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FACTORES ABIOTICOS Y BIOTICOS DETERMINANTES PARA LA PRESENCIA DE BATRACHOCHYTRIUM DENDROBATIDIS EN ANFIBIOS MEXICANOS.

DETERMINANT ABIOTIC AND BIOTIC FACTORS FOR THE PRESENCE OF BATRACHOCHYTRIUM DENDROBATIDIS IN MEXICAN AMPHIBIANS

INTRODUCCION

La diversidad y densidad de anfibios a nivel mundial han disminuido rapidamente en las ultimas dos decadas, donde la infeccion por Batrachochytrium dendrobatidis (quitridiomicosis) ha sido un factor importante (Daszak et al., 2003; Stuart et al., 2004; IUCN, 2017). La severidad de los cambios ambientales recientes y la rapida dispersion que favorecen las epizootias de anfibios apoyan la hipotesis del patogeno endemico, la cual sugiere que dicho patogeno ha estado siempre presente y ha incrementado su rango de hospederos y/o patogenicidad (Stuart et al., 2004; Rachowicz et al., 2005; Pounds et al., 2006; Kilpatrick et al., 2010; Slenning, 2010). No obstante, recientemente se han encontrado evidencias de la hipotesis del patogeno invasor de un solo origen (O'Hanlon et al., 2018).

Existen condiciones ambientales (p.e. temperatura y humedad) y caracteristicas del habitat (p.e. tipo de vegetacion) que determinan la presencia, supervivencia y reproduccion de los organismos (Sinclair et al., 2006). En el caso de Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), algunos experimentos demostraron que la resistencia/susceptibilidad del hongo quitrido depende de la temperatura (Berger et al., 2004; Andre et al., 2008). Se ha determinado que los cultivos purificados de hongos quitridios tienen altas tasas de crecimiento entre 16[grados]C y 23[grados]C, pero crecen lentamente a temperaturas entre 4[grados]C y 16[grados]C (Longcore et al., 1999; Berger et al., 2004). Las bajas temperaturas proporcionan condiciones favorables para su crecimiento mientras los hospederos se encuentran en hibernacion (Piotrowski et al., 2004; Johnson y Speare, 2005) y/o los anfibios reducen su inmunidad (Berger et al., 2004). Aunque el hongo quitrido crece mas lentamente a temperaturas superiores a 28[grados]C, se han producido brotes en climas templados durante la temporada mas calida en las zonas montanosas frias (Bosch et al., 2001) o durante el invierno en tierras bajas calidas (Bradley et al., 2002). La prevalencia de Bd es alta durante los periodos de temperatura fria (Berger et al., 2004; Woodhams y Alford, 2005; Kriger y Hero, 2007), mostrando una aparente estacionalidad en zonas templadas o presentandose en areas tropicales frias (Bradley et al., 2002).

Batrachochytrium dendrobatidis ha sido identificado en 74 especies de anfibios ubicadas principalmente en el centro y sur de Mexico, entre los 338 y los 3236 msnm (Frias-Alvarez et al., 2008; Mendoza-Almeralla et al., 2015; Lopez-Velazquez, 2018). No obstante, la presencia del hongo quitrido aumentan con la altitud (Berger et al., 1998; Bosch et al., 2001; Weldon et al., 2004; Lips et al., 2006; Rachowicz et al., 2005; Kriger y Hero, 2008) considerando que ocurre en sitios por encima de los 400 msnm (Whitfield et al., 2012), ya que la temperatura disminuye segun la altitud (Bustamante et al., 2010). Ademas, la temporalidad afecta la prevalencia de Bd, que varia desde una menor prevalencia en la temporada calida a una mayor prevalencia en la temporada mas fresca (Whitfield et al., 2012). Aunque, algunos autores han manifestado que los renacuajos pueden mantener el Bd por largos periodos en sus estructuras bucales durante la temporada seca hasta que realicen su metamorfosis (Woodhams y Alford, 2005; Smith et al., 2007; Longo y Burrowes, 2010), otros mencionan que existe una disminucion de la queratina en las estructuras bucales antes de la metamorfosis, pero los hongos quitridos pueden pasar de estas a la primera queratinizacion de la piel en las patas diseminandose rapidamente (Marantelli et al., 2004). Asimismo, las caracteristicas fisicoquimicas del agua son factores que puede influir en la prevalencia de Bd (Grundler et al, 2012).

La presencia y prevalencia de Bd esta influenciada por numerosos factores ambientales, asi como las caracteristicas intrinsecas de los anfibios (Grundler et al., 2012). En Mexico, dos estudios han considerado los factores bioticos y abioticos en la presencia de Bd a lo largo de un gradiente de usos de suelo por agroecosistemas (Murrieta-Galindo et al., 2014; Hernandez-Lopez et al, 2018), pero no consideraron a las especies de anfibios como un factor de predisposicion. En el presente estudio, evaluamos si cinco factores abioticos (altitud, precipitacion, temperatura media y humedad media de las temporada seca y lluviosa) y cuatro variables bioticas (especies de anfibios, estado de desarrollo, indice de vida acuatica y tipo de vegetacion) o sus interacciones estan relacionadas con la presencia de Bd en anfibios mexicanos, como un acercamiento no parametrico de un modelo de distribucion de especies.

MATERIALES Y METODOS

Sitios de estudio. El muestreo se realizo en diferentes localidades considerando los tipos de vegetacion caducifolia, bosque de encino, bosque de pino, areas de vegetacion xerofila y humedales naturales en el centro de Mexico (Ciudad de Mexico, Estado de Mexico, Puebla y Morelos), bosque mesofilo de montana (BMM) en el centro de Veracruz, y selva alta perennifolia (SAP) de Tabasco en el sureste de Mexico. Estas localidades se distribuyeron entre los 200 msnm y los 2800 msnm, pero no en un gradiente altitudinal (Cuadro 1). Para los sitios, se considero la temporalidad ambiental reportadas para Mexico (CONAGUA 2011), la cual se registra que la temporada seca va de noviembre a mayo y la temporada lluviosa de junio a octubre. Las temperaturas ambientales promedio, la precipitacion y la humedad relativa para cada temporada fueron obtenidas de los registros nacionales (CONAGUA 2011).

