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Fecundacion in vitro y sus efectos sobre la tasa de division y desarrollo embrionario en ovocitos de cordera, con y sin celulas del cumulus: estudio comparativo del uso de la albumina serica bovina y el suero de oveja en los medios de capacitacion.

Effect of in vitro Fecundation of Prepubertal Sheep Oocytes With or Without Cumulus Cells on Cleavage and Embryo Development Rate: A Comparative Study of Bovine Serum Albumin and Sheep Serum Added to the Capacitation Media

INTRODUCCION

El uso de ovocitos de hembras prepuberes en conjuncion con la transferencia de embriones y otros procedimientos como la maduracion in vitro (MIV), fecundacion in vitro (FIV), cultivo in vitro (CIV) e inyeccion intracitoplasmatica de espermatozoides (ICSI) pueden aumentar la tasa de ganancia genetica en los programas de reproduccion, a traves de la reduccion del intervalo generacional [22, 30] Sin embargo, las evidencias disponibles de estudios en varias especies de mamiferos, incluyendo algunos roedores, bovinos (Bos taurus-Bos indicus), ovinos (Ovis aries) y porcinos (Sus scrofa) sugieren que los ovocitos de animales prepuberes tienen un potencial limitado para llevar a cabo una embriogenesis normal y producir descendencia viable [1].

Se ha demostrado que son pocos los embriones que desarrollan in vitro si son obtenidos de ovocitos de hembras prepuberes, en comparacion con aquellos que son obtenidos de hembras adultas [19, 24, 25], tal vez como consecuencia de perturbaciones en la maduracion [24], en las diferencias observadas en el metabolismo de la glutamina, en la ultraestructura [23] en deficiencias proteicas [19], sensibilidad en los mecanismos de liberacion de Ca2+ [7, 9] a una reducida actividad sintetica [18], etc.

Los componentes proteicos son esenciales en los medios de capacitacion espermatica de los protocolos de fecundacion in vitro (FIV) de ovocitos de ovejas prepuberes, y aunque se han probado una gran cantidad de sustancias, con frecuencia la albumina serica bovina (ASB) y los sueros sanguineos (SS), son los mas utilizados como agentes de capacitacion espermatica [6, 8, 18].

Varios estudios han demostrado que el suero de oveja (SO) mantiene la viabilidad del semen ovino [31] ademas de inducir la capacitacion seminal [4, 6] pero se desconoce el mecanismo por el cual facilita la penetracion espermatica en rumiantes. La ASB tambien se ha usado de forma habitual como suplemento de los medios de capacitacion y fecundacion [3, 6, 33, 34], sin embargo, no esta clara la manera por la cual induce la capacitacion y la reaccion acrosomica, puesto que esta contaminada por otros componentes, como: enzimas, hormonas, lipidos o iones organicos e inorganicos [2].

La ASB y el SO han sido ampliamente utilizados como agentes de capacitacion seminal, aunque la gran mayoria de los experimentos se han desarrollado en la especie bovina y porcina. El uso de la ASB y el SO en ovinos es frecuente, pero son escasos los estudios que comparan ambos suplementos bajo las mismas condiciones (metodo de separacion de espermatozoides, tiempo de incubacion, concentracion, semen fresco o congelado, ovocitos de hembras adultas o prepuberes, temperatura, pH del medio, etc.) y los resultados obtenidos hasta el momento son muy dispares. Unido a esto, la variabilidad del producto entre casas comerciales y las diferencias entre lotes del mismo laboratorio [17], incrementan la dificultad de establecer un criterio homogeneo para el uso de la ASB o el SO en los medios de capacitacion seminal de los protocolos de fecundacion in vitro en ovinos.

Es por ello que el objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de la ASB y el SO, en los medios de capacitacion de semen congelado, en funcion de la tasa de division y desarrollo embrionario de ovocitos de corderas prepuberes madurados in vitro con y sin celulas del cumulus.

MATERIALES Y METODOS

Produccion in vitro de embriones (PIV)

Todos los reactivos, excepto los indicados tras ser mencionados, fueron obtenidos de la compania quimica SIGMA (St. Louis MO, EUA).

Recoleccion y seleccion de ovocitos

Los ovocitos utilizados en este estudio fueron recuperados a partir de ovarios de corderas de 8 a 10 semanas de edad. Los ovarios se colectaron en el matadero local (MERCAZARAGOZA) y fueron transportados al laboratorio en frascos termicos con Solucion Salina Fosfatada de Dulbecco (PBS; D-4031) a 25-30 [grados]C. El tiempo de transporte hasta el laboratorio fue inferior a 2 h. En el laboratorio, los ovarios fueron lavados con solucion salina (0, 9% cloruro de sodio) y posteriormente se mantuvieron en PBS a 30 [grados]C.

