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Fitorremediacion de suelos con benzo(a)pireno mediante microorganismos autoctonos y pasto aleman Echinochloa polystachya (H.B.K.) Hitchc.

Phytoremediation of soils polluted with Benzo(A)Pyrene using indigenous microorganisms and creeping rivergrass Echinochloa polystachya (H.BX.) Hitchc.

RESUMEN. La capacidad del pasto aleman (Echinochloa polystachya) asociado a poblaciones autoctonas de bacterias y hongos para limpiar suelos contaminados con benzo(a)pireno fue evaluada. Se realizo un experimento en invernadero con un arreglo factorial 2x4x2 en un diseno completamente al azar y cuatro repeticiones por tratamiento: (1) suelos con cero ([menor que o igual a] 0.0002 mg [kg.sup.-1]) y 100 mg [kg.sup.-1] de benzo(a)pireno, (2) cuatro tipos de inoculos (sin microorganismos, con bacterias, con hongos, y con asociacion bacterias-hongos), y (3) dos del pasto aleman (con rizosfera y sin rizosfera). La medicion de bacterias y hongos se realizo con el metodo de recuento en cajas Petri. La extraccion del benzo(a)pireno se efectuo con el procedimiento del metodo EPA 3540C, utilizando hexano y acetona en proporcion 70:30. Para el control de calidad, a cada 10 muestras experimentales se utilizaron una muestra testigo (con [menor que o igual a] 0.0002 mg [kg.sup.-1] de BaP determinado con el metodo EPA 8270D) y un blanco. La limpieza de la muestra se baso en el procedimiento del metodo EPA 3630C. La degradacion del benzo(a)pireno en las muestras de suelo se determino por espectrofotometria UV/visible a 381 mm, y la produccion de biomasa vegetal por peso seco. Las bacterias, los hongos y la asociacion bacterias-hongos registraron poblaciones mayores a los 60 dias y significativamente diferentes (p = 0.05) entre los tratamientos con rizosfera del pasto aleman en suelo con 100 mg [kg.sup.-1] de benzo(a)pireno. Las poblaciones maximas fueron de 7x[10.sup.9] unidades formadoras de colonias (UFC) de bacterias [g.sup.-1] de suelo seco y de 2x[10.sup.6] UFC de hongos. En la asociacion, la poblacion de bacterias disminuyo una unidad y los hongos aumentaron una unidad exponencial. La biodegradacion del BaP a los 120 dias fue significativamente mayor (p = 0.05) en suelo rizosferico inoculado con la asociacion bacterias-hongos. Esta degradacion removio hasta el 66.5% del BaP. La produccion de materia vegetal seca fue significativamente mayor (p = 0.05) en suelo con BaP, y con el inoculo de los hongos Paeci1omyces sp y Trichoderma sp se promovio la produccion de biomasa hasta con un incremento de 48.3% con respecto al testigo.

Palabras clave: BaP, biodegradacion, biomasa vegetal, organismos autoctonos, pasto aleman, unidades formadoras de colonias.

ABSTRACT. Creeping rivergrass (Echinochloa polystachya) associated with indigenous populations of bacteria and fungi was evaluated with respect to its capacity to clean soils polluted with benzo(a)pirene. A greenhouse experiment was carried out with a 2x4x2 factorial arrangement and a completely random design with four repetitions per treatment: (1) soils with zero ([less than or equal to] 0.0002 mg [kg.sup.-1]) and 100 mg [kg.sup.-1] of benzo(a)pirene, (2) four types of inoculi (without microorganisms, with bacteria, with fungi, with a bacteria-fungi association), and (3) two types of creeping rivergrass (with rhyzosphere, without rhyzosphere). Bacteria and fungi were counted on Petri dishes. The extraction of benzo(a)pirene was done following the EPA 3540C method, with hexane and acetone at a ratio of 70:30. A control sample was used after every 10 experimental samples (with [less than or equal to] 0.0002 mg [kg.sup.-1] of BaP determined by the EPA 8270D method), together with a blank, for quality control. The cleanliness of the sample was determined by the EPA 3630C method. The breakdown of benzo(a)pirene in the soil samples was determined by UV/visible spectrophotometry at 381 nm, and the production of plant biomass was measured as dry weight. The bacteria, the fungi and the bacteria-fungi association recorded greater populations after 60 days and were significantly different (p = 0.05) among the treatments with creeping rivergrass and rhyzosphere on soil with 100 mg [kg.sup.-1] of benzo(a)pirene. The greatest populations included 7x[10.sup.9] colony forming units (CFU) of bacteria [g.sup.-1] of dry soil and 2x[10.sup.6] CFU of fungi. Within the bacteria-fungi association, the population of the bacteria decreased one exponential unit and that of the fungi increased one exponential unit. The bio-breakdown of BaP after 120 days was significantly greater (p = 0.05) in the rhyzospheric soil that was inoculated with the bacteria-fungi association. This breakdown removed up to 66.5% of the BaP. The production of dry plant material was significantly greater (p = 0.05) in soil with BaP, and the inocule of the fungi Paecilomyces sp and Trichoderma sp promoted the production of biomass with an increase of up to 48.3 % with respect to the control.