Colecta de hisopados cutaneos y orales. Capturamos al azar cualquier anfibio durante la temporada seca (noviembre de 2010 a mayo de 2011) y la temporada lluviosa (junio a octubre de 2011). Algunas localidades fueron visitadas en ambas temporadas climaticas, mientras que otras solo en una temporada debido a que los anfibios no estaban presentes, era dificil la captura o era dificil el acceso a los sitios. Todos los anfibios fueron capturados utilizando una red de malla fina, y fueron manipulados con guantes de latex esteriles para evitar la contaminacion de la muestra y reducir el riesgo de transmision del Bd a traves de la contaminacion cruzada entre individuos. Las redes se lavaron con cloro al 5% y enjuagadas con agua limpia entre capturas. La obtencion de muestras se realizo de acuerdo con la metodologia descrita por Kriger et al. (2006), utilizando individualmente hisopos de rayon esteriles (Medical Wire and Equipment, MW 100-100, Biomerieux). Cada hisopo fue frotado con firmeza, pero con suavidad, de manera que quedara impregnado con el exudado cutaneo. Se froto diez veces en el dorso del animal, diez veces en los flancos del torax, diez veces en el vientre, diez veces en la superficie ventral del muslo y cinco veces en las superficies palmar y plantar de cada pata. Las muestras de hisopos se obtuvieron de todos los individuos adultos capturados, a pesar de la presencia o ausencia de signos clinicos o lesiones dermicas macroscopicas que sugirieran quitridiomicosis (segun Berger et al., 1998 y Nichols et al, 2001). Las muestras de hisopos de renacuajos se tomaron de las estructuras bucales de todos los individuos capturados, independientemente de los signos de quitridiomicosis reportados como perdida de tejido, dano dermico, lesiones o decoloracion de las estructuras bucales (segun Rachowicz, 2002), ya que estas estructuras se pueden perder o danar debido a otros factores durante la metamorfosis (etapas 40-42), y dichos signos pueden confundirse con lesiones de quitridiomicosis (Gosner, 1960; Lips et al., 2004). Los hisopos se conservaron en crioviales con 150 [micro]l de buffer de lisis (Longmire et al., 1997) a temperatura ambiente, hasta su almacenamiento en laboratorio (dentro de las cuatro horas posteriores a la colecta), donde se almacenaron a -20[grados]C hasta su procesamiento. Tanto los adultos como los renacuajos fueron recolectados y muestreados de cuerpos de agua permanentes. Las muestras de adultos obtenidas de cuerpos de agua temporales se adquirieron en la localidad de la selva alta perennifolia, ubicados a 100 m de fuentes de agua permanentes. Cada individuo fue fotografiado para la identificacion de las especies y si presentaban lesiones dermicas. Los especimenes fueron liberados en el mismo sitio donde fueron capturados. Ademas, fueron consideradas muestras de individuos de Ambystoma mexicanum, los cuales se encontraban en tanques mantenidos a la intemperie a los que se les proveia de agua de los canales del lago de Xochimilco sin ningun tratamiento previo; estos individuos fueron considerados del ambiente humedal, debido al uso directo del agua del lago.

Extraccion de ADN y diagnostico molecular. La extraccion del DNA se realizo siguiendo la metodologia sugerida por Miller et al. (1988) y la recomendada por el fabricante del kit de extraccion GF-1 (Vivantis Technologies Sdn. Bhd. Malaysia). La amplificacion de los fragmentos de 300 pb de RNA ribosomico (rRNA) se realizo mediante un proceso anidado de reaccion en cadena de la polimerasa (nPCR) (Goka et al, 2009). El nPCR tiene una mayor sensibilidad cuando se trabaja con bajas cantidad de acidos nucleicos (Ma et al., 2003; Kawada et al, 2004; Goka et al, 2009) o cuando hay una dilucion de los acidos nucleicos en el proceso de extraccion (Ma et al., 2003). En el primer ensayo, la region 18S rRNA de Bd se amplifico usando el oligonucleotido Bd18SF1 (5'-TTTGTACACACCGCCCGTCGC-3') y la region 28S rRNA mediante el oligonucleotido Bd28SR1 (5'-ATATGCTTAAGTTCAGCGGG-3'). En el segundo ensayo, se amplifico a partir de los primeros productos, la region 5.8 del gen rRNA, y las regiones ITS1 e ITS2, usando los oligonucleotidos Bd1a (5'-CAGTGTGCCATATGTCACG-3') y Bd2a (5'-CATGGTTCATATCTGTCCAG-3').

Las PCR se realizaron en reacciones de 20 [micron]L, las cuales incluyeron 2 [micron]L de la extraccion de ADN, 0.5 mM de cada dNTP, 2 mM de MgCh, 0.25 U de DNA polimerasa Taq (Amplificasa, Biotecnologias Universitarias, FMVZ-UNAM) y 0.5 mM de cada oligonucleotido. La primera reaccion se mantuvo durante 9 minutos a 95[grados]C con el fin de obtener la desnaturalizacion inicial. Posteriormente, se corrieron 30 ciclos de 30 segundos a 94[grados]C, 30 segundos a 50[grados]C y 2 minutos a 72[grados]C y una extension final de 7 minutos a 72[grados]C. Para la segunda amplificacion, la desnaturalizacion inicial se realizo durante 9 minutos a 95[grados]C; 30 ciclos de 30 segundos a 94[grados]C, 30 segundos a 65[grados]C y 30 segundos a 72[grados]C y una extension final de 7 minutos a 72[grados]C.

