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Fotoestabilidad y actividad insecticida de dos formulaciones de granulovirus sobre larvas de Tecia solanivora.

Resumen: El Laboratorio de Control Biologico de Corpoica desarrollo dos formulaciones con base en un aislamiento nativo dei granulovirus de Phthorimaea operculella extraido de larvas de Tecia solanivora para el control de estas polillas en campo. Estas formulaciones incluyen un protector UV dei grupo de los abrillantadores opticos. Para determinar el efecto del abrillantador, se prepararon suspensiones virales ajustadas a cinco concentraciones desde [10.sup.2] hasta [10.sup.6] CI/mL, en soluciones del abrillantador al 0,1% y al 0,5% y se realizo un bioensayo para determinar las [CL.sub.50] del virus. Posteriormente las dos formulaciones, un concentrado emulsionable y granulado dispersable, fueron aplicadas sobre tuberculos de papa que se expusieron a la radiacion ultravioleta durante dos, cuatro, seis, ocho y 10 horas y se realizo un bioensayo para determinar el nivel de inactivacion del virus mediante la evaluacion de la mortalidad de los insectos. Se observo mayor actividad del virus cuando se incremento la concentracion del abrillantador, obteniendose una [CL.sub.50] de 1,6 x [10.sup.6] CI/mL para el virus puro, de 3,0 x [10.sup.5] CI/mL para el virus con el fotoprotector al 0,1% y de 3,0 x [10.sup.4] CI/ mL para el virus con el fotoprotector al 0,5%, resultados que permiten sugerir que el abrillantador optico presenta efecto sinergico con el viras. Ambas formulaciones protegieron eficientemente al virus del efecto de la radiacion UV, obteniendose mortalidades corregidas del 60% despues de 10 horas de exposicion con el concentrado emulsionable, del 46,6% con el granulado dispersable y del 23,3% con el virus puro.

Palabras clave: Baculovirus. Bioplaguicida. Abrillantador optico. Polilla guatemalteca de la papa.

Abstract: The Biological Control Laboratory of Corpoica developed two formulations based on a native isolate of the Phthorimea operculella granulovirus isolated from Tecia solanivora larvae, for the control of these moths in the field. These formulations include a UV protector from the group of optical brighteners. To determine the effect of the brightener, viral suspensions adjusted to five concentrations from [10.sup.2] up to [10.sup.6] CI/mL were prepared in brightener solutions at 0.1% and 0.5% anda bioassay was performed to determine the viral [LC.sub.50]. Afterwards the two formulations, an emulsifiable concentrate anda dispersible granule, were applied on potato tubers that were exposed to ultraviolet radiation during two, four, six, eight, and 10 hours and a bioassay was performed to determine viral inactivation level by evaluating insect mortality. Higher viral activity was observed when brightener concentration was increased, obtaining a [LC.sub.50] of 1.6 x [10.sup.6] CI/mL for pure virus, 3.0 x [10.sup.5] CI/mL for the virus with the photoprotector at 0.1% and 3.0 x [10.sup.4] CI/ mL for the virus with the photoprotector at 0.5%, results that allow us to suggest the optical brightener presents a synergistic effect with the virus. Both formulations efficiently protected the virus from the effect of UV radiation, obtaining corrected mortalities of 60% after 10 hours of exposure with the emulsifiable concentrate, 46.6% with the dispersible granule and 23.3% with the pure virus.

Key words: Baculovirus. Biopesticide. Optical brightener. Guatemalan potato moth.

Photostability and insecticidal activity of two formulations of granulovirus against Tecia solanivora larvae

Introduccion

Para el control de la polilla guatemalteca de la papa Tecia solanivora (Povolny, 1973) (Lepidoptera: Gelechiidae), una de las principales plagas de este cultivo, los agricultores acuden a una gran cantidad de plaguicidas quimicos que con frecuencia son aplicados de forma exagerada e indiscriminada. Frente a este problema surge la necesidad de desarrollar estrategias de manejo integrado de plagas (MIP) que ademas del control cultural, etologico y quimico, incluyen herramientas de control biologico (Herrera et al. 2000).