Key words: BaP, bio-breakdown, plant biomass, indigenous organisms, creeping rivergrass, colony forming units.

INTRODUCCION

La combustion incompleta de basura, madera, carbon o productos derivados del petroleo produce el benzo(a)pireno (BaP), que es un producto secundario indeseado de la combustion, particularmente cuando la temperatura es muy baja, e impide el consumo total del combustible (Harte et al. 1995). El BaP es un compuesto formado por cinco anillos bencenicos, con peso molecular de 252 g [mol.sup.-1] y de muy poca solubilidad (0.003 mg por cada litro de agua). El BaP es el hidrocarburo aromatico policiclico (HAP) mas genotoxico de la lista de 16 hidrocarburos segun la Agencia de Proteccion Ambiental (Cerniglia 1992). El BaP es inocuo de manera intrinseca, pero es toxico cuando es bioactivado por las enzimas monooxigenasas y dioxigenasas que al oxidar la posicion 7, 8, 9, 10 y 11 de la molecula, se forman metabolitos intermedios con propiedades carcinogenicas y mutagenicas en celulas de mamiferos y de bacterias (Pothuluri & Cerniglia 1994).

Las fuentes antropicas mas importantes de BaP son la combustion incompleta del petroleo crudo y la quema de areas forestales (Edwards 1983; Sims & Overcash 1983; Joner et al. 2002). Sin embargo, en el estado de Tabasco se ha encontrado BaP en suelos alejados de instalaciones petroleras (Cram et al. 2004). Tambien el BaP es un componente del petroleo crudo, cuya concentracion es variable segun el tipo: los petroleos mediano y pesado contienen hasta 20 mg [kg.sup.-1] (Dorn et al. 1998).

El BaP y los HAP pueden ser mineralizados en la rizosfera vegetal (Reilley et al. 1996; Binet et al. 2000) o ser absorbidos y acumulados en las raices de las plantas (Lee & Banks 1993) para su metabolismo y volatilizacion. En varios estudios se ha investigado la importancia de las interacciones de los microorganismos rizosfericos en la degradacion de los HAP. Asi por ejemplo, cuando existen condiciones de estres en el suelo por presencia de hidrocarburos las plantas pueden modificar la exudacion de los compuestos rizosfericos y tambien modificar la poblacion de microorganismos (Rivera-Cruz 2001). El aumento de la degradacion de los HAP en la rizosfera se relaciona con el incremento de las poblaciones microbianas (Barber & Linch 1977). Walton et al. (1994) identificaron el incremento de los consorcios rizosfericos y de su actividad en suelos contaminados. Una coincidencia de los resultados de estas investigaciones fue que la concentracion de los HAP disminuyo mas en suelos rizosfericos que en suelo sin planta.