Se incluyeron controles positivos y negativos en cada amplificacion de PCR; los controles positivos se extrajeron de un cultivo de Bd (cepa JEL-423), y el control negativo fue agua esteril destilada libre de acidos nucleicos. Cada muestra se probo por triplicado para verificar los resultados de cualquier amplificacion y para descartar cualquier falso negativo. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en geles de agarosa al 2% y se tineron con bromuro de etidio para hacer que las bandas de fragmentos fueran visibles bajo luz UV. Todas las pruebas diagnosticas se realizaron en el Laboratorio de Micologia de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia (FMVZ) de la Universidad Nacional Autonoma de Mexico (UNAM).

Analisis de datos. La prevalencia se calculo a partir del numero de casos positivos dividido por el numero total de muestras; estos incluyen la prevalencia calculada para individuos adultos de cada especie de anfibio capturada, asi como para los renacuajos; tambien el intervalo de confianza al 95% ajustado para proporciones (Heumann et al, 2016). Una tabla de contingencia evaluada con una prueba de Chi-cuadrada de Pearson con correccion de Yates (Gotelli y Ellison, 2004) fue realizada con el programa Epidat 3.1 (www.sergas.es) para identificar la independencia o asociacion de las condiciones (adulto y renacuajo, y temporadas climaticas) hacia la presencia del Bd. Previamente, los datos de presencia se transformaron por la raiz cuadrada de N + 0.5, donde N es presencia (1) o ausencia (0) (Gotelli y Ellison, 2004).

Tambien se realizaron dos arboles de clasificacion binomial y de regresion (CART, Breiman et al., 1984) como un enfoque no parametrico de un modelo de distribucion y de preferencia de habitat (Bell 1996; Vayssieres et al., 2000) para evaluar la combinacion de nueve variables que podrian determinar la presencia de Bd en anfibios. En el primer CART se consideraron (1) las especies de anfibios (incluidas dos especies de renacuajos como entidades), (2) tipo de vegetacion, (3) altitud, (4) temperatura media ambiental, (5) humedad relativa, (6) precipitacion, (7) temporada (lluviosa o seca), y (8) un indice de vida acuatica (valores tomados de Hernandez-Lopez et al., 2018), el cual considera el promedio de valores asignados para cada etapa de desarrollo ([a] larva, [b] adulto en reproduccion y [c] adulto en no reproduccion); cada etapa toma valores de 1 cuando larvas y adultos tienen habitos terrestres, 2 cuando los adultos tienen habitos arboricolas y 3 cuando larvas y adultos son exclusivamente acuaticos (Lips et al., 2003; Hernandez-Lopez et al, 2018). El segundo CART se realizo para corregir el posible error debido al tamano de muestra inferior a 59 (segun Skerrat et al., 2008 y Gray et al, 2017), para lo que excluimos la entidad de las especies y la sustituimos por el estado de desarrollo (adultos y renacuajos) como variable explicativa. Para el CART, las variables explicativas obtienen un valor de probabilidad de acuerdo con la particion recursiva que divide las variables jerarquicamente por medio de nodos y ramas definidas (Breiman et al., 1984; Vayssieres et al., 2000; Gotelli y Ellison, 2004). La seleccion del arbol con el numero de ramas mas apropiado para evitar el sobreajuste, se realizo con el calculo de la tasa de error por la validacion cruzada considerado la devianza minima (Bell, 1996). Los CART se construyeron con el paquete tree (version 1.0-35) en el programa RStudio v 1.1.463 (R studio, Inc. www.rstudio.com), considerando un valor significativo de 0.05.

RESULTADOS

Se tomaron muestras de 203 anfibios adultos de 13 especies mexicanas, que se distribuyeron en siete tipos de habitats diferentes entre los 223 msnm hasta los 2817 msnm (Cuadro 1). La prevalencia de Bd en los anfibios adultos fue 47.78% (Cuadro 2). Las muestras de hisopos recogidos de Ambystoma mexicanum en semicautiverio mostraron un 75% de positivos (9/12) para el hongo quitrido mediante el diagnostico de nPCR (Cuadro 3). De las muestras colectadas en la selva alta perennifolia (SAP) del sureste de Mexico, cinco de 16 muestras fueron positivas (31.25% de prevalencia), incluyendo anuros fosoriales (Leptodactylus fragilis, n = 8) y anuros de sotobosque (Smilisca baudinii, n = 7); estos registros de Bd fueron los primeros reportados a Tabasco y a la region de la Peninsula de Yucatan. Ningun anfibio exhibio lesiones macroscopicas o signos clinicos de enfermedad sugestiva de quitridiomicosis, ni se encontro mortalidad masiva de individuos.

Ademas, se capturaron 91 renacuajos de los cuales 66 fueron positivos a Bd en la PCR anidada (72.53% de prevalencia; IC95% = 9.17) (Cuadro 2). La tabla de contingencia mostro que la presencia de Bd esta asociada a la etapa de desarrollo de los anfibios (adulto o renacuajo) ([X.sup.2.sub.Pearson] = 14.57, g. l. = 1, P = 0.0001). La proporcion de las prevalencias entre renacuajos: adultos indico que los renacuajos tienen 52% mas prevalencia de Bd que los adultos.

La prevalencia total de Bd no esta asociada a la temporada climatica ([X.sup.2.sub.Pearson] = 0.23, g. l. = 1, P = 0.633), siendo de 53.49% en la temporada seca y de 56.97% en la temporada lluviosa. El mismo analisis se dividio por etapas de desarrollo, pero no se encontraron asociaciones de la presencia de Bd en las muestras de adultos entre las temporadas climaticas (adultos: [X.sup.2.sub.Pearson] = 0.129, g. l. = 1, P = 0.719) (45.57% de prevalencia en la temporada seca y 49.19% en la temporada lluviosa). La prevalencia de quitridios en renacuajos fue del 66% en la temporada seca (33/50) y del 80.49% durante la temporada lluviosa (33/41); no obstante, la prevalencia no estuvo asociada a la temporada (renacuajos: [X.sup.2.sub.Pearson] = 1.702, g. l. = 1, P = 0.192) (Cuadro 2).