Todos los foliculos visibles con un diametro entre 2-6 mm fueron aspirados. La aspiracion folicular fue hecha con una aguja 22G acoplada a una jeringa de 2mL. La clasificacion y seleccion de los ovocitos se hizo en base a sus caracteristicas morfologicas: a) ovocitos con citoplasma homogeneo y rodeados al menos de dos o mas capas de celulas del cumulus (COCs), b) ovocitos con citoplasmas homogeneos rodeados con dos capas o menos de celulas del cumulus (ODs). A estos ultimos ovocitos, se les eliminaron de forma mecanica todas las celulas cumulus, para denudarlos por completo.

Maduracion in vitro (MIV)

Previo a la maduracion se hicieron dos lavados con TCM-199 (M-7628) suplementado con 1 [micron]g/mL 17[beta]-estradiol (C.Z. Veterinaria, S.A. Porrino, Espana), y un tercer lavado con el mismo medio de maduracion TCM-199, suplementado con 270 [micron]g/mL de L-glutamina (G-1517), 10% (v/v) de suero de oveja (S-2263), 5 mg/mL de FSH/LH (HMG-Lepori, Farma-Lepori, S.A. Barcelona, Espana) y 41 [micron]g/mL piruvato de sodio (P-4562). Los COCs y ODs fueron cultivados en paralelo en gotas de medio de maduracion de 50 [micron]L, cubiertas con aceite mineral (M-8410). Las condiciones de cultivo se mantuvieron a 38,5 [grados]C en una atmosfera saturada de humedad y 5% de C[O.sub.2] en aire durante 24 h. Cada gota de medio contenia de 35 a 45 ovocitos.

Los ovocitos fueron evaluados tras 24 h. de iniciada la maduracion para determinar la tasa de maduracion in vitro. Para ello, se fijaron en acido acetico-etanol (1:3, v/v) durante 48 h. y se tineron con 1% de aceto-orceina. Los estadios de los ovocitos se categorizaron en Vesicula Germinal (VG), Vesicula Germinal Break-Down (VGBD), Metafase I (MI), Metafase II (MII) o Indefinido (Ind).

Capacitacion espermatica

Fueron evaluados dos suplementos de capacitacion seminal. El medio base de capacitacion fue Fluido Oviductal Sintetico (SOF), 2,38 mg/mL de Hepes (H-9136) y 25 [micron]g/mL Gentamicina (G1397) suplementado con 4 mg/mL ASB o 20% (v/v) SO.

Se utilizo una mezcla heterospermica de semen ovino congelado, procedente de 3 machos de raza Assaf, con al menos un 30% de espermatozoides motiles progresivos tras la descongelacion (Minitube, Ice Cube 14-S. Austria). El contenido de cada pajuela fue vertido en un tubo de ensayo con su respectivo medio de capacitacion (1,8 mL) y fue centrifugado (Tehtnica, Centric 150. Eslovenia) a 250 G durante 5 min. Se elimino el sobrenadante y el pellet final fue resuspendido (1:1) nuevamente en su respectivo medio de capacitacion (suplementado con ASB o SO). Posteriormente, fueron incubados (NUAIRE, DH Autoflow NU-5500. EUA) a 38,5 [grados]C durante 45 min. Los espermatozoides fueron seleccionados mediante un gradiente de seleccion por movimiento a la superficie.

Fecundacion in vitro (FIV)

Tras la MIV, todos los COCs fueron denudados mecanicamente, y posteriormente tanto los COCs como los ODs fueron divididos en dos grupos, los cuales fueron asignados a los medios de capacitacion evaluados, para ser fecundados con ellos.

Previo a la fecundacion, los grupos de COCs y ODs se lavaron dos veces en Fluido Oviductal Sintetico (SOF) y a continuacion se pasaron al medio de fecundacion: SOF suplementado con 10% (v/v) SO, 32 [micron]g/mL lactato de calcio (C-8356) y 20 [micron]g/mL gentamicina (G1397). Ambos grupos de COCs y ODs fueron cultivados en paralelo en gotas de 50 [micron]L de medio de fecundacion cubiertas con aceite mineral. La concentracion final para la fertilizacion fue de 1 x [10.sup.6] espermatozoides/mL. Las condiciones de co-cultivo de espermatozoides-ovocitos fueron de 38,5 [grados]C en una atmosfera saturada de humedad y 5% C[O.sub.2] en aire durante 22 h.