Los pastos han sido utilizados en pruebas experimentales con resultados satisfactorios en la descontaminacion de suelos con HAP (Aprill & Sims 1990; Binet et al. 2000; Liste & Alexander 2000 a; 2000 b). La estimulacion de las poblaciones microbianas presentes en la rizosfera promueve la descontaminacion de suelos mediante la solubilizacion, oxidacion, co-oxidacion y el cometabolismo de las sustancias toxicas (Rosenberg & Ron 1996). Las plantas que restauran suelos contaminados son denominadas especies fitorremediadoras (Bierkens et al. 1998). La tolerancia vegetal a los HAP en el suelo evidencia la factibilidad de utilizar las plantas en tecnologias de fitorremediacion de suelos. Estudios previos realizados in vitro con cuatro cepas de bacterias y tres de hongos rizosfericos, aislados de dos pastos localizados en suelos contaminados con petroleo en el estado de Tabasco, registraron tasas elevadas de crecimiento y de biomasa en presencia de 100 mg [kg.sup.-1] de BaP (Rivera-Cruz et al. 2002 a). Estos resultados sustentan el presente experimento en invernadero dirigido a identificar las interacciones entre el pasto aleman, las cepas nativas y el BaP. Los objetivos fueron: 1) probar si la rizosfera del pasto aleman, junto con el BaP, modifica el tamano de las poblaciones de las bacterias y hongos; 2) demostrar si la inoculacion de bacterias y hongos en suelo con rizosfera del pasto aleman reduce la concentracion de BaP, y 3) evaluar la respuesta de la produccion de biomasa del pasto aleman al inoculo de bacterias y hongos en suelos con y sin BaP.

MATERIAL Y METODOS

Suelo, microorganismos y produccion de plantulas

El suelo utilizado en invernadero se recolecto del horizonte superficial Op (0-24/25 cm) de un Gleysol histi-orthieutrico (abrupti co) (Rivera-Cruz 2004), localizado en el ejido Hermenegildo Galeana Tercera Seccion, municipio de Teapa, Tabasco (17 [grados] 40 ' 58 "N y 93 [grados] 00 ' 45 [grados] 0). En el sitio de recoleccion del suelo la temperatura media anual vario de 24 a 26 [grados]C, la precipitacion total anual oscilo de 3 500 a 4 000 mm y el tipo de clima es Af(m) (Anonimo 2001). El suelo registro un pH1:2.5 en agua de 5.1, 155 mg [kg.sup.-1] de N inorganico (N[O.sub.3.sup.-] y N[H.sub.4.sup.+]), 1.31 mg [kg.sup.-1] de P Olsen, 0.40 [cmol.sup.+] [kg.sup.-1] de K intercambiable, 28.3% de materia organica, 18.7 de arcilla, y textura franco limosa. El contenido basal de BaP fue menor o igual a 0.0002 mg [kg.sup.-1] base seca, determinado por duplicado mediante el metodo EPA 8270D (Anonimo 1998). Este analisis cromatografico se realizo en un laboratorio acreditado por la Entidad Mexicana de Acreditacion, A. C. Los microorganismos utilizados fueron cuatro cepas de bacterias y dos de hongos aisladas de las rizosferas de los pastos aleman (Echinochloa polystachya) y cabezon (Paspalum virgatum L.) localizados en un Gleysol histi-sodico (abruptico) (Rivera-Cruz 2004) con 323 000 mg [kg.sup.-1] de hidrocarburos totales del petroleo en el campo petrolero La Venta, Tabasco (Rivera-Cruz et al. 2002 b). Las cuatro cepas de bacterias fueron identificadas como CT11, CT16, CT26 y AT4 (C de cabezon, A de aleman y T de Tabasco). Los hongos Trichoderma sp y Paecilomyces sp fueron aislados de la rizosfera del pasto cabezon. Estas cepas se aclimataron y crecieron in vitro en sustratos enriquecidos con BaP (Rivera-Cruz et al. 2002 a). El pasto aleman usado se recolecto de un Gleysol histidistrico (abruptico) (Rivera-Cruz 2004) con 115 000 mg [kg.sup.-1] de HTP en el horizonte superficial Op (0-20/25 cm) en el campo petrolero La Venta, Tabasco. El pasto se planto en contenedores de plastico en suelo sin BaP en invernaderos del Colegio de Postgraduados, Montecillo, Estado de Mexico, para su aclimatacion durante seis meses. De los tallos maduros se seleccionaron vastagos de 5 cm de longitud con yemas maduras. Con este material se establecio un almacigo en charolas de unicel 30 dias antes del inicio del experimento.