Analisis multivariado

La presencia de Bd en los anfibios esta influenciada por la interaccion de multiples variables simultaneamente. El primer arbol de clasificacion y regresion realizado a partir de un modelo completo de ocho variables (especies de anfibios [incluidos los renacuajos como una entidad], indice de vida acuatica, tipo de vegetacion, altitud, temperatura y humedad ambiental, precipitacion y temporada) utilizado para predecir la presencia de Bd. En este arbol fueron excluidas las especies que tuvieron menos de siete colectas en los muestreos; unicamente se consideraron siete especies de anfibios (Rheohyla miotympanum, Lithobates spectabilis, Hyla eximia, Hyla arenicolor, Leptodactylus fragilis, Smilisca baudinii y Ambystoma mexicanum) y dos de renacuajos (R. miotympanum y L. spectabilis). El arbol resultante genero siete divisiones y ocho nodos terminales a partir de cuatro variables seleccionadas (especies, precipitacion, temperatura y temporada climatica). El modelo de CART mas preciso fue elegido por la menor tasa de error de clasificacion obtenida con la validacion cruzada (0.24 = 68/278) (Fig. 1). El arbol resolvio con un 94% de probabilidad que Bd estuviera presente en individuos adultos de Hyla arenicolor, Lithobates spectabilis y Smilisca baudinii cuando estas especies viven a temperaturas ambientales inferiores a 20.25[grados]C y precipitaciones superiores a 22.5 mm. El modelo CART tambien considera que Ambystoma mexicanum y renacuajos de Rheohyla miotympanum son mas propensos a la presencia de Bd per se (P = 0.81), asi como adultos de R. miotympanum y renacuajos de Lithobates spectabilis, pero durante la temporada lluviosa la probabilidad de presencia de Bd aumenta (P = 0.75) (Fig. 1).

El segundo CART tambien se incluye ocho variables, pero en lugar de la variable 'especie' consideramos el estado de desarrollo (adulto o renacuajo), esto para corregir el posible error debido al tamano de muestra de algunas especies. En este analisis se contaron con 91 muestras de renacuajos y fueron incluidas 203 muestras de individuos adultos de 13 especies (Cuadro 3). El modelo mas preciso tambien fue seleccionado de acuerdo con la menor tasa de error de clasificacion obtenida con la validacion cruzada (0.2313 = 68/294). El arbol de regresion generado tuvo cinco divisiones y seis nodos terminales para cinco variables seleccionadas (precipitacion, tipo de vegetacion, temperatura e indice de vida acuatica) (Fig. 2). En el CART se observa que el hongo quitrido podria estar presente en anfibios adultos y renacuajos del BMM, del bosque de pino, los humedales y de la vegetacion xerofila cuando se presentan precipitaciones mayores a 10 mm, la temperatura ambiental este por debajo de los 21.75[grados]C y presentan un indice de vida acuatica mayor a 2.50 (P = 0.79). Ademas, Bd tambien puede estar presente con 72% de probabilidad en adultos y larvas con indice de vida acuatica por abajo de 2.50, cuando la temperatura ambiental este por arriba de los 16.9[grados]C (Fig. 2).

DISCUSION

En diferentes regiones del mundo, la quitridiomicosis se ha asociado con la mortalidad en masa de muchas poblaciones de anfibios (Laurence, 1996; Laurence et al., 1997; Berger et al., 1998; Longcore et al., 1999; Bosch et al., 2001; Daszak et al., 2003; Lips et al., 2004; Pounds et al., 2006; James et al., 2009; Voyles et al, 2009). Sin embargo, la ausencia de signos clinicos tambien se ha reportado en algunos lugares donde el quitrido se ha detectado (Carnaval et al, 2006; Toledo et al., 2006; Grundler et al., 2012). En este estudio, no encontramos anfibios con lesiones macroscopicas o signos de enfermedad ni eventos de mortalidad masiva por Bd. Nuestros resultados obtenidos a traves del analisis de PCR anidado muestran un rango mas amplio de valores (de 6 a 100%) de la presencia de Bd comparado con los porcentajes previamente reportados en Mexico y detectados por PCR en tiempo real (75%, Lips et al, 2004; 84-100%, Frias-Alvarez et al, 2008). No obstante, en otros estudios se ha demostrado que la tecnica de PCR anidada es mas sensible y especifica para detectar fragmentos de acidos nucleicos, incluso en muestras contaminadas o degradadas (Goka et al., 2007; Gaertner et al., 2009). Posiblemente, la sensibilidad y especificidad de la PCR anidada refleje menores tasas de falsos negativos y tenga alta deteccion del hongo quitrido.

La presencia del hongo quitrido ha sido reportada en multiples lugares en Mexico, incluyendo Sonora (Rollins-Smith et al., 2002), Guerrero (Lips et al., 2004; Frias-Alvarez et al., 2008), Chiapas (Quintero-Diaz, 2004; Frias-Alvarez et al., 2008), Ciudad de Mexico, Estado de Mexico, Michoacan, Morelos, Oaxaca, Puebla, Hidalgo y Nuevo Leon (Frias-Alvarez et al., 2008), y el centro de Veracruz (Murrieta-Galindo et al., 2014) . No obstante, se menciona que al menos 74 especies de anfibios, de las familias Hylidae y Plethodontidae, distribuidas en las regiones montanosas del centro y sur de Mexico tienen susceptibilidad a Bd (Mendoza-Almeralla et al., 2015; Lopez-Velazquez, 2018). Todos los registros coinciden en que el hongo quitrido ocurre en altitudes superiores a 600 msnm, y en climas templados y humedos, pero no se especifican los tipos de vegetacion. Murrieta-Galindo et al. (2014) definen que algunas especies de anfibios con reproduccion acuatica que habitan en el bosque mesofilo de montana son mas susceptibles a la presencia de Bd. En nuestro trabajo, incluimos como nuevo reporte, la presencia del quitrido en la selva alta perennifolia de Tabasco en el sureste de Mexico. La presencia de Bd en este tipo de zonas se ha reportado en zonas tropicales frias (Bradley et al., 2002), sin embargo, en nuestro sitio de muestreo (SAP, Cuadro 1) presenta un clima calido humedo con lluvias todo el ano y la temperatura mas fria se da en enero con >18.1[grados]C (INEGI, 2017). Esta localidad esta aproximadamente a 160 km de la ubicacion geografica mas cercana, Pueblo Nuevo, Chiapas (Munoz-Alonso, 2013), donde se documento la presencia de Bd. Nuestro hallazgo modifica los registros de altitud y distribucion de Bd en tierras bajas de la vertiente del Golfo de Mexico (ver Mendoza-Almeralla et al., 2015).