Cultivo in vitro (CIV)

Finalizado el periodo de co-cultivo (22 h.), los presuntos cigotos fueron lavados 3 veces: 2 en SOF y una ultima en medio de cultivo embrionario SOF suplementado con 20 [micron]L/mL de medio basal de Eagle (BME; B-6766), 10 [micron]L/mL de medio minimo esencial de Eagle (MEM; M-7145), 5% (v/v) Suero Fetal Bovino, 54,75 [micron]g/mL de L-Glutamina, 8 mg/mL de ASB y 40 [micron]g/mL Gentamicina (G1397). Los embriones fueron cultivados en gotas de 50 [micron]L de medio cubiertas con aceite mineral. El CIV se llevo a cabo en sistema de incubacion submarino (LEC. Instruments, SIS 200. Australia) a 38,5 [grados]C. La mezcla de gases utilizada fue de 5% C[O.sub.2], 5% [O.sub.2] y 90% [N.sub.2]. El desarrollo inicial de los embriones fue evaluado 48 h. tras la inseminacion de las placas, y el desarrollo embrionario a blastocistos fue evaluado a 168 h. post inseminacion.

Analisis estadistico

El analisis estadistico se realizo con el paquete estadistico SPSS 15,0 para sistema Windows (SPSS Inc. Chicago, EUA) y se aplico la prueba de Ji-cuadrado ([X.sup.2]) de Pearson con el fin de contrastar y detectar diferencias significativas entre los diversos tratamientos. Utilizando los residuos tipificados corregidos, se determino que resultados observados eran significativamente mayores o menores de lo esperado. El nivel de significancia se fijo en 0,05, de manera que se consideran significativos los resultados menores o iguales a dicho valor.

RESULTADOS Y DISCUSION

Maduracion in vitro

Los resultados del muestreo de la tasa de maduracion in vitro de COCs y ODs, se reflejan en la TABLA I. Tras 24 h. de maduracion se encontraron diferencias altamente significativas (P<0,001) entre los COCs y ODs que alcanzaron el estadio de Metafase II (69,5 vs 31,1%, respectivamente). La proporcion de COCs que reanudaron la meiosis fue del 100% mientras que para los ovocitos ODs fue de 91,3%. La mayor parte de los COCs que no completaron la meiosis se bloquearon en Metafase I (17,6%), mientras que los ODs se bloquearon en VGBD (39,8%). Los ovocitos que sufrieron alguna alteracion durante el proceso de maduracion y no se pudo determinar con exactitud su estado meiotico, fueron clasificados como en estadio indefinido y se encontraron en proporciones practicamente semejantes (6,9% para COCs y 9,7% para ODs).

Division y Desarrollo embrionario

Los resultados de la tasa de division y desarrollo embrionario (morulas y blastocistos) de COCs y ODs fecundados con semen capacitado con ASB o SO, se muestran en la TABLA II.

Los datos obtenidos no permiten determinar diferencias estadisticas en las tasas de division y desarrollo embrionario debidas al agente de capacitacion espermatica. Solo se pudo apreciar pequenas diferencias porcentuales en la tasa de division, que en el caso de los COCs son favorables a los fecundados con semen capacitado con SO y en los ODs son a favor de la ASB. En los resultados de desarrollo embrionario a morulas, estas diferencias porcentuales fueron a favor del SO, tanto en los COCs (12,2% ASB y 20,0% SO) como en los ODs (10,6% ASB y 23,5% SO), mientras que al desarrollo a blastocistos los resultados en los COCs fueron practicamente iguales (16,7% ASB 16,6% SO), en los ODs estas diferencias fueron a favor de los fecundados con semen capacitado con SO (2,1% ASB y 8,8% SO).

Independientemente del agente de capacitacion seminal empleado en la FIV, y analizando los resultados en funcion del tipo de ovocito es posible determinar diferencias altamente significativas (P<0,001) en la tasa de division a favor de los ovocitos madurados con sus celulas del cumulus. Si bien no fue posible determinar diferencias estadisticas en el desarrollo embrionario a morulas y blastocistos, en el caso de los blastocistos son muy evidentes las diferencias porcentuales hacia los ovocitos madurados con sus celulas del cumulus.