Diseno experimental

El diseno experimental fue completamente al azar con 16 tratamientos y cuatro repeticiones, con arreglo de tres factores completos: 1) dos niveles de concentracion de BaP [0([menor que o igual a] 0.0002) y 100 mg [kg.sup.-1] base seca], 2) cuatro niveles de tipo de microorganismos tolerantes a BaP: testigo, con cuatro cepas de bacterias (CT11, CT16, CT26 y AT4), con dos cepas de hongos (Paecilomyces sp y Trichoderma sp) y con la asociacion de las seis cepas de bacterias y de hongos, y 3) dos niveles de planta: sin rizosfera (tratamiento sin planta) y con rizosfera (tratamiento con planta). La unidad experimental fue un contenedor de vidrio (recipiente de 17 cm de altura y 10 cm de diametro) con 450 g de suelo esteril (calor humedo a 121 [grados]C en autoclave a 1.3 kg [cm.sup.-2] durante 4 h). Los tratamientos con BaP se prepararon con 0 g y 0.045 g de BaP para obtener concentraciones de 0 y 100 mg de BaP por kg de suelo seco, respectivamente. El BaP utilizado fue 3-4-benzopireno grado HPLC con minimo 97% de pureza (Sigma B-7-1760). El contenedor de vidrio se esterilizo con alcohol etilico 96%, el BaP se diluyo en 25 ml de acetona y se adiciono al suelo, se homogeneizo con una varilla esterilizada de vidrio. El contenedor con el suelo +BaP se dejo abierto durante 12 h para permitir la volatilizacion de la acetona. Para la asociacion de las cuatro cepas de bacterias y las dos cepas de hongos se agregaron 2 ml de inoculo de microorganismos. Para la asociacion de las seis cepas se agregaron 4 ml de cultivo con bacterias y hongos. Cada tratamiento con pasto aleman se establecio con dos plantulas por unidad experimental, y a los 20 dias se elimino una. Cada 24 h se realizo mediante gravimetria el calculo de la humedad del suelo, se adiciono agua destilada para mantener la humedad del suelo entre 19 y 26 %. Las variables evaluadas fueron poblaciones de bacterias y hongos (UFC), degradacion de BaP (mg [kg.sup.-1] suelo seco) y produccion de biomasa vegetal (g).

Poblaciones de bacterias, hongos y degradacion de benzo(a)pireno

A los 60 y 120 dias se muestrearon de 25 a 30 g de suelo por unidad experimental con un tubo de vidrio esterilizado (1 cm de diametro). El muestreo se realizo en cinco puntos de cada unidad experimental (a 1.5 cm de distancia del tallo en las unidades experimentales con rizosfera del pasto aleman). La muestra para medir las poblaciones de bacterias y hongos se preservo a 4 [grados]C durante una semana y a 0 [grados]C por 10 dias para medir el BaP. Esta medicion (UFC por gramo de suelo seco) se realizo con la tecnica de recuento en placa de agar (Ingraham & Ingraham 1998). Diez gramos de cada muestra se extrajeron y se realizaron diluciones decimales seriadas para bacterias de 1x[10.sup.1] a 1x[10.sup.8] y para hongos de 1x[10.sup.1] a 1x[10.sup.4]. Se extrajo 0.1 ml de cada dilucion y se disperso-sembro en cajas Petri con medio de cultivo selectivo. Para bacterias se utilizo carbon combinado modificado y para hongos celulosa agar modificado (Rivera-Cruz et al. 2002 a). La incubacion se realizo a 28 [grados]C durante 72 h para hongos y 120 h para bacterias. La degradacion del BaP se midio con la concentracion disipada de BaP. La extraccion se realizo con el metodo EPA 3540C (Anonimo 1996 a), se utilizaron los solventes hexano (Allied Signal Burdick & Jackson grado HPLC) y acetona (J. T. Baker reactivo) en proporcion 70:30, respectivamente. La extraccion se realizo en equipo soxhlet (Colombo-Mantle) durante 12 h. Para el control de la calidad se utilizaron una muestra testigo del suelo ([menor que o igual a] 0.0002 mg [kg.sup.-1] de BaP, base seca) y un blanco (sin BaP), ambos fueron utilizados por cada 10 muestras de suelo del experimento. La limpieza del extracto se realizo en columna con silica gel (Baker para analisis), floricil (Baker para analisis) y sulfato de sodio anhidro (Baker para analisis). El percolado se aforo a 50 ml con acetona de acuerdo con el metodo EPA 3630C (Anonimo 1996 b). Los extractos fueron analizados en un espectrofotometro Perkin Elmer con detector UV/visible y la lectura se realizo a 381 nm. La sensibilidad del equipo fue 2.5 mg [I.sup.-1]. La recuperacion del BaP vario de 85 a 92%.