Algunas de las especies estudiadas en este trabajo son endemicas de Mexico, incluyendo Rheohyla miotympanum, Ambystoma mexicanum, Hyla eximia, Charadrahyla taeniopus y Lithobates spectabilis (IUCN, 2017); documentamos el primer informe de los hallazgos de Bd en C. taeniopus. Las otras ocho especies tienen un amplio rango de distribucion en el continente americano, pero no son especies endemicas de Mexico: Hyalinobatrachium fleischmanni, Lithobates berlandieri, Hyla arenicolor, Spea multiplicata, Rhinella horribilis, Leptodactylus fragilis, Smilisca baudinii y Eleutherodactylus sp. Tambien documentamos el primer informe de Bd en Leptodactylus fragilis, el resto de las especies habian sido reportadas previamente como positivas para la quitridiomicosis en otras localidades mexicanas (Lips et al, 2004; Frias-Alvarez et al, 2008; Munoz-Alonso, 2013).

En el lago Xochimilco, los ajolotes (Ambystoma mexicanum) muestreados en el CIBAC en los tanques con agua del lago tuvieron alta prevalencia de Bd, lo que confirma que el hongo quitrido esta presente en las vias fluviales de Xochimilco. Esta posibilidad de que Bd este presente en los pocos ajolotes silvestres ha sido mencionada por Frias-Alvarez et al. (2008), que no pudieron declarar al lago como sitio libre de Bd debido al tamano de muestra demasiado pequeno (N = 2).

Los porcentajes de prevalencia de Bd detectados en el presente estudio (47.78% en adultos) estuvieron dentro del rango reportado en otros trabajos de investigacion previos realizados en Mexico (96.4% por Frias-Alvarez et al, 2008; 21% por Munoz-Alonso, 2013; 20% por Murrieta-Galindo et al, 2014). Ademas, identificamos una alta prevalencia entre los renacuajos (72.53%) en comparacion con solo el 17.72% reportado por Murrieta-Galindo et al. (2014), lo que nuestro resultado refleja una relacion de 1.52 veces la prevalencia respecto a la de los adultos. La relacion es similar a lo reportado por Longo y Burrowes (2010), quienes estimaron una relacion renacuajo: adulto de 1.5. No obstante, reportamos que la mayor prevalencia de Bd esta en los renacuajos, ninguno tuvo sin signos clinicos de quitridiomicosis, como es la perdida de forma de las estructuras orales queratinizadas. Estas alteraciones bucales pueden confundirse entre la quitridiomicosis y la perdida natural y la maduracion por la metamorfosis normal (etapas 40-42, Gosner, 1960; Lips et al, 2004). Se ha sugerido que la alta prevalencia de Bd entre los renacuajos podria indicar que estan contribuyendo como reservorios durante periodos prolongados, manteniendo al hongo en la poblacion y en el ambiente hasta que las condiciones ambientales sean optimas para la metamorfosis (Woodhams y Alford, 2005; Smith et al., 2007). Aunque los renacuajos tienen tejido epidermico queratinizado insuficiente para permitir la invasion eficiente de los quitridos y su establecimiento, la prevalencia aumenta hasta estados postmetamorficos como subadultos, que tambien pueden actuar como reservorios (Cashins, 2009; Piova-Scott et al, 2011). Segun nuestros hallazgos, confirman que especies con fases adultas acuaticas (i.e. Ambystoma mexicanum) y renacuajos (segun el primer CART, Fig. 1) podrian mantener la presencia del quitrido en el ambiente por resistencia (Briggs et al, 2010) o especies que requieren constante presencia en todas sus fases de desarrollo, reflejado en valores de indice de vida acuatica altos (p.e. indice de vida acuatica > 2.50, segun segundo CART, Fig. 2).

Los agentes etiologicos se manifiestan cuando se da la interaccion multiple y compleja entre las condiciones ambientales, la dinamica de la poblacion, la resistencia del huesped y la virulencia de los patogenos (Voyles et al, 2009). La prevalencia e intensidad tienden a ser bajas en sitios enzooticos; la reinfeccion de individuos resistentes podria hacer que el patogeno persista en la poblacion y el medio ambiente (Briggs et al, 2010), aunado con las interacciones de las condiciones bioticas y abioticas (Daszak et al., 2003; Lips et al., 2003; Berger et al., 2004; Rohr y Raffel, 2010). Estas interacciones pueden comprometer estacionalmente la respuesta inmune y el comportamiento del huesped, asi como la dinamica parasito-hospedero (Woodhams y Alford, 2005). El presente estudio indica que dentro de las variables analizadas, las mas importantes para la presencia de Bd en anfibios silvestres aparentemente sanos fueron la precipitacion y la especie de anfibios, sumandose la especificidad del habitat (i.e., boque mesofilo de montana, bosque de encino, vegetacion xerofila y humedales) o la posible funcion de reservorio por parte de los renacuajos y de especies con fases adultas de alta asociacion con cuerpos de agua (i.e. Ambystoma mexicanum, Lithobates sp., Rheohyla miotympanum) e indices de vida acuatica altos. Anteriormente, algunas de estas variables se conocian como parte del riesgo de quitridiomicosis (Lips et al, 2003; Berger et al., 2004; Rohr y Raffel, 2010). En Mexico, Murrieta-Galindo et al. (2014) encontraron una combinacion de variables bioticas y abioticas (i.e. densidad de arboles, especies de helechos, temperatura, elevacion, tamano de fragmentos e indice estructural) que se correlacionan positivamente con la infeccion por Bd en anfibios de agroecosistemas de cafe en el bosque mesofilo de montana. En una recopilacion de datos de registros publicados, Hernandez-Lopez et al. (2018) encuentran que el tipo de desarrollo larvario y factores ambientales tales como temperatura, precipitacion y perturbacion (p.e. cambios en la vegetacion y tipos de uso de suelo), afectan el riesgo de infeccion por Bd. No obstante, encuentran una asociacion negativa entre el grado de perturbacion y la tasa de infeccion. Aunque nosotros no evaluamos el grado de perturbacion, nuestros hallazgos concuerdan en que la temperatura y precipitacion son importantes, junto con el tipo de desarrollo larvario, en nuestro caso, especies de desarrollo larvario de vida libre (Rheoyla miotympanum y Lithobates sp.).