Son muchos los factores biologicos que actuan juntos preparando al ovocito inmaduro para desarrollar con exito un embrion competente despues de la fecundacion. Sin embargo, uno de factores que comprometen los resultados de fecundacion son los defectos en la maduracion in vitro. Los defectos en la maduracion del ovocito pueden ser causados por una maduracion nuclear o citoplasmica inadecuada o incluso por un fallo de ambas [37]. La importancia de las celulas de cumulus que rodean al ovocito ha sido bien establecida [10, 11, 16, 29, 38], ya que han sido implicadas, entre otras cosas, en la regulacion del desarrollo del gameto femenino, la maduracion meiotica, la interaccion ovocito-espermatozoide [21], la adquisicion de la capacidad de desarrollo, la capacidad para formar el pronucleo masculino [32].

Existen reportes que indican que el SO mantiene la viabilidad del semen ovino [31], e induce la capacitacion espermatica [4, 6]. Autores como Huneau y col. [14] han conseguido tasas de division in vitro similares a las obtenidas in vivo utilizando 20% de SO en los medios de capacitacion y fecundacion. Asi mismo, se ha demostrado que la ASB ejerce un efecto positivo en la capacitacion de espermatozoides [35], ya que con la adicion de 4 mg/mL de ASB en los medios de capacitacion de semen ovino se han conseguido tasas de penetracion del 54,4% [34]. Sin embargo, el efecto de la ASB en las tasas de fertilizacion y el posterior desarrollo embrionario en ovinos es de los menos documentados [20]. Dada la escasez de estudios de ambos suplementos bajo las mismas condiciones de trabajo, es dificil realizar una comparacion objetiva de su efecto en la tasa de division y desarrollo embrionario, cuando son usados como agentes de capacitacion seminal. Es por ello que en este trabajo se ha procurado mantener las mismas condiciones para ambos medios de capacitacion (metodo de separacion de espermatozoides, tiempo de incubacion, concentracion, semen fresco o congelado, ovocitos de hembras adultas o prepuberes, temperatura, pH del medio, etc.), a tal grado de, por cada replica de FIV, usar dos pajuelas del mismo semen procedentes del mismo lote y fecha de congelacion.

Como refleja la TABLA I, solo se obtuvieron altos porcentajes de MII (69,5%) en los ovocitos que maduraron en presencia de sus celulas del cumulus, lo cual confirma la importancia de las celulas del cumulus para conseguir un proceso normal de maduracion nuclear. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por otros investigadores [12, 27, 39], quienes tambien observaron que tras el periodo de MIV un alto porcentaje de COCs alcanza la MII, mientras que los ODs registran una disminucion considerable en los porcentajes de MII, consecuencia de la eliminacion de las celulas del cumulus antes de la MIV. En contraste, investigadores como Chian y col. [5] encontraron que, tras 24 horas de MIV, las proporciones de ovocitos en MII no eran diferentes cuando los ovocitos de bovino maduraron con o sin celulas del cumulus, debido probablemente a la utilizacion de hembras adultas, sin embargo, estos investigadores tambien observaron que la proporcion de ovocitos penetrados con pronucleo masculino fue significativamente mas alta en los ovocitos madurados con celulas del cumulus (90%) que sin ellas (31%).

Otro dato que refleja la importancia de las celulas del cumulus es el estadio en el cual se bloquean los ovocitos que no alcanzan la MII, ya que como se refleja en la TABLA I, a pesar de que la totalidad de los COCs reanudaron la meiosis (0,0% VG), la mayoria de los que no alcanzaron la MII, se bloquearon en el estadio de MI (17,6%). En el caso de los ODs, el 91,3% reanudaron la meiosis pero la mayoria de ellos (39,8%) se bloquearon en el estadio de VGBD. Con lo cual se confirma que la conexion inicial entre las celulas del cumulus y el ovocito es esencial para completar la maduracion nuclear.

Los resultados de la TABLA II reflejan que los resultados estan mas influenciados por la presencia o ausencia de celulas del cumulus durante la MIV, que por el agente de capacitacion seminal empleado en la FIV, reafirmando asi la importancia de las celulas del cumulus en la adquisicion de la competencia ovocitaria en el posterior desarrollo embrionario. Los resultados obtenidos en el presente trabajo concuerdan con los obtenidos por varios investigadores [5, 13, 28, 39] los cuales observaron que, tras la MIV los ovocitos denudados completan la meiosis son fecundados, inician la division temprana, posteriormente se bloquean y arrojan resultados de desarrollo embrionario inferiores a los ovocitos rodeados de celulas del cumulus. No obstante, y para acrecentar la controversia, otros investigadores han observado que los ODs de raton (Mus musculus) pueden exhibir la misma competencia al desarrollo que los ovocitos madurados in vivo [26, 36].