Biomasa vegetal

A los 120 dias de la siembra de las plantulas se evaluo la produccion de materia seca de la parte aerea y de la raiz de la planta. El material vegetal se cosecho y se seco a 70 [grados]C durante 48 h. La materia seca total fue la suma del peso seco de las biomasas aerea y radical.

Analisis estadistico

El analisis estadistico se baso en el analisis de varianza de las medias de los tratamientos. La prueba de medias se realizo mediante la prueba de Tukey (p = 0.05) se aplico con el paquete estadistico SAS (Anonimo 1989).

RESULTADOS

Poblaciones de bacterias y hongos

El analisis de varianza de la poblacion total de bacterias en suelos rizosfericos resultaron significativamente mayores (p = 0.05) que en suelos no rizosfericos tanto a los 60 como a los 120 dias (Figura 1). El BaP y el sistema rizosferico del pasto aleman aumento la poblacion total de bacterias. La poblacion mas grande a los 60 dias fue 7x[10.sup.9] UFC [g.sup.-1] de suelo seco, ocurrio en suelo rizosferico con 100 mg [kg.sup.-1] de BaP. Esta poblacion fue mayor que la poblacion de bacterias del suelo con 100 mg [kg.sup.-1] de BaP, pero sin rizosfera, con 3x[10.sup.8] UFC. A los 120 dias el comportamiento de las poblaciones fue similar que a los 60 dias pero disminuyo hasta dos unidades logaritmicas. La rizosfera con 100 mg [kg.sup.-1] de BaP tuvo la mayor poblacion con 3x[10.sup.7] UFC, fue mayor que la poblacion de bacterias en suelo no rizosferico y con 100 mg [kg.sup.-1] de BaP. Las poblaciones de bacterias disminuyeron de manera consistente a los 120 dias, por lo tanto la biodisponibilidad del carbono del BaP a los 120 dias puede ser menor para las bacterias, lo que evidencia menor poblacion (Figura 1). Esta disminucion fue menos acentuada en la poblacion total de hongos (Figura 2). Las poblaciones de los hongos inoculados tuvieron diferencias estadisticas (p = 0.05) a los 60 y 120 dias (Figura 2). La mayor poblacion a los 60 dias se encontro en suelo rizosferico con BaP con 2x[10.sup.6] UFC [g.sup.-1] de suelo seco, y menos (1x[10.sup.6] UFC) en suelo rizosferico sin BaP. A los 120 dias la poblacion de hongos disminuyo en todos los tratamientos. La poblacion mas grande (p = 0.05) se midio en el suelo inoculado, con planta de pasto aleman y con BaP (6x[10.sup.5] UFC), tres mas tuvieron la misma unidad logaritmica pero con seis veces menor poblacion (1x[10.sup.5] UFC). La ausencia del carbono del BaP en el tesstigo aparentemente fue reemplazada por el carbono de los exudados organicos de las raices. A los 120 dias se aislo principalmente el hongo Trichoderma sp, esto indica que el hongo Paecilomyces sp puede ser mas sensible al BaP o que es menos eficiente para utilizar el carbono del BaP. La ausencia de bacterias en el inoculo sugiere la falta de relaciones de parasitismo y depredacion en el suelo, que normalmente ocurre cuando existe el consorcio de bacterias y hongos.