Dentro de las estrategias de control biologico implementadas para el manejo de T. solanivora, se encuentra el uso de virus entomopatogenos, como es el caso del granulovirus de Phthorimaea operculella (Zeller, 1873), patogeno tambien de T. solanivora (Espinel et al. 2009b). Sin embargo, la preservacion de la actividad original de un virus o algun otro entomopatogeno usado como insecticida microbiano y aplicado en campo, se ve afectada por factores ambientales como la luz ultravioleta (Ignoffo et al. 1997).

Dentro de los factores ambientales, el que produce la mayor inactivacion y afecta en mayor proporcion la estabilidad de los virus entomopatogenos, es la radiacion solar y se debe principalmente a la porcion del espectro correspondiente a la luz ultravioleta (UV) (Shapiro et al. 1983), que causa la inactivacion principalmente por la formacion de dimeros de pirimidina, que impiden la replicacion del ADN y la consecuente formacion de nuevos viriones (Burges 1998).

Por tales razones se han realizado trabajos en busqueda de estrategias que le proporcionen proteccion a los virus, para lo cual se han probado diferentes sustancias como los abrillantadores opticos, los cumes no solamente permiten proteger los virus de la radiacion UV, sino que simultaneamente tienen un efecto potenciador y permiten aumentar hasta mas de dos mil veces la actividad de un virus (Caballero et al. 2001). Sin embargo, es importante considerar que su utilizacion puede tener algunos efectos en el medio, lo cual depende de las dosis utilizadas (Kramer 1992).

Es por esto que Corpoica desarrollo dos formulaciones a base del granulovirus nativo VG003 aislado de Tecia solanivora, el cual afecta tambien a P. operculella (Espinel et al. 2009b) y segun el trabajo de Barrera et al. (2009), corresponde a un granulovirus de Phthorimaea operculella (PhopGV). Una formulacion corresponde a un concentrado emulsionable (CE) y otra a un granulado dispersable (GD). Estas incluyen dentro de sus excipientes un protector UV que pertenece al grupo de los abrillantadores opticos; este grupo de compuestos, ademas de brindar fotoproteccion, ha mostrado tener un efecto potenciador de la actividad insecticida de varios baculovirus (Caballero et al. 2001).

El objetivo del presente trabajo fue el de evaluar el efecto de las dos formulaciones sobre la fotoestabilidad del virus expuesto a una fuente artificial de luz ultravioleta y determinar el posible efecto del abrillantador optico incluido en las formulaciones, sobre la actividad insecticida del virus, con el fin de generar informacion que permita continuar con el desarrollo de los productos.

Materiales y Metodos

Propagacion viral. Para obtener la cantidad requerida de inoculo viral, se tomaron huevos de T. solanivora provenientes de la cria del insecto ubicada en el Laboratorio de Entomologia de Corpoica. Estos se inocularon con el aislamiento PhopGV nativo (VG003) proveniente de Cundinamarca y previamente seleccionado por presentar alta actividad insecticida contra T. solanivora (Espinel et al. 2009a). Los huevos ubicados sobre un disco de papel toalla (aproximadamente 400-500 huevos/disco) fueron inoculados con un pincel aplicando la suspension viral y dejandolos secar a temperatura ambiente.

En cubetas de plastico de 4 litros de capacidad se ubicaron seis tuberculos secos y previamente lavados con agua potable de papa pastusa. Sobre ellos se ubicaron trozos de papel, cada uno con aproximadamente 40 huevos inoculados. Los recipientes fueron cerrados e incubados en un cuarto de bioensayos a una temperatura de 25[grados]C por 20 dias. Pasado este tiempo, las larvas fueron extraidas y clasificadas. Aquellas larvas con sintoma tipico de la enfermedad causada por granulovirus, se colocaron en cajas de Petri esteriles, las cuales fueron selladas y almacenadas a 4[grados]C.