El gran numero de especies de anfibios estudiadas previamente en Mexico, verifica la presencia de Bd distribuido en diferentes habitats, desde bosques de coniferas hasta bosques tropicales (Rollins-Smith et al., 2002; Lips et al., 2004; Frias-Alvarez et al., 2008; Luja et al., 2012, Murrieta-Galindo et al., 2014; Mendoza-Almeralla et al, 2015), en altitudes entre los 338 m y mas de 3,000 m sobre el nivel del mar (Frias-Alvarez et al., 2008). Las areas mas bajas registradas en este trabajo con la presencia de Bd se encontraron en la selva alta perennifolia (SAP) a 223 msnm. Al igual que en el bosque mesofilo de montana, la SAP tambien presenta mayor humedad (> 90%) por tener un clima calido humedo con lluvias todo el ano (INEGI 2017); sin embargo, SAP experimenta una temperatura anual promedio mas alta (28.2[grados]C) que los otros tipos de vegetacion evaluados. En las selvas altas del sureste de Mexico, la prevalencia de Bd fue mayor (31.25%) que el 19.8 por ciento reportado en estudios previos en el mismo tipo de vegetacion en la amazonia ecuatoriana, ubicados entre 190 m y 250 msnm con una temperatura promedio de 25[grados]C (McCracken et al, 2009). Ademas, nuestros resultados tambien exceden la prevalencia reportada en los bosques tropicales de Costa Rica (entre 100 m y 399 msnm), que presentan una prevalencia del quitrido del 17.6% (Puschendorf et al, 2006).

Aunque se ha reportado que la presencia de Bd puede darse en temperaturas superiores a los 25[grados]C, el hongo no crece y puede morir, nuestros resultados corroboran que puede ser viable a temperaturas mayores como las del sureste mexicano. No obstante, algunos investigadores consideran que las temperaturas inferiores a 25[grados]C son optimas para su crecimiento (Berger et al., 1998; Bosch et al., 2001), tambien corroboramos con nuestros resultados del CART, que la temperatura por debajo de los 19.9[grados]C es optima para su presencia. Por otro lado, algunos estudios han confirmado que Bd esta presente en bajas altitudes (Beard y O'Neal, 2005; Carnaval et al., 2006; Flechas et al., 2012; Luja et al., 2012). Nuestros hallazgos demuestran que el hongo sobrevive con alta prevalencia en selva alta perennifolia en altitudes de [aproximadamente igual a] 200 msnm, donde la temperatura maxima diaria promedio puede ser de 36[grados]C durante la temporada calida y las temperaturas minimas estan por arriba de los 18[grados]C (CONAGUA, 2011; INEGI, 2017). Estos resultados demuestran que el hongo quitrido tiene un rango de temperatura mas amplio para el crecimiento en condiciones silvestres respecto a las condiciones en laboratorio (Longcore et al, 1999; Berger et al, 2004). Este amplio rango puede hacer que Bd este presente y pueda causar enfermedad cuando las condiciones ambientales afecten la actividad protectora de la microbiota cutanea (Daskin et al, 2014) o al sistema inmune de los anfibios (Woodhams et al, 2008). El rango de temperatura de los habitats naturales es un factor que requiere una evaluacion mas profunda para comprender el ciclo natural de la enfermedad y la vulnerabilidad potencial de otras especies de anfibios que anteriormente no se consideraban en riesgo.

No obstante, se ha informado que otros factores de riesgo podrian desempenar un papel en la presencia de Bd, varios modelos evaluaron las sinergias entre variables como posibles causas del declive de la poblacion mundial de anfibios, como la perdida de habitat, el cambio climatico, la sobreexplotacion, las enfermedades y la perdida de diversidad de anfibios (Sodhi et al., 2008; Searle et al., 2011). Diferentes combinaciones de estas variables sugieren que las especies de anfibios, especialmente en aquellas con rangos de distribucion pequenos y restringidos, con habitats estacionales en temperatura y precipitacion, tienen el mayor riesgo de extincion. En nuestros analisis CART obtuvimos que la especie de anfibio y la precipitacion son las variables principales que determinan la presencia de Bd, y se van combinando con el tipo de habitat, la temperatura y humedad, el estado de desarrollo y el indice de vida acuatica. Aunque algunos autores mencionan que el grado de perturbacion de la vegetacion y el tipo de uso de suelo afecta a la infeccion por Bd (Hernandez-Lopez et al, 2018), otros mencionan que no hay un efecto en la prevalencia en algunos tipos de ecosistemas (i.e. bosque mesofilo de montana) (Murrieta-Galindo et al, 2014). Sin embargo, la presencia posiblemente se deba a la alta humedad ambiental y a la susceptibilidad o resistencia de las especies al quitrido (i.e. Rheohyla miotympanum), tal como nuestros hallazgos lo demuestran.