Finalmente, considerando que los ovocitos empleados en este trabajo proceden de corderas prepuberes, y arrojan resultados inferiores a los obtenidos con hembras adultas [15, 34], de acuerdo a los resultados de las tasas de division y desarrollo embrionario, se puede senalar que, tanto la ASB como el SO son buenos agentes de capacitacion seminal (TABLA II).

CONCLUSIONES

Bajo las condiciones presentes en este trabajo, la ASB y el SO demostraron ser buenos agentes de capacitacion de espermatozoides ovinos. Sin embargo, ninguno de ellos arrojo un beneficio extra al protocolo de produccion in vitro de embriones. Por otro lado, la eliminacion de las celulas del cumulus antes de la maduracion in vitro trae como consecuencia una reduccion significativa de los ovocitos que alcanzan la MII, asi como de la tasa de division y desarrollo embrionario y, aunque en la ganaderia industrial el uso de ODs no tenga mucha importancia, en animales de elevado valor genetico o en especies en peligro de extincion, la utilizacion de este material biologico adquiere mayor importancia y se hace necesario su aprovechamiento, pues a pesar de los resultados tan limitados que se obtienen con los ODs, una parte de ellos son capaces de alcanzar la MII, son fecundados, dividen e inclusive llegan al estadio de morulas y blastocistos, por lo que es posible que en un futuro se puedan aprovechar mucho mejor por medio de las nuevas tecnologias como la clonacion, la produccion de celulas madre, entre otros.

Recibido: 25 / 02 / 2010. Aceptado: 22 / 10 / 2010.

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Rafael Cano Torres *, Lydia Gil Huerta **, Noelia Gonzalez Orti, Felisa Martinez Asensio, Clara Malo Ladrero y Daniel Pinto Mualuzanga

Reproduccion y Obstetricia, Facultad de Veterinaria. Universidad de Zaragoza, Espana. Miguel Servet, 177. 50013. Tel: (34) 976761544. E- mail: * kno249@hotmail.com ** lydiagil@unizar.es
TABLA I

TASAS DE MADURACION in vitro DE COCs Y DOs.

                                Vesicula
Tipo de   No. de     Vesicula   Germinal
ovocito   ovocitos   Germinal   Breakdown

COC       131        0,0%       6,1% (b)
OD        103        8,7%       39,8% (a)

          Estado
          Meiotico

Tipo de
ovocito   MI         M II       Indefinido

COC       17,6%      69,5% (a)  6,9%
OD        10,7%      31,1% (b)  9,7%

Significacion estadistica segun la prueba de Ji-cuadrado, P<0,001.
(a) Resultados observados significativamente mayores que los esperados.
(b) Resultados observados significativamente menores que los esperados.

TABLA II

TASAS DE DIVISION Y DESARROLLO EMBRIONARIO DE COCs Y Dos
FECUNDADOS CON SEMEN CAPACITADO CON ASB O SO.

Tipo de   Tratamiento   No.        Ovo.
ovocito   semen         ovocitos   divididos

COC       ASB           608        131
                                   (21,5%) (a)
          SO            596        145
                                   (24,3%) (a)

OD        ASB           437        47
                                   (10,8%) (b)
          SO            423        34
                                   (8,0%) (b)

P *                                < 0,001

          [menor que    Ovo.
Tipo de   o igual a]    Divididos
ovocito   8 celulas     Morulas     Blastos

COC       93            16          22
          (71,0%)       (12,2%)     (16,7%)
          92            29          24
          (63.4%) (b)   (20,0%)     (16,6%)

OD        41            5           1
          (87,2%) (a)   (10,6%)     (2,1%) (b)
          23            8           3
          (67,6%)       (23,5%)     (8,8%)

P *                     0,026

* Significacion estadistica segun la prueba de Ji-cuadrado.
(a) Resultados observados significativamente mayores que los esperados.
(b) Resultados observados significativamente menores que los esperados.
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Author:Cano Torres, Rafael; Gil Huerta, Lydia; Gonzalez Orti, Noelia; Martinez Asensio, Felisa; Malo Ladrer
Publication:Revista Cientifica de la Facultad de Ciencias Veterinarias
Date:Mar 1, 2011
Words:4458
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