Purificacion y cuantificacion viral. El virus utilizado para los ensayos y para la elaboracion de los prototipos fue obtenido a partir de un proceso de purificacion mediante centrifugaciones diferenciales. Para tal fin, las larvas infectadas se maceraron en SDS al 0,1% y la suspension se filtro entres capas de velo suizo esteril, para una posterior centrifugacion a 800 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se recupero y centrifugo a 15000 rpm durante 1 hora y el sedimento obtenido se resuspendio en 2 mL de tampon Tris-HCl (pH 6.0) y se centrifugo nuevamente sobre un gradiente de glicerol de 30% -80% (v/v) a 15000 rpm durante 10 minutos. Se recupero la banda blanca que contenia el virus y esta se lavo dos veces en tampon Tris-HCl.

La concentracion de todas las suspensiones de virus purificado utilizadas para todos los ensayos, se cuantifico mediante la lectura de la absorbancia a 450 nm en un espectrofotometro, usando una curva de calibracion previamente estandarizada adaptando la metodologia descrita por Matthiessen et al. (1978).

Evaluacion del efecto potenciador del filtro UV. Se prepararon suspensiones virales ajustadas a concentraciones desde 2x [10.sup.2] hasta 2x[10.sup.6] CI/mL; estas fueron mezcladas en relacion 1:1 (V/V) con dos soluciones del filtro ultravioleta (CBUV05) ajustadas al 1% y al 0,2%.

Las suspensiones finalmente quedaron ajustadas a cinco concentraciones virales de 1 x [10.sup.2] a 1 x [10.sup.6] CI/mL y con el fotoprotector al 0,1% o al 0,5% respectivamente. El control positivo consistio en el virus puro mezclado con agua destilada y ajustado a las mismas concentraciones virales mencionadas anteriormente. De igual forma, se conto con un testigo absoluto en el cual los tuberculos no fueron tratados y un testigo relativo en el cual los tuberculos fueron tratados con las soluciones del filtro ultravioleta, pero sin estar este mezclado con el virus. Tres tuberculos lavados de similar tamano (180 [[+ o -] o -] 20 g por papa) fueron inoculados con cada tratamiento utilizando una brocha de 1 pulgada y aplicando 2 mL sobre cada cara del tuberculo.

Posteriormente se colocaron 10 larvas neonatas de T. solanivora sobre cada tuberculo (30 larvas por tratamiento) ubicado individualmente en un recipiente plastico de 16 onzas (unidad experimental). Los recipientes se taparon e incubaron a una temperatura de 25[grados]C durante 30 dias. Pasado este tiempo se realizo un muestreo destructivo de las papas en busca de todas las larvas. El numero de larvas muertas se considero como la suma de los individuos muertos, los desaparecidos y las larvas vivas con sintomas evidentes de infeccion vital y como individuos vivos, la suma de las larvas sanas y las pupas.

Este experimento conto con un diseno completamente al azar con tres repeticiones (10 larvas por repeticion) por tratamiento. Los resultados se sometieron a un analisis Probit con el programa BioStat 2008, para determinar el erecto del filtro UV sobre la concentracion letal media del virus.

Determinacion del efecto fotoestabilizador de las formulaciones. Las formulaciones se elaboraron empleando virus purificado y diferentes tipos de componentes como aceites vegetales y surfactantes para el concentrado emulsionable (CE) y silicatos, almidon y azucares para el granulado dispersable (GD). Ademas, los dos productos incluyeron un filtro ultravioleta del grupo de los abrillantadores opticos, los cuales tienen la capacidad de absorber el espectro que comprende la luz UV y emitir luz en la region azul del espectro visible (Caballero et al. 2001).

Teniendo en cuenta que la concentracion de los dos prototipos de bioplaguicidas es 1 x [10.sup.9] CI por g o mL respectivamente, estos se reconstituyeron en agua destilada utilizando 1 g o mL en 1000 mL para una concentracion final de 1 x [10.sup.6] CI/mL. Tambien se preparo una suspension de virus puro sin formular ajustada a la misma concentracion de los prototipos de bioplaguicida reconstituidos. Estas suspensiones se utilizaron para inocular la superficie de tuberculos de papa de tamano parejo (180 [+ o -] 20 g por papa), aplicando con una brocha de 1 pulgada, un volumen de 2 mL por cada cara del tuberculo.