En algunos estudios ecologicos, la infeccion por Bd no fue considerada como la causa directa de muerte y extincion de los anfibios (Burgin et al, 2005; McCallum, 2005). Hay muchas variables que afectan las interacciones de la triada ecologica: medio ambiente-fauna-ser humano (por ejemplo, la perdida de habitat, la contaminacion, las especies invasoras, la densidad de poblacion humana, el cambio climatico y otras causas desconocidas), e incrementan el riesgo de extincion (Sodhi et al., 2008). Estas presiones disminuyen las poblaciones de anfibios a nivel local, regional y mundial, y pueden predisponer a estos a brotes de enfermedades. Muchas especies de anfibios estan catalogadas por la UICN en diferentes niveles de riesgo, e incluyen los brotes epizooticos de Bd como una de las causas principales. Sin embargo, recientemente se ha determinado que solo el 14 por ciento de las especies de anfibios han exhibido quitridiomicosis (Heard, 2011). Esto indicaria que la reduccion de la poblacion de anfibios y las extinciones mundiales de especies tienen causas multifactoriales, incluido el componente epizootico y su interaccion con los componentes ambientales (i. e., la vulnerabilidad de Bd a los rangos de temperatura y humedad), pero puede no ser la etiologia principal.

https://doi.org/10.21829/azm.2019.3502066

AGRADECIMIENTOS. Al apoyo del Programa de Becas Posdoctorales de la Direccion General de Asuntos de Personal Academico de la Universidad Nacional Autonoma de Mexico (UNAM) otorgado a LMGF. Este proyecto fue posible gracias a la contribucion financiera de PAPIIT No. N210410-3 para DMB. El muestreo de A. mexicanum fue facilitado por el Centro de Investigaciones Biologicas y Acuicolas de Cuemanco de la Universidad Autonoma Metropolitana. Fahd Henry Carmona Torres (DEFSAL-FMVZ) proporciono algunas muestras de poblaciones silvestres. Shiara Gonzalez-Padron y Sein Cervantes por su apoyo en el trabajo de campo. A Carolina Segundo-Zaragoza por facilitar las actividades en el Laboratorio de Micologia, FMVZ-UNAM. La identificacion de especies de anfibios se realizo con la ayuda de Rene Murrieta-Galindo.

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Luis Manuel GARCIA FERIA (1,3) *, Dulce Maria BROUSSET (1), Roberto Arnulfo CERVANTES OLIVARES (2)

(1) Departamento de Etologia, Fauna Silvestre y Animales de Laboratorio. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autonoma de Mexico, Ciudad de Mexico, 04510, Mexico. <luis.garcia@inecol.mx>; <brousset@unam.mx>

(2) Laboratorio de Micologia. Departamento de Inmunologia y Microbiologia. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autonoma de Mexico, Ciudad de Mexico, 04510, Mexico. <raco@unam.mx>

(3) Red de Biologia y Conservacion de Vertebrados. Instituto de Ecologia, A. C. Carretera antigua a Coatepec No. 351. El Haya. 91073. Xalapa, Veracruz, Mexico. <luis.garcia@inecol.mx>

* Autor de correspondencia: <luis.garcia@inecol.mx>

Recibido: 09/08/2018; aceptado: 19/02/2019; publicado en linea: 10/07/2019

Editor responsable: Alberto Gonzalez Romero

Leyenda: Figura 1. Modelo de prediccion de presencia de Batrachochytrium dendrobatidis en 13 especies de anfibios adultos y dos de renacuajos y seis variables ambientales mediante un arbol de clasificacion y regresion.

Leyenda: Figura 2. Modelo de prediccion de presencia de Batrachochytrium dendrobatidis en anfibios adultos y renacuajos y seis variables ambientales mediante un arbol de clasificacion y regresion.
Cuadro 1. Tipo de vegetacion, temperatura y humedad de los sitios de
colecta de diferentes especies de anfibios para la deteccion de la
presencia de Batrachochytrium dendrobatidis. n = numero de individuos
examinados; n+ = numero de individuos positivos a Bd; [grados]C =
Temperatura ambiental promedio; HR = porcentaje de humedad relativa
promedio.

Vegetacion (a)                 Ubicacion

                 msnm           N                    O

BMM              1259   19[grados] 29' 27"   96[grados] 56' 48"
                 1449   19[grados] 03' 00"   96[grados] 59' 09"
                 1256   19[grados] 27' 37"   96[grados] 59' 23"
                 1449   19[grados] 03' 00"   96[grados] 59' 09"
                 1314   19[grados] 30' 58"   96[grados] 53' 27"
                 1045   19[grados] 24' 01"   96[grados] 58' 33"

Xerofila         1995   18[grados] 54' 19"   98[grados] 04' 21"

                 1316   18[grados] 12' 29"   97[grados] 54' 22"

Decidua          861    18[grados] 19' 39"   98[grados] 50' 02"

Bosque           2627   19[grados] 40' 14"   99[grados] 31' 24"
de encino

Humedal          2240   19[grados] 16' 57"   99[grados] 06' 09"

Bosque           2817   19[grados] 02' 55"   99[grados] 18' 52"
de pino

SAP              223    17[grados] 16' 16"   91[grados] 18' 51"

Vegetacion (a)   Especies (b)   Distribucion (c)

BMM                  Rhmi              E
                     Chta              E
                     Hyfl              NE
                     Eleu              NE
                     Libe              NE
                    R-Rhmi             E

Xerofila             Lisp              E
                    R-Lisp             E
                     Lisp              E
                     Hyar              NE
                     Spmu              NE

Decidua              Eleu              NE
                     Hyar              NE

Bosque               Hyex              E
de encino            Hyar              NE
                     Spmu              NE

Humedal              Amme              E

Bosque               Lisp              E
de pino             R-Lisp             E

SAP                  Rhho              NE
                     Lefr              NE
                     Smba              NE

