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Expresion de la proteina morfogenica osea 15 (BMP-15) durante la maduracion in vitro de ovocitos caninos.

Expression of bone morphogenetic protein 15 (BMP-15) during In vitro maturation in canine oocytes.

INTRODUCCION

La maduracion citoplasmatica y nuclear del ovocito son eventos fundamentales para una correcta fecundacion y desarrollo embrionario. La mayoria de los mamiferos ovulan un ovocito maduro en metafase II (MII) [12] y en estado de competencia citoplasmatica, es decir, con redistribucion de organelos y almacenamiento de transcriptos, nutrientes y factores del crecimiento [10]. Ademas, cercano a la ovulacion ocurre expansion de las celulas del cumulus que rodean al ovocito (mucificacion), proceso asociado con el reinicio meiotico [7, 11]. A traves de la produccion de diversos factores de crecimiento, el ovocito juega un rol protagonico, tanto en la regulacion y promocion del desarrollo folicular, como en su propia maduracion, estableciendo una comunicacion paracrina y bidireccional con las celulas del cumulus [6, 26]. Uno de estos factores es la proteina morfogenica osea 15 (BMP-15), miembro de la superfamilia de factores de crecimiento transformante [beta] (TGF-[beta]) ampliamente relacionada a la reproduccion mamifera. BMP-15 es expresado principalmente en el ovocito y reconocido por receptores BMPRIB (ALK6) en las celulas de la teca y del cumulus [11, 13, 16]. BMP-15 ha demostrado ser un regulador critico de la actividad de las celulas de la granulosa, donde su funcion ha sido relacionada con estimular mitosis y prevenir apoptosis [9]; promover glicolisis y biosintesis del colesterol [25]; sensibilizacion a la hormona luteinizante (LH) [27] y suprimir la produccion de progesterona (P4) y receptores a FSH [17]; expansion celular mediante regulacion de expresion de hialuronon sintetasa 2 (Has2) [11, 14, 24]. Por esto se ha relacionado a la fertilidad de ratones Mus musculus [7], ovejas Ovis orientalis [15], cerdos Sus scrofa [11] y humanos [28]. Sin embargo, su secrecion y rol biologico son especie-especificos, dificultando la extrapolacion de datos. Esto justifica su estudio dirigido en cada modelo biologico [29]. El modelo canino, Canis lupus falimiaris, de maduracion de ovocitos, es diferente al de otros mamiferos pues los ovocitos son ovulados sin haber reanudado la primera division meiotica, con su nucleo en estado diploide inmaduro (profase I) y las celulas del cumulus fuertemente unidas al ovocito, alcanzando la maduracion meiotica (MII) y mucificacion en el oviducto, 2 a 5 dias (d) luego de la ovulacion. Ademas, las concentraciones plasmaticas de P4 comienzan a incrementarse antes del peak preovulatorio de LH, asi los foliculos experimentan luteinizacion preovulatoria [2, 19, 23], por lo que la expresion de BMP-15 en la perra ha sido puesta en duda. Todas estas caracteristicas han dificultado la maduracion in vitro de ovocitos caninos, cuya tasa de exito (MII) no sobrepasa el 20% [1]. Este hecho restringe la aplicacion de biotecnologias reproductivas en la perra y caninos silvestres en riesgo.

Este estudio propone que en caninos, el inusual patron de mucificacion y retardo en el reinicio meiotico puede estar relacionado a diferentes patrones de expresion de BMP-15, por lo que se evaluo su presencia y patron de expresion durante el cultivo in vitro de ovocitos caninos, en relacion a la progresion meiotica y mucificacion.

MATERIALES Y METODOS

El uso de animales ha sido aprobado por el comite de bioetica del Fondo Nacional de Desarrollo Cientifico y Tecnologico (FONDECYT).

Recoleccion de ovarios y ovocitos

Ovarios y oviductos fueron obtenidos de perras mestizas clinicamente sanas, de 1 a 6 anos y en diferentes estados del ciclo. Luego de la ovario histerectomia, los tejidos fueron transportados al laboratorio, durante 30 minutos, en Suero Buffer fosfato (PBS) a 37[grados]C, y mediante cortes Anos de los ovarios se obtuvieron y seleccionaron bajo lupa estereoscopica (Nikon SMZ-10, Japon) complejos cumulus ovocito (COCs) utilizado los siguientes criterios: Citoplasma oscuro y uniforme, diametro >100 pm y rodeado por al menos 3 capas de celulas del cumulus [4]. Los COCs fueron procesados como no madurados o sometidos a maduracion in vitro.