El experimento conto con 19 tratamientos, que consistieron en los tuberculos inoculados con los dos prototipos de bioplaguicidas y el virus puro sin formular, expuestos durante diferentes tiempos a la radiacion UV y un testigo absoluto que consistio en tuberculos no tratados y no expuestos a la radiacion UV.

Una vez inoculadas las papas, estas fueron ubicadas en una cabina de flujo laminar a 60 cm de la fuente de luz UV, utilizando un diseno de bloques que conto con nueve columnas de seis tuberculos, tres columnas para cada tratamiento. Las filas comprendieron los diferentes tiempos de exposicion y las columnas correspondieron a las formulaciones y el virus sin formular. Para la irradiacion se utilizo una lampara Repti Glo 20 que simula la radiacion UV del sol y emite un 33% de UVA y un 8% de UVB; ubicada la lampara a 10 cm de altura, las muestras se expusieron a una intensidad de radiacion ultravioleta tipo B de 250 W/[cm.sup.2]. Los tiempos de exposicion fueron de 0, 2, 4, 6, 8 y 10 horas y cada dos horas se cubrio con papel aluminio la fila de tuberculos correspondiente al respectivo tiempo de exposicion.

Terminada la irradiacion, se pusieron 10 larvas neonatas de T. solanivora sobre cada tuberculo ubicado individualmente en un recipiente plastico de 16 onzas (unidad experimental), para un total de 30 larvas por tratamiento. Los recipientes se taparon e incubaron a una temperatura de 25[grados]C durante 30 dias. Pasado este tiempo se realizo un muestreo destructivo de los tuberculos en busca de las larvas. Se considero como el numero de larvas muertas la suma de los El numero de individuos muertos es igual a la suma de larvas muertas, desaparecidas, larvas vivas con sintomas evidentes de infeccion vital; como individuos vivos se considero la suma de las larvas sanas y las pupas. Los resultados de mortalidad se corrigieron con respecto al tratamiento testigo absoluto, determinando el porcentaje de eficacia mediante la formula de Schneider Orelli (Zar 1999):

Eficacia (%) = (b - k) / (100-k) x 100

Donde b es el porcentaje de mortalidad en el tratamiento y k es el porcentaje de mortalidad del testigo absoluto. Posteriormente se calculo el porcentaje de mortalidad original remanente (% MOR), mediante la formula (Martignoni e Iwai 1985):

MOR (%) = (f/n) x 100

Donde f es el porcentaje de mortalidad obtenido con el tratamiento expuesto a la radiacion UV y n es el porcentaje de mortalidad obtenido con el tratamiento no expuesto.

El diseno experimental fue completamente al azar con medidas repetidas en el tiempo y conto con tres repeticiones por tratamiento. Los resultados se analizaron con el programa SAS 9.1. Estos cumplieron los principios de normalidad y homogeneidad de varianzas, por lo que se sometieron a un analisis de varianza y una prueba de comparacion de medias de Tukey (95%).

Resultados y Discusion

Evaluacion del efecto potenciador del filtro UV. En el tratamiento testigo no se presento mortalidad, por lo que los resultados de los tratamientos restantes no fueron corregidos. Los resultados de mortalidad fueron entonces sometidos a un analisis Probit y para todos los tratamientos, el valor de P fue mayor a 0,05, lo que permitio aceptar la hipotesis propuesta, que sugiere que existe una correlacion lineal entre la dosis y la mortalidad de las larvas.

Las concentraciones letales medias obtenidas para el virus puro, el virus con el fotoprotector al 0,1% y el virus con el fotoprotector al 0,5% fueron de 1,6 x [10.sup.6], 3,0 X [10.sup.5] y 3,0 X [10.sup.4] CI/mL respectivamente, observandose que la [CL.sub.50] del virus con el fotoprotector al 0,1% fue un exponente menor que la del virus puro; cuando el virus se mezclo con el fotoprotector al 0,5%, esta fue dos exponentes menor que la [CL.sub.50] del virus puro y un exponente menor que la del virus mezclado con el fotoprotector al 0,1% (Tabla 1).

