos por dos fases a una presion constante tales como el hielo y el agua, la concentracion total de solutos en la fase liquida es constante y, debido a esto la adicion de CPA reduce la cantidad de agua que se cristaliza. (26)

Otro paso importante en la criopreservacion de ovocitos es la remocion del CPA permeable del citoplasma. El proceso consiste en pasaje del ovocito a traves de una serie de soluciones que contienen concentraciones gradualmente disminuidas. Como resultado del efecto de la presion osmotica, las celulas podrian explotar si se coloca en un medio sin CPA inmediatamente despues de descongelarlas. La escogencia de la tasa de descongelacion depende de la tasa a la cual haya sido congelada.

Congelacion de espermatozoides: a pesar de que los espermatozoides fueron los primeros tipos de celulas crio preservadas,27 intentos de mejoramiento para su criopreservacion son objeto de investigacion, principalmente por la pobre sobreviva de estas celulas en pacientes con infertilidad y problemas oncologicos. No hubo avances significativos hasta el descubrimiento de las propiedades crioprotectoras del glicerol en espermatozoides de toro, abriendo asi una opcion viable para campos como la reproduccion asistida en humanos. El exito relativo de la criopreservacion del semen ha mostrado avances significativos en el intercambio internacional de animales geneticamente superiores, biotecnologia, conservacion de especies en extincion y medicina reproductiva humana.

La criopreservacion de espermatozoides humanos y bovinos ha evolucionado empiricamente, usando tasas de congelamiento de hasta 100-200[grados]C/min y medios basados en glicerol con citrato de yema de huevo, sin embargo otros estudios sugieren tasas de sobrevida exitosa utilizando etilenglicol. (28) Sin embargo, estos protocolos deben ser re-examinados con estrecha atencion al dano causado por la criopreservacion.

La caracterizacion de la criobiologia del espermatozoide se empezo hace aproximadamente veinte anos, determinando diferentes parametros de los espermatozoides, entre ellos los cambios bioquimicos, estatus energetico, integridad de la membrana, temperatura de transicion de fase de la membrana lipidica, integridad de elementos subcelulares y morfologia de acrosoma. (29)

Cuando el ACP es agregado de forma abrupta se puede observar dano en la membrana plasmatica, region acrosomal y configuracion de la cola. (30)

Muchos laboratorios utilizan el metodo simple y rapido de suspender las pajuelas o las ampollas en vapores de nitrogeno liquido por un periodo adicional antes de sumergirlas definitivamente dentro del nitrogeno liquido por largos periodos de tiempo. Este metodo no requiere equipos especializados y, aunque no es ideal, puede dar lugar a tasas de vida satisfactorias. Los principales problemas incluyen tasas de enfriamiento no uniformes entre alicuotas del mimo eyaculado y dificultades en mantener reproducibles las condiciones de congelacion. Congeladores programables en los cuales circulan los vapores de nitrogeno liquido en una tasa controlada permiten curvas de enfriamiento mas reproducibles, permitiendo mantener las temperaturas para hacer el seeding manual. (31)

Estudios mas recientes han sugerido que la permeabilidad de la membrana espermatica a temperaturas supracero es mas alta de las de otros espermatozoides de mamiferos. Esta alta permeabilidad puede ser por la presencia de proteinas que forman canales selectivos para el agua; se ha sugerido que las celulas con alta permeabilidad al agua y baja energia de activacion (< 6-7 kcal/mol) tienen canales especificos para el agua o aquaporinas AQP, siendo esta una explicacion teorica para los espermatozoides.32 Se ha reportado abundante expresion de AQP7 y AQP8 en testiculos. Estudios indican que AQP7 aparece solamente en estados tardios de la espermatogenesis y esta presente en pequenas cantidades en espermatozoides maduros.

Congelacion de embriones: en humanos, el primer nacimiento de un embrion congelado ocurrio en 1983 en Australia por Trounson, a partir de este momento la embrio-congelacion se extendio rapidamente con la ayuda de procedimientos biologicos optimizados y simplificados tales como el uso de PROH y sucrosa como crioprotectores llegando a ser una indispensable extension de las ART.32

Tres medidas tecnicas deben ser usadas para un mejor control del periodo inestable de cambio de fase en la solucion que rodea al embrion y en el embrion mismo, estas son:

1. El control de las tasas de congelacion y descongelacion: a medida que la tasa de enfriamiento aumenta, la probabilidad de que el hielo intracelular pueda formarse tambien aumenta. Para cada celula hay una optima tasa de enfriamiento la cual depende de varios factores, particularmente el volumen celular y la composicion de la membrana. Las mas altas tasas de sobrevida son obtenidas con una velocidad de enfriamiento de aproximadamente 0,3[grados]C/min. Para cigotos y embriones con una tasa de congelacion de 4-8[grados]C/min.

2. Crioproteccion quimica: la crioproteccion ha sido demostrada para embriones humanos asi como para otras celulas, hasta ahora se ha evidenciado que el glicerol entra y deja las celulas embrionicas mucho mas lento que el DMSO y el PROH, el propanediol tiene una toxicidad mas baja a altas concentraciones que el glicerol o el DMSO. La adicion de algunos azucares mono-di o tri sacaridos no entran a la celula pero actuan como crioprotectores incrementando la presion osmotica del medio externo. Durante los procesos de descongelacion, esta propiedad osmotica de los compuestos no permeables puede tambien ser usada para limitar la entrada de agua durante el procedimiento de remocion del crioprotector, protegiendo por tanto al embrion de la excesiva y rapida rehidratacion.