Maduracion in vitro de ovocitos

Quince a 20 COCs fueron cultivados en gotas (100 pL) de medio de cultivo TCM-199 suplementado (25 mM HEPES, 10% suero fetal bovino, 0,25 mM de piruvato, 10 IU/mL de hCG, 100 IU/mL de penicilina y 0,2 mg/mL de estreptomicina) por 48; 72 y 96 horas (h) a 38,5 [grados]C en atmosfera de 5% C[O.sub.2] y humedad saturada (3166, Forma Scientific, Inc, EUA) [1]. Se realizaron 4 replicas por cada experimento.

Maduracion in vivo de ovocitos

Mediante lavado con PBS a 37[grados]C, se obtuvieron COCs de oviductos de perras, 2 a 3 d luego de su ovulacion. El momento de ovulacion fue estimado antes de la cirugia, utilizando citologia vaginal, concentracion plasmatica de progesterona y ecografia Doppler color (Mindray, Z5 Vet, EUA), segun reportes previos [1, 3].

Los COCs obtenidos por diversos metodos y en distintos tiempos de cultivo, fueron procesados intactos o se les extrajo las celulas del cumulus (denudados) mediante pipeteo, conformando 2 grupos: COCs y ovocitos denudados, BMP-15 se evaluo en ambos grupos usando Western Blotting e inmunofluorescencia indirecta. Solo en los COCs se evaluo expansion en las celulas del cumulus.

Evaluacion de la expansion de las celulas del cumulus (mucificacion).

Utilizando un microscopio invertido (Nikon TMS 301953, Tokyo, Japon) a 200x de magnificacion se evaluo el grado de expansion de las celulas del cumulus, en base a la siguiente categorizacion: 0) No expandido; 1) Minima expansion; 2) Expansion de las celulas mas externas; 3) expansion de todas las capas del cumulus menos de la corona radiada; 4) expansion de todas las capas. [18].

Inmunofluorescencia de BMP-15

Se utilizo el anticuerpo policlonal antihumano BMP-15 (AF2925, R&D Systems, EUA) en dilucion 1/100 y anticuerpo secundario conjugado a Isotiocinato de Fluoresceina (FITC) (SC2356) en dilucion 1/1500. Se considero un control negativo usando solo el segundo anticuerpo [1]. Mediante microscopio Olympus IX71 Japon, equipado con camara Olympus ProgRes-Capture Japon, se obtuvo imagenes en escala de grises y se calculo la fluorescencia total corregida (CTCF) [1], estableciendo 3 patrones de fluorescencia: Bajo (B) menor a 5x[10.sup.6]; Medio (M) entre 5 y 10 x [10.sup.6]; Alto (A) mayor a 10 x [10.sup.6]. Para la inmunolocalizacion se uso microscopia confocal (Zeiss 410-Axiovert 100, Jena, Alemania) usando una laser de 543 nm en magnificacion de 200X.

Evaluacion de progresion meiotica nuclear

Los ovocitos fueron incubados por 10 minutos a temperatura ambiente con DAPI 1[micro]g/mL (40'-6-diamidino-2-phenylindole staining) (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, EUA) para ser evaluados en el microscopio. Segun la configuracion de la cromatina, fueron clasificados en: Vescicula germinativa (GV), Ruptura de la Vescicula (GVBD); Metafase I (MI) y Metafase II (MII) [3].

Western Blotting para BMP-15

100 ovocitos denudados y 100 COCs de cada grupo fueron sometidos a Western Blotting segun reportes previos [1] utilizando anticuerpo primario policlonal contra BMP-15 humano (AF2925, R&D Systems, EUA) en dilucion 1/100 y anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina (rabbit anti-goat IgG-AP, SC-2771) en dilucion 1/300. Los sitios inespecificos se bloquearon en TBS-Tween al 0,1% (Sigma, St. Louis, MO, EUA) mas 5% de leche descremada. Para detectar la reactividad del anticuerpo, se utilizo el metodo enzimatico de la fosfatasa alcalina, en solucion de BCIP/NBT (SC-24981) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, EUA). [beta]-actina (Goat policlonal IgG Actin, SC-1615) fue utilizado como control de carga. La intensidad de banda se calculo a traves del programa GEL-PRO ANALYZER V3.1 (Media Cybernetics, Inc., MD, EUA) [1].