Las potencias relativas de los tratamientos y sus respectivos limites de confianza (Tabla 1) evidenciaron diferencias significativas entre estos, mostrando que el fotoprotector CBUV05 tuvo un efecto potenciador de la actividad insecticida del virus, el cual aumento cuando se incremento la concentracion. El efecto de los abrillantadores opticos fue comprobado por Shapiro (1992), cuando evaluaron 23 compuestos de este grupo mezclados con el nucleopoliedrovirus de Lymantria dispar (L., 1758) (Lepidoptera: Lymantriidae) en diferentes concentraciones como 0,1%, 0,25%, 0,5%, y 1%. Se evidencio que a una concentracion del 1% se presento el mejor porcentaje de mortalidad, hasta del 99,3%.

Este grupo de filtros UV ha demostrado tener la capacidad de aumentar la actividad insecticida de algunos virus como el nucleopoliedrovirus de L. dispar, para el cual aumento dos mil veces su actividad con el uso de un abrillantador optico (Caballero et al. 2001). En otro estudio realizado por Argauer y Shapiro (1997), se evaluo el efecto de varios abrillantadores opticos sobre este mismo nucleopoliedrovirus y se confirmo esta actividad, ya que la [CL.sub.50] del virus puro fue de 26.500 CI/ mL y con el uso de abrillantadores opticos como el Blankophor BBH al 1%, esta dislninuyo a 76 CI/mL.

En otro estudio realizado por Martinez et al. (2003) se evidencio tambien el efecto potenciador de los abrillantadores opticos sobre el nucleopoliedrovirus de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae). Las larvas de dicho insecto fueron tratadas con el virus solo, obteniendose un porcentaje de mortalidad del 66,3% y cuando las particulas virales se mezclaron con dos de estos derivados del estilbeno (Blankophor BBH y Calcofluor M2R), la mortalidad aumento hasta el 100%. Sin embargo, en otro estudio realizado por Lasa et al. (2006), se aplico el nucleopoliedrovirus de Spodoptera exigua (Hubner, 1808) (Lepidoptera: Noctuidae) solo, sin formular y mezclado con el abrillantador optico Leucophor AP a plantas ubicadas en un invemadero. Los valores de [CL.sub.50] fueron reducidos de 57,3 CI/[mm.sup.2] cuando el virus se aplico solo, a valores de [CL.sub.50] de 2,29 CI/[mm.sup.2] cuando se incluyo el Leucophor AP.

Durante la ultima decada han surgido diferentes hipotesis sobre el modo de accion de los abrillantadores opticos, todas dirigidas hacia acciones en el intestino medio del insecto. En estudios con el NPV de L. dispar, se encontro que 48 h despues del consumo del virus mezclado con Tinopal LPW, se produjeron perturbaciones fisiologicas que incluyeron la disminucion del pH intestinal, la disminucion en la alimentacion y una disminucion de peso (Caballero et al. 2001). En el trabajo de Okuno et al. (2002) ademas se observo que los abrillantadores opticos incrementan la probabilidad de infeccion del virus, porque inhiben la sintesis de quitina, aumentando la permeabilidad de la membrana peritrofica, y en consecuencia reduciendo la cantidad necesaria de virus para causar infeccion y muerte en las larvas.

Dicho efecto sobre la quitina se considera el principal modo de accion de estas sustancias, debido a que la quitina en la membrana peritrofica actua como un andamio para las proteinas. Sin embargo, tambien se ha observado un efecto debido a la degradacion de la mucina del intestino, principalmente con el uso de Calcofluor M2R (Wang y Granados 2000).

Los resultados permiten concluir que el abrillantador optico evaluado en este estudio tiene un erecto potenciador sobre el aislamiento VG003 de PhopGV, el cual es dependiente de la dosis. Dicho erecto podria mejorar la eficacia de un producto formulado a base de este virus, pero es necesario considerar el costo de esta tecnologia en una linea de produccion comercial.