3. Enucleacion del hielo: las soluciones crioprotectoras usualmente alcanzan temperaturas tan bajas como -15[grados]C antes de que el hielo sea formado. Esto es llamado super-enfriamiento y este fenomeno produce calor latente, el cual se ha visto en la curva de enfriamiento como un corto espacio en la disminucion lineal programada de la temperatura. Evitar el super-enfriamiento es esencial para el exito de la embrio-congelacion. La forma usual de evitar este super-enfriamiento es inducir la formacion de hielo a cerca de -7[grados]C con un leve contacto en la superficie de los viales o pajuelas que contengan los embriones con unas pinzas, previamente enfriadas en nitrogeno liquido. Las pinzas son retiradas tan pronto como los primeros cristales sean vistos como un punto blanco en la solucion extracelular y la caida programada en la temperatura es reiniciada. Este seeding de hielo puede ser hecho automaticamente en algunos congeladores programables pero es menos confiable que la induccion de hielo mecanica visualmente controlada. (33)

Protocolos de embrio-congelacion:

Congelacion lenta: utilizando PROH para zigotos o para embriones en estadio temprano, DMSO para estados divididos y glicerol para blastocistos. Usando PROH 1,5 moles/Lt y sucrosa 0,1 moles/Lt, a una tasa de 0,3[grados]C/ min., hasta -30[grados]C.

Congelacion ultrarrapida: utilizando 2,0-3,0 M de DMSO y 0,25-0,5 M de sucrosa. Vitrificacion: utilizando 40% de Etilenglicol.

La congelacion de embriones puede ser realizada en diferentes estadios de desarrollo, teniendo cada uno diferentes tasas de sobrevida, asi como tambien ventajas y desventajas. La eficiencia de un programa de congelacion es evaluada por la observacion de la integridad morfologica del embrion en descongelacion, la habilidad de clivar in vitro y su capacidad de implantacion. (33)

Banco de celulas madre de sangre de cordon umbilical

La sangre de cordon umbilical (SCU) contiene una elevada cantidad de progenitores hemopoyeticos circulantes desde la semana 14 de embarazo, condicion que es permanente hasta el momento del parto en que su numero es condicionado a ciertas condiciones ginecoobstetricas, estas celulas tienen la capacidad de repoblacion medular a largo plazo. Como consecuencia, dicho tejido se ha convertido en alternativa para trasplante.

Las celulas nucleares se obtienen por centrifugacion diferencial en un sistema de circulacion cerrado para disminuir contaminantes, se criopreservan en bolsa con doble compartimiento utilizando crioprotectores intracelulares (DMSO) y crioprotectores extracelulares (Dextran). Para el congelamiento de la unidad de cordon se utiliza una curva de congelamiento programada en un equipo que disminuye gradualmente 1[grados]C por minuto a 4[grados]C; primero se agrega la solucion crioprotectora de manera gradual para lograr el equilibrio osmotico ( 5 minutos) y se utiliza una curva de congelamiento programada en un equipo que disminuye gradualmente 1[grados]C por minuto hasta llegar a -10[grados]C, se induce el proceso de nucleacion disminuyendo abruptamente a -60[grados]C posteriormente es llevado a -20[grados]C y disminuye gradualmente hasta -120[grados]C una vez alcanzada dicha temperatura las celulas son guardadas en tanques de nitrogeno liquido para su posterior aplicacion. (34)

CONCLUSION

Cada tipo celular debe ser congelado conociendo el perfil biofisico de la celula, el cual dictara mediante ensayos de permeabilidad y volumen osmoticamente inactivo con diferentes criopreservantes y/o soluciones criopreservantes (mezcla de crioprotectores penetrantes y no penetrantes) el mejor protocolo de criopreservacion de esa celula. Es importante asegurar un sistema de seguridad, de continuidad del nitrogeno liquido y ensayos de control de calidad por medio de pruebas de viabilidad.

Recibido: mayo 15/06 - Revisado: octubre 10/06 - Aceptado: octubre 19/06

REFERENCIAS

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Conflicto de intereses: ninguno declarado.

Basic points in cryopreservation

Luz Mabel Avila-Portillo, Bacter., M.Sc*, Jose I. Madero, M.D., MSc**, Claudia Lopez, Bacter.,***, Maria Fernanda Leon, Bacter.***, Lucia Acosta, Bacter.**** Claudia Gomez, M.D.****, Lucy Gabriela Delgado, PhD*****, Claudio Gomez, PhD*****, Jose Manuel Lozano, PhD*****, Maria T. Reguero, PhD*****

* Candidata a Doctor en Ciencias Farmaceuticas, Universidad Nacional de Colombia. Banco de Celulas Stem de Colombia. Hospital Militar Central. Bogota, Colombia. Correo electronico: mabelavila_us@yahoo.com.

** Banco de Celulas Stem de Colombia. Medifertil.

*** Medifertil.

**** Banco de Celulas Stem de Colombia.

***** Profesor Universidad Nacional de Colombia.
Tabla 1

                              Volumen
              Volumen      osmoticamente   Permeabilidad
CELULA      celular cc      inactivo cc     agua cm/min

CD34+      2,38 x 10-10    0,27 x 10-10    20[grados]C
                                              5 x 10-
           Permeabilidad
CELULA     DMSO cm/min,         Ref

CD34+      20[grados]C       16,18,19
            0,91 x 10-3
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Title Annotation:Articulo Revision
Author:Avila-Portillo, Luz Mabel; Madero, Jose I.; Lopez, Claudia; Leon, Maria Fernanda; Acosta, Lucia; Gom
Publication:Revista Colombiana de Obstetricia y Ginecologia
Date:Oct 1, 2006
Words:6712
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