[FIGURA 1-2 OMITIR]

Las medias de las poblaciones de bacterias asociadas con las poblaciones de hongos fueron diferentes entre si (p = 0.05) (Figura 3). La poblacion mas grande a los 60 dias fue de 9x[10.sup.7] UFC [g.sup.-1] de suelo seco rizosferico + BaP. Es evidente que la rizosfera del pasto aleman promovio el crecimiento de las poblaciones de bacterias, aunque no se haya inoculado. La presencia de bacterias en suelos no inoculados puede estar relacionado con la diseminacion de esporas a traves del aire. A los 120 dias las poblaciones de bacterias disminuyeron en la mayoria de los tratamientos, pero tuvieron similar respuesta estadistica que a los 60 dias (Figura 3). El BaP promovio las poblaciones de bacterias en el sistema rizosferico del pasto aleman, en cambio la falta de rizosfera redujo la poblacion de bacterias en todos los tratamientos. Las poblaciones de hongos asociados con bacterias fueron diferentes (p = 0.05) a los 60 y 120 dias (Figura 4). Las poblaciones a traves del tiempo disminuyeron. A los 60 dias se encontro que la mayor poblacion fue 2x[10.sup.6] UFC de hongos en suelo rizosferico con bacterias, hongos y con BaP. Estos datos muestran que el efecto rizosfera estimulo el incremento de la poblacion de los hongos. A los 120 dias la poblacion mas grande se encontro nuevamente en el suelo rizosferico y con BaP, con 1x[10.sup.5] UFC [g.sup.-1] de suelo seco. El efecto rizosfera origino mayor cantidad de hongos en todos los tratamientos. Otro factor que parece ser promovio la mayor poblacion de hongos fue el potencial hidrogeno fuertemente acido (5.1 en agua) de la solucion del suelo del experimento, lo que puede ser una condicion favorable para las actividades metabolicas de los hongos.

[FIGURA 3-4 OMITIR]

Degradacion del benzo(a)pireno

La degradacion del BaP a los 60 y 120 dias tuvo diferencias estadisticas (p = 0.05) (Figura 5). El consorcio de hongos y el consorcio de bacterias +hongos inoculados en suelo rizosferico tuvieron la mayor capacidad para la degradacion de los 100 mg de BaP a los 60 y 120 dias (Figura 5). La degradacion del BaP a los 60 dias fue estadisticamente igual en los suelos rizosfericos inoculados con hongos y con el consorcio bacterias+hongos, la degradacion fue 40 y 38.6%, respectivamente. A los 120 dias la mayor degradacion (66.5 %) sucedio en el suelo rizosferico inoculado con bacterias y hongos. Se observo a los 120 dias una respuesta lineal de la degradacion, el coeficiente de correlacion tuvo asociacion significativa entre el tamano de la poblacion de bacterias+hongos y el por ciento de la degradacion, el valor fue r = 0.92.

[FIGURA 5 OMITIR]

Produccion de biomasa vegetal

La Figura 6 muestra las diferencias estadisticas (p = 0.05) de la produccion de materia seca total (biomasa aerea + radical) del pasto aleman a los 120 dias con dos concentraciones de BaP y con inoculos de bacterias y hongos. El BaP estimulo la produccion de biomasa total, aunque en terminos estadisticos todos los tratamientos fueron iguales, excepto el tratamiento testigo que produjo la menor cantidad de materia seca (Tabla 1, Figura 6). La mayor produccion de materia seca fue 14.79 g, fue en el tratamiento con hongos y 100 mg [kg.sup.-1] BaP, fue 48.3% mayor que el testigo. La acumulacion de nitrogeno en las plantas de pasto aleman (datos no publicados) en suelo con BaP fue el doble que en el suelo sin BaP, esto sugiere mayor disponibilidad del nitrogeno, posiblemente por el efecto de una enzima liberada por los microorganismos, o probablemente las raices secundarias tuvieron menor capacidad de adsorcion de este elemento quimico que estimula el crecimiento vegetal.

[FIGURA 6 OMITIR]