Ademas de los costos, debe evaluarse el posible impacto ambiental que pueden generar los derivados del estilbeno al ser aplicados masivamente en campo, ya que aunque su potencial de bioacumulacion es muy bajo, dependiendo de la molecula, pueden encontrarse productos de mediana a alta toxicidad para peces y organismos acuaticos, con [CL.sub.50] entre 7 y 100 mg/L. Un factor favorable, es que los abrillantadores opticos son fotodegradados por efecto de reacciones de fotolisis causadas por la luz solar, con vidas medias estimadas en campo de aproximadamente 25 dias. Adicionalmente, aunque estos compuestos no son realmente biodegradables, la biodegradacion puede darse despues de un proceso de aclimatacion de los microorganismos (Kramer 1992).

Determinacion del efecto fotoestabilizador de las formulaciones. La eficacia o mortalidad corregida con respecto al testigo (mortalidad del 6,6%), se redujo significativamente (P < 0.05) cuando el virus sin formular fue irradiado con luz UV a partir de 6 horas de exposicion. La mortalidad causada por el virus puro sin irradiar fue del 90%, mientras que el virus irradiado por 6 horas fue del 26,6%, a las 8 horas del 23,3%, y a las 10 horas del 23,3% (Tabla 2).

El concentrado emulsionable presento una reduccion significativa de la eficacia a partir de 4 horas de exposicion, pues paso de una eficancia del 100% antes de ser expuesto a la luz UV al 66,6% despues de 4 horas de irradiacion. Sin embargo, esta formulacion sigue brindando proteccion al virus, a pesar de haber presentado una reduccion de su eficacia, pues despues de 10 horas de exposicion, su actividad insecticida fue significativamente mayor que la obtenida con el virus puro (Tabla 2). Por el contrario, con el granulado dispersable no se detectaron diferencias significativas entre la actividad insecticida del virus antes y despues de 10 horas de irradiacion, sugiriendo que la formulacion granular fue mas eficiente para la fotoestabilizacion del virus.

En terminos generales, la mortalidad disminuyo en todos los tratamientos con el aumento del tiempo de exposicion, resultado que indica que la radiacion ultravioleta artificial utilizada (UVA y UVB), inactivo el virus formulado y sin formular, pero en los dos casos (GD y CE) el virus formulado se inactivo mas lentamente que el no formulado, posiblemente por efecto de los auxiliares de formulacion utilizados.

De los tres tratamientos, el granulado dispersable presento una menor actividad insecticida antes de la irradiacion, que podria estar relacionada con la composicion particular de este producto, el cual incluye proteinas, carbohidratos y azucares, que se solidifican o cristalizan sobre los cuerpos de inclusion (Tamez et al. 2006), cuando el producto es sometido al proceso de secado, despues de granularlo via humeda. Dichos compuestos polimericos posiblemente formaron matrices de dificil disolucion en el intestino del insecto, que afectaron la liberacion del virus en el sitio de accion y por ende su actividad insecticida. Por esta misma razon, es posible que el granulado dispersable haya presentado una menor inactivacion frente a la radiacion, ya que las particulas virales podrian haberse encapsulado en las matrices polimericas, adquiriendo una cubierta que las protegio del efecto de la luz UV.

Este efecto fotoprotector de las matrices polimericas depositadas sobre la superficie de los cuerpos de inclusion virales fue descrito por Ignoffo y Batzer (1971), quienes microencapsularon el nucleopoliedrovirus de Helicoverpa zea (Boddie, 1850) (Lepidoptera: Noctuidae) con celulosa. El virus microencapsulado fue mas fotoestable y produjo una mortalidad del 60%, en comparacion con el 10% de mortalidad obtenido con el virus sin formular, lo que atribuyeron a la formacion de las microcapsulas.

Otra posible explicacion para la menor actividad inicial del granulado podria ser una heterogenea distribucion de los cuerpos de inclusion virales en la superficie de los tuberculos, relacionada con una inadecuada desintegracion de esta formulacion en el momento de su reconstitucion, debida posiblemente al uso de sustancias aglutinantes como el almidon y a un insuficiente contenido del agente desintegrante.