Analisis estadistico

La prueba de independencia de Pearson [1] fue utilizada para determinar asociacion entre el tiempo de cultivo y la expansion de las celulas del cumulus, asi como tambien para determinar asociacion entre las variables tiempo de cultivo, patron de fluorescencia y progresion meiotica. ANOVA con posterior prueba de Tukey [1] fue utilizado para comparar la densidad de banda en western blotting. Se determino el coeficiente de correlacion de Pearson [1] entre intensidad de banda y grado de mucificacion. Se utilizo el software InfoStat Professional Program, Version 2004 (Universidad Nacional de Cordoba, Argentina), considerando un 95% de significancia estadistica.

RESULTADOS Y DISCUSION

Los materiales y metodos utilizados en esta investigacion fueron utiles para reconocer, por primera vez en la perra, la presencia de BMP-15 durante la maduracion de ovocitos. Este estudio, tambien fue capaz de determinar el patron de expresion de BMP-15 y relacionarlo a la progresion meiotica y la mucificacion, dos eventos que ocurren tardiamente en la perra, por lo que permite abrir la discusion sobre el verdadero papel e importancia biologica de esta proteina en la maduracion de ovocitos caninos. Estudios realizados en individuos homocigoticos recesivos para BMP-15, determinaron la ocurrencia de trastornos de fertilidad, sin embargo, mientras que en ovinos esta se explicaba por fallas en los primeros momentos del desarrollo folicular [5, 15], en ratas Rattus rattus se explico por fallas cercanas a la ovulacion [29], demostrando especie-especificidad en el rol biologico de BMP-15, justificando el estudio dirigido en cada especie. Estudios funcionales en caninos deben ser realizados.

Expansion de las celulas del cumulus

El grado de mucificacion incremento en relacion al tiempo de maduracion (Pearson Ji [cuadrado.sub.(16)] = 2,7e03) (Pr = 0.00001). Mientras que el 100% de los ovocitos no madurados mostraron nivel 0 de expansion, un progresivo y significativo aumento en la expansion celular fue visto durante la progresion de la maduracion in vitro. Los ovocitos madurados in vivo no presentaron nivel 0 de expansion y por el contrario presentaron el mayor porcentaje de nivel 4 (FIG. 1). Si bien, todos los COCs no madurados mostraron grado de expansion 0, diversos grados de expansion se determinaron durante el cultivo, aumentando progresivamente durante la maduracion y alcanzando significacion estadistica a partir de las 48 h, lo cual concuerda con lo informado anteriormente para la perra [1]. La mucificacion progresiva tambien esta descrita para las cerdas [11, 18], sin embargo, en esta especie la significacion estadistica se logra tempranamente (18 h de cultivo) lo que permite inferir que en la perra hay una mayor estabilidad de las uniones intercelulares entre el cumulus y el ovocito, o que los mecanismos biologicos que la producen estan retardados. En el presente estudio, los mayores grados de expansion celular ocurrieron a las 96 h de cultivo in vitro y en los COCs ovulados, siendo significativamente mayores en estos ultimos, generando una discusion similar a la establecida en informes anteriores [1, 3], en relacion a que las condiciones in vitro utilizadas actualmente no imitan de buena manera las condiciones in vivo, alcanzando estados de submaduracion.