DISCUSION

Las diferencias estadisticas entre los tratamientos se debieron priincipalmente por el efecto rizosferico del pasto aleman y tambien por la presencia del carbono del benzo(a)pireno que promovio el crecimiento de las poblaciones de las bacterias y hongos. Los resultados obtenidos coinciden con los de Gunther et al. (1996), quienes encontraron que la presencia de HAP en el suelo incrementa el tamano de la comunidad microbiana en el suelo rizosferico del pasto Lolium perenne respecto a suelo solo. Binet et al. (2000) determinaron tambien mayor numero de microorganismos degradadores de HAP en el sistema rizosferico de Lolium perenne. El aumento de las poblaciones de bacterias en la rizosfera del pasto aleman puede estar relacionado con la adaptacion previa in vitro de las cuatro cepas de bacterias al BaP (Rivera-Cruz et al. 2002 a). Las poblaciones de bacterias disminuyeron de manera consistente a los 120 dias, esto coincide con registros de que las bacterias tienen menor habilidad que los hongos para mineralizar HAP con pesos moleculares grandes (Lesage et al. 1997) y para el BaP (Munnecke & Huysmans 1998), por lo tanto la biodisponibilidad del carbono del BaP a los 120 dias puede ser menor para las bacterias, lo que evidencia menor poblacion. Esta disminucion fue menos acentuada en la poblacion de los hongos porque tienen mayor capacidad enzimatica que las bacterias para la mineralizacion de los HAP con estructuras grandes (Harayama, 1997; Munnecke Huysmans 1998). Al igual que en una investigacion realizada con petroleo crudo (Rivera-Cruz et al. 2004), se encontro que cuando las bacterias se asocian con hongos, las poblaciones de bacterias fueron mas pequenas. Esta disminucion puede ser originada por las relaciones de parasitismo o depredacion que proporciona beneficios al hongo (Alexander 1994; Thorn 1997).

El efecto rizosfera origino mayor cantidad de hongos en todos los tratamientos, resultados similares obtuvieron Gunther et al. (1996) y Binet et al. (2000) en pasto Lolium perenne. El potencial hidrogeno de la solucion del suelo del experimento fue fuertemente acido (5.1 en agua), fue una condicion favorable para las actividades metabolicas de los hongos (Alexander 1994).

Banks et al. (1999) determinaron 56% de degradacion del BaP en suelo rizosferico del pasto Festuca arundinacea. A los 120 dias la mayor degradacion (66.5 %) sucedio en el suelo rizosferico inoculado con bacterias y hongos. A los 120 dias se observo una respuesta lineal de la degradacion, el coeficiente de correlacion tuvo asociacion significativa entre el tamano de la poblacion de bacterias + hongos y el por ciento de la degradacion, el valor fue r = 0.92. Esta relacion positiva se puede atribuir a que estos microorganismos antes de inocularlos fueron adaptados en condiciones in vitro en el uso del BaP como fuente de carbono y energia (Rivera-Cruz et al. 2002 a). La mayor degradacion del BaP, aunque fue causada por los consorcios en el suelo rizosferico del pasto aleman, tambien pudo ser influida por los siguientes factores:(1) la naturaleza hidrofobica del BaP esta asociada con las particulas de la materia organica, la cual puede retardar significativamente la biodegradacion del BaP (Karimi et al. 1996), (2) la degradacion tambien puede ser disminuida por el efecto de la adsorcion del BaP en los nanoporos de los agregados del suelo (Pignatello & Xing 1996), que ningun solvente puede extraer, (3) la humificacion y adsorcion en la rizosfera (Banks et al. 1999; Binet et al. 2000), (4) la fotodegradacion y la evaporacion que pueden aumentar la degradacion del BaP (Cerniglia 1992) y (5) la formacion de metabolitos intermedios (Cerniglia 1992; Pothuluri Cerniglia 1994; Binet et al. 2000), que son medidos en diferente longitud de onda que el BaP.

La mayor produccion de materia seca (14.79 g) fue en el tratamiento con hongos y 100 mg [kg.sup.-1] BaP y resulto 48.3% mayor que el testigo. Wild & Jones (1992) encontraron 33% mayor produccion de biomasa de zanahoria cuando las plantas crecieron en sedimentos con 185 g [kg.sup.-1] de 13 HAP, entre ellos el BaP. El incremento fue 8 cuando la planta se expuso a 379 g [kg.sup.-1] de HAP, y la exposicion a 808 g [kg.sup.-1] HAP no origino diferencias estadisticas respecto al tratamiento testigo. Resultados contrarios obtuvieron Binet et al. (2000), quienes encontraron que el efecto por separado de 50 y 200 mg [kg.sup.-1] de ocho HAP, no incluido el BaP, originaron efectos restrictivos hasta de 50% en la produccion de materia seca aerea y radical en el pasto Lolium perenne. El efecto positivo del BaP en la produccion de materia seca del pasto aleman puede estar relacionado con la mayor elongacion de las raices por expansion de celulas, que por division celular, como ha sido identificado en plantas de lechuga (Ren et al. 1996).