Con respecto a la mortalidad original remanente (MOR%), se observo que a medida que aumento la exposicion a la radiacion UV, disminuyo significativamente el valor de esta variable para todos los tratamientos (Tabla 2), confirmandose el efecto deletereo de la radiacion UV, el cual es directamente proporcional al tiempo de exposicion. En un estudio similar, Batista et al. (2001) evaluaron la tolerancia a la radiacion UV de dos formulaciones del nucleopoliedrovirus de Anticarsia gemmatalis (Hubner, 1818) (Lepidoptera: Noctuidae). Los tratamientos fueron el virus sin formular y formulado como un concentrado emulsionable. EI porcentaje de mortalidad de larvas obtenido con el virus formulado expuesto a luz UV por 5 minutos fue mayor que el obtenido con el virus sin formular, con un 37% y un 19% respectivamente. En dicho trabajo el concentrado emulsionable protegio al virus de la radiacion, lo que los autores relacionaron con la adicion de aceites vegetales que actuan como fotoestabilizadores y mantienen la actividad de los agentes de biocontrol. Dicho efecto fotoestabilizador de los aceites podria tambien haberse producido con el concentrado emulsionable del granulovirus VG003 evaluado en el presente estudio, cuyo vehiculo es una mezcla de acidos grasos de origen vegetal.

La susceptibilidad a la radiacion ultravioleta de otro aislamiento de PhopGV como el evaluado en el presente trabajo, fue estudiada por Sporleder et al. (2000). En dicho trabajo se determino el tiempo de inactivacion de este granulovirus sin formular, expuesto a la radiacion solar natural en Peru. Despues de la exposicion a luz solar en diferentes meses del ano, el virus se inactivo alrededor del 99% en un intervalo de 2,56 min a 4,53 min, dependiendo del mes de exposicion y del incremento de la energia.

La inactivacion causada por la luz solar sobre los virus entomopatogenos no se ha evidenciado solamente para PhopGV sino para una gran cantidad de especies y aislamientos virales. Tal es el caso del nucleopoliedrovirus de Heliothis virescens (Fabricius, 1977) (Lepidoptera: Noctuidae), el cual despues de una exposicion de 16 horas a la luz solar simulada, presento una actividad original remanente del 26% (Ignoffo et al. 1989).

Una de las alternativas mas estudiadas para la fotoproteccion de los virus ha sido la utilizacion de sustancias que absorben o reflejan la luz UV. Por ejemplo, en el trabajo realizado por Martignoni e Iwai (1985) se evaluaron siete absorbentes para la proteccion del nucleopoliedrovirus de Lymantria dispar, obteniendose una proteccion entre el 59,39% y el 100% cuando el virus fue mezclado con lignosulfonato a una concentracion del 6,28%. En otro trabajo, Shapiro (1992) evaluo 23 abrillantadores pertenecientes a diferentes grupos quimicos (estilbenos, oxazoles, pirazoles y acido natalico), encontrando que la mejor proteccion se consiguio con los estilbenos: Leucophor BSB, Phorwithe AR, Intrawite CF, Leucophor BS, Phorwite BRU, Phorwite BKL, Phorwite CL, y Tinopal LPW, los cuales a una concentracion del 1% proporcionaron una proteccion total, con un porcentaje de actividad original remanente del 100%.

Las dos formulaciones evaluadas en el presente estudio incluian un protector ultravioleta del grupo de los derivados del estilbeno, que podria haber jugado un papel fundamental en los resultados de fotoestabilidad obtenidos con los dos productos. Sin embargo, los demas componentes utilizados como carbohidratos, silicatos, aceites vegetales, proteinas y tensioactivos, posiblemente tambien contribuyeron en alguna proporcion en la proteccion del virus frente a la radiacion UV.

Los resultados del trabajo evidenciaron que el fotoprotector CBUV05 incluido en las dos formulaciones, tiene un efecto potenciador de la actividad insecticida del aislamiento de granulovirus VG003, el cual podria ser util para reducir las dosis de aplicacion en campo, haciendo mas rentable el uso de este agente de control biologico. Tambien se observo que las dos formulaciones elaboradas con dicho aislamiento viral, incluyendo el filtro CBUV05, fotoestabilizaron al virus, lo que se evidencio en una reduccion de la velocidad de inactivacion durante la irradiacion luz UV artificial. Sin embargo, antes de la exposicion a la luz UV, el granulado dispersable presento una menor actividad insecticida, por lo que se selecciono el concentrado emulsionable para continuar con la fase de optimizacion de la formulacion y posteriormente iniciar los ensayos en campo.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural por el apoyo financiero para el desarrollo del presente trabajo y a Bayer S.A. por la donacion del abrillantador optico.