Vegetacion (a)        Temporada seca            Temporada lluviosa

                 n    n+   [grados]C   HR   n    n+   [grados]C   HR

BMM              47   22     16.8      55   45   33     20.8      95
                 3    2      16.8      55   2    2      20.8      95
                                            2    2      20.8      95
                 1    1      16.8      55
                 2    2      16.8      55
                 32   26     16.8      55   13   11     20.8      95

Xerofila         9    0      17.5      43   16   11     18.5      63
                 13   6      17.5      43   17   14     18.5      63
                                            8    0      19.4      45
                 2    0      17.5      43   9    3      19.4      45
                             17.5      43   1    0      19.4      45

Decidua                                     1    0      21.5      50
                                            1    0      21.5      50

Bosque                                      16   1       17       70
de encino                                   1    1       17       70
                                            3    0       17       70

Humedal          12   9      18.4      31

Bosque           3    0       22       65   3    3       12       90
de pino          5    1       22       65   11   8       12       90

SAP                                         1    0      28.2      90
                                            8    2      28.2      90
                                            7    3      28.2      90

(a) BMM.- Bosque mesofilo de montana; SAP.--Selva alta perennifolia.

(b) Rhmi.--Rheohyla miotympanum; Chta.--Charadrahyla taeniopus; Hyfl.-
-Hyalinobatrachium fleischmanni; Eleu.--Eleutherodactylus sp.; Libe.-
-Lithobates berlandieri; R-Rhmi--Renacuajos de R. miotympanum; Lisp.-
-Lithobates spectabilis; R-Lisp.--Renacuajos de L. spectabilis; Hyar.-
-Hyla arenicolor; Spmu.--Spea multiplicata; Hyex.--Hyla eximia; Amme.-
-Ambystoma mexicanum; Rhho.--Rhinella horribilis; Lefr.--
Leptodactylus fragilis; Smba.--Smilisca baudinii.

(c) E.- Especie endemica; NE.--Especie no endemica.

Cuadro 2. Prevalencia de Batrachochytrium dendrobatidis segun el
estado de desarrollo y temporadas climaticas. N = numero de individuos
examinados; N+ = numero de individuos positivos a Bd.

Variable           Factor          N    N+    Prevalencia
                                                  (%)

Estado de         Adultos         203   97       47.78
desarrollo       Renacuajos       91    66       72.53
                   Total          294   163      55.44

Temporada      Temporada seca     129   69       53.49
climatica    Temporada lluviosa   165   94       56.97
                   Total          294   163      55.44

Adultos        Temporada seca     79    36       45.57
             Temporada lluviosa   124   61       49.19
                   Total          203   97       47.78

Renacuajos     Temporada seca     50    33       66.00
             Temporada lluviosa   41    33       80.49
                   Total          91    66       72.53

Variable           Factor            IC95% *

Estado de         Adultos         [+ o -] 6.87
desarrollo       Renacuajos       [+ o -] 9.17
                   Total          [+ o -] 5.68

Temporada      Temporada seca     [+ o -] 8.61
climatica    Temporada lluviosa   [+ o -] 7.55
                   Total          [+ o -] 5.68

Adultos        Temporada seca     [+ o -] 10.98
             Temporada lluviosa   [+ o -] 8.80
                   Total          [+ o -] 6.87

Renacuajos     Temporada seca     [+ o -] 13.13
             Temporada lluviosa   [+ o -] 12.13
                   Total          [+ o -] 9.17

* IC95% = Intervalo de confianza al 95% calculado para proporciones
(Heumann et al., 2016).

Cuadro 3. Prevalencia de Batrachochytrium dendrobatidis por temporada
climatica e indice de vida acuatica de 13 especies de anfibios adultos
y dos especies de renacuajos. N = numero de individuos examinados; IVA
= Indice de vida acuatica; n = numero de individuos en cada temporada
climatica; n+ = numero de individuos positivos a Bd en cada temporada
climatica; Prev = % de prevalencia.

Especie                           N    IVA *    Temporada seca

                                                n    n+     Prev

Rheohyla miotympanum             92    2.33    47    22    46.81
Charadrahyla taeniopus            5    2.67     3     2    66.67
Hyalinobatrachium fleischmanni    2    2.33
Eleutherodactylus sp.             2      1      1     1    100.00
Lithobates berlandieri            2      3      2     2    100.00
Lithobates spectabilis           39      3     12     0     0.00
Hyla arenicolor                  13    2.67     2     0     0.00
Spea multiplicata                 4    2.33
Hyla eximia                      16    2.67
Ambystoma mexicanum              12      3     12     9    75.00
Rhinella horribilis               1    2.33
Leptodactylus fragilis            8    2.33
Smilisca baudinii                 7    2.67
Total                            203           79    36    45. 57
Renacuajos de R. miotympanum     45      3     32    26    81.25
Renacuajos de L. spectabilis     46      3     18     7    38.89
Total                            91            50    33    66.00

Especie                          Temporada lluviosa

                                  n    n+     Prev

Rheohyla miotympanum             45    33    73.33
Charadrahyla taeniopus            2     2    100.00
Hyalinobatrachium fleischmanni    2     2    100.00
Eleutherodactylus sp.             1     0     0.00
Lithobates berlandieri
Lithobates spectabilis           27    14    51.85
Hyla arenicolor                  11     4    36.36
Spea multiplicata                 4     0     0.00
Hyla eximia                      16     1     6.25
Ambystoma mexicanum
Rhinella horribilis               1     0     0.00
Leptodactylus fragilis            8     2    25.00
Smilisca baudinii                 7     3    42.86
Total                            124   61    49. 19
Renacuajos de R. miotympanum     13    11    84.62
Renacuajos de L. spectabilis     28    22    78.57
Total                            41    33    80.49

* valores tomados de Hernandez-Lopez et al., 2018.
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Title Annotation:Articulo cientifico
Author:Garcia Feria, Luis Manuel; Brousset, Dulce Maria; Cervantes Olivares, Roberto Arnulfo
Publication:Acta Zoologica Mexicana (nueva serie)
Date:Jan 1, 2019
Words:10302
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