Ademas, Bossert & Bartha (1986) y Salanitro et al. (1997) registraron que ciertos hidrocarburos o sus metabolitos tienen la capacidad de simular auxinas naturales que promueven el crecimiento vegetal. La acumulacion de nitrogeno en las plantas de pasto aleman en suelo con BaP fue el doble que en el suelo sin BaP(datos no publicados). Esto sugiere mayor disponibilidad del nitrogeno, posiblemente por el efecto de una enzima liberada por los microorganismos, o probablemente las raices secundarias tuvieron menor capacidad de adsorcion de este elemento quimico que estimula el crecimiento vegetal.

Los efectos de la rizosfera del pasto aleman y del BaP fueron significativos en cuanto al tamano de las poblaciones de las bacterias, de los hongos y de la asociacion bacterias-hongos. La disminucion de la concentracion del BaP a los 120 dias fue significativa por el efecto de la asociacion bacterias-hongos y por la rizosfera del pasto aleman, esto confirma la mayor efectividad en la descontaminacion del suelo que las poblaciones individuales. El BaP tuvo efectos positivos en la produccion de biomasa del pasto aleman y en el tamano de las poblaciones de bacterias y hongos. La produccion de biomasa vegetal fue mayor hasta 48.3 (comparado con el testigo) en suelo inoculado con hongos y con BaP. La restauracion del suelo mediante asociaciones de bacterias y hongos nativos y pastos forrajeros, es una alternativa viable para la limpieza de suelos contaminados con BaP, pero deben realizarse estudios para identificar tanto las causas del incremento de la biomasa vegetal, como para determinar la posible absorcion de BaP en la planta.

LITERATURA CITADA

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M del C Rivera-Cruz, A Trujillo-Narcia, R Ferrera-Cerrato, R Rodriguez-Vazquez, V Volke-Halier, P Sanchez-Garcia, L Fernandez-Linares

(MCRC) Programa en Produccion Agroalimentaria en el Tropico, Campus Tabasco, Colegio de Postgraduados Periferico Carlos A. Molina s/n Km 3.5, CP 86570, H. Cardenas, Tabasco. Mexico. (ATN) Campus Tabasco, Universidad Autonoma de Guadalajara. Mexico. (RFC) (VVH) (PSG) Programa de Edafologia. Colegio de Postgraduados, Montecillo, Texcoco, edo. Mexico. (RRV) Dpto. Biotecnologia. CINVESTAV. Mexico. (LFL) Programa de Biotecnologia. IMP. Mexico. mariari@colpos.mx

Articulo recibido: 10 de julio de 2005, aceptado: 30 de enero de 2006
Tabla 1. Produccion de materia seca total del pasto aleman en suelo
contaminado con benzo(a)pireno a los 120 dias.

Table 1. Production of total dry matter of creeping rivergrass in
soil polluted with benzo(a)pyrene at 120 days.

Tratamiento de       Concentracion de benzo(a)pireno (mg [kg.sup.-1])

microorganismos        0.0 Materia seca (g)      100 Materia seca (g)

Testigo                  9.97 [+ o -] 1.19        13.01 [+ o -] 1.38
Bacterias               11.93 [+ o -] 1.3         13.86 [+ o -] 1.69
Hongos                  12.02 [+ o -] 0.64        14.79 [+ o -] 1.14
Bacterias + hongos      13.86 [+ o -] 0.79        13.93 [+ o -] 0.92

Tratamiento de            Concentracion de
                   benzo(a)pireno (mg [kg.sup.-1])

microorganismos            Incremento (%)

Testigo                        20.46
Bacterias                      16.18
Hongos                         23.04
Bacterias + hongos              5.05
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Author:del C. Rivera-Cruz, M.; Trujillo-Narcia, A.; Ferrera-Cerrato, R.; Rodriguez-Vazquez, R.; Volke-Halle
Publication:Universidad y Ciencia
Date:Jun 1, 2006
Words:6483
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