Recibido: 2-sep-2009 * Aceptado: 8-may-2010

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MARTHA CHAPARRO, Microbiologa Industrial, Laboratorio de Control Biologico, Centro de Biotecnologia y Bioindustria, Corpoica. mchaparro@corpoica.org.co.

CARLOS ESPINEL C., Investigador, M. Sc. Entomologia, Laboratorio de Control Biologico, Centro de Biotecnologia y Bioindustria, Corpoica, C.I. Tibaitata. cespinel@corpoica.org.co.

ALBA MARINA COTES P., Ph. D. Fitopatologia. Directora del Laboratorio de Control Biologico, Centro de Biotecnologia y Bioindustria, Corpoica, C.I. Tibaitata, acotes@corpoica.org.co.

LAURA VILLAMIZAR R., Ph. D. Ciencias Farmaceuticas, Investigadora, Laboratorio de Control Biologico, Centro de Biotecnologia y Bioindustria, Corpoica, C.I. Tibaitata, lvillamizar@corpoica.org.co. Autora para correspondencia.
Tabla 1. Resultados del analisis Probit del ensayo
concentracion-mortalidad para el virus puro y mezclado
con el fotoprotector al 0,1% y al 0,5%.

Tratamiento                  [CL.sub.50]         Potencia    Limite de
                               (CI/ml)           relativa    confianza
                                                              inferior

Virus Puro                 1,6 x [10.sup.6]         1.0         --

Virus con                  3,0 x [10.sup.5]         5.3          3.4
fotoprotector al 0.1%

Virus con                  3,0 x [10.sup.4]        53.3         40.9
Fotoprotector al 0.5%

Tratamiento               Limite de      [ji al        Valor P
                          confianza     cuadrado]
                          superior

Virus Puro                   --           0.505         0.917

Virus con                    12.4         0.418         0.936
fotoprotector al 0.1%

Virus con                   131.6         0.173         0.981
Fotoprotector al 0.5%

Tabla 2. Efecto de la radiacion UV sobre la eficacia, inactivacion y
mortalidad original remanente de las dos formulaciones a base del
granulovirus  VG003. Tratamientos con la misma letra no presentan
diferencias significativas segun prueba de Tukey (95%).

                                                     Inactivacion
Tratamiento       Tiempo (h)       Eficacia (%)           (%)

Granulado              0               70.0               0.0
dispersable            2               56.6              19.0
                       4               56.6              19.0
                       6               53.3              23.8
                       8               53.3              23.8
                      10               46.6              33.3

Concentrado            0              100.0               0.0
emulsionable           2               80.0              20.0
                       4               70.0              30.0
                       6               66.6              33.3
                       8               60.0              40.0
                      10               60.0              40.0

Virus puro             0               90.0               0.0
                       2               86.6               3.7
                       4               80.0              11.1
                       6               26.6              70.3
                       8               23.3              70.0
                      10               23.3              70.0

                                                        Grupos
                                                      homogeneos
Tratamiento       Tiempo (h)          MOR (%)            (95%)

Granulado              0              100.0               bed
dispersable            2               80.9               cd
                       4               80.9               cd
                       6               76.1                d
                       8               76.1                d
                      10               66.6                d

Concentrado            0              100.0                a
emulsionable           2               80.0               abc
                       4               70.0               bed
                       6               66.6               bed
                       8               60.0               cd
                      10               60.0               cd

Virus puro             0              100.0               ab
                       2               96.2               ab
                       4               88.8               abc
                       6               29.6                e
                       8               25.9                e
                      10               25.9                e
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Author:Chaparro, Martha; Espinel C., Carlos; Cotes P., Alba Marina; Villamizar R., Laura
Publication:Revista Colombiana de Entomologia
Date:Jan 1, 2010
Words:5956
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