Inmunofluorescencia BMP-15

Tecnicas de microscopia confocal (Zeiss 410-Axiovert 100, Jena, Alemania) y fluorescencia convencional (microscopio Olympus IX71 Japon) fueron de utilidad para inmunolocalizar la proteina BMP-15 determinando su presencia y distribucion espacial en COCs y ovocitos caninos. El anticuerpo policlonal contra BMP-15 humano (AF2925, R&D Systems, EUA), fue de utilidad para reconocer, por primera vez en la perra, la presencia de BMP-15, lo cual denota una gran conservacion de esta proteina entre especies. La ausencia de inmunomarcaje en el control negativo determino la especificidad de la reaccion antigeno-anticuerpo. BMP-15 estuvo presente, tanto en las celulas del cumulus como en el ovocito (FIG. 2). Esta informacion concuerda con los reportes en bovinos Bos taurus, caprinos Capra aegagrus y porcinos Sus scrofa [8, 17, 18, 22], pero difiere con el modelo murino Mus musculus, donde la presencia de ARNm y proteinas BMP-15 solo se ha reportado en el ovocito [29]. En datos no publicados, del laboratorio donde se realizo este trabajo, los niveles de ARNm para BMP-15 aumentaron progresivamente durante el desarrollo folicular y la maduracion in vitro de ovocitos caninos, tanto en las celulas del cumulus como en el ovocito, este hecho permite inferir que la presencia y la sintesis de la proteina ocurre en ambos tipos celulares.

Los patrones de intensidad de inmunofluorescencia Bajo (B) y Alto (A) mostraron un comportamiento inverso a lo largo del cultivo (FIG. 3). Mientras el patron B disminuyo progresivamente, el patron A aumento alcanzando significancia (P<0,05) desde las 96 h de cultivo. El mayor porcentaje de patron A fue reconocido en los ovocitos ovulados. El patron Medio (M) incremento progresivamente alcanzando su maximo porcentaje a las 72 h de cultivo para luego disminuir progresivamente. La intensidad de fluorescencia esta relacionada con el tiempo de cultivo (Pearson Ji [cuadrado.sub.(8)] = 157,0633 Pr = 0,0001). La tincion DAPI [1], permitio reconocer la progresion meiotica a lo largo del cultivo (FIG. 4), permitiendo determinar asociacion entre el tiempo de cultivo y la progresion meiotica (Pearson Ji [cuadrado.sub.(12)] = 283,7183 Pr = 0,0001) representado por un mayor porcentaje de vesicula germinativa (VG) al inicio del cultivo y un incremento del porcentaje de MII a medida que el cultivo progresa. La intensidad de fluorescencia (BMP-15) esta relacionada a la progresion meiotica (Pearson Ji [cuadrado.sub.(6)] = 94,665 Pr = 0,0001) (TABLA I). Las condiciones utilizadas en este estudio para la maduracion in vitro permitieron que los ovocitos de la perra consiguieran reanudar la meiosis desde GV al estado nuclear MII, logrando correlacionar los niveles de proteina con la progresion meiotica. Doce de 54 ovocitos cultivados durante 96 h llegaron al estado nuclear MII (22,2% MII), este porcentaje esta de acuerdo con lo informado anteriormente para la perra [1]. Ademas se correlaciono la progresion meiotica con la mucificacion, ambos eventos se producen en forma retardada en la perra y su relacion se ha descrito en otras publicaciones, principalmente a traves de la activacion del Factor promotor de la Mitosis (PMF) dado a la disminucion del AMPc generada por la interrupcion de las uniones comunicantes entre ovocito y las celulas del cumulus en etapas preovulatorias [20, 21]. El retardo en la mucificacion, durante la maduracion de ovocitos caninos, se ha senalado como un factor que contribuye al retardo en la reanudacion meiotica y el bajo exito de la maduracion in vitro de ovocitos caninos.

Western Blotting BMP-15

Mediante Western Blotting se determinaron los niveles de expresion de BMP-15 en ovocitos denudados y COCs (FIG. 5). Dos bandas de 56 y 16 KDa representaron a la preproteina y la proteina madura, respectivamente, caracterizando una tipica proteina perteneciente a la familia TGF p lo cual concuerda con lo anteriormente descrito para BMP-15 en cerdos Sus scrofa [11]. Ambos marcajes estuvieron presentes en ovocitos y COCs, en todos los tiempos estudiados, incrementando progresivamente en asociacion al tiempo de cultivo. La preproteina siempre mostro mayores niveles de expresion que la proteina madura, esta diferencia alcanzo significancia desde las 72 h de cultivo, lo cual denota una mantencion de la actividad de sintesis proteica y de las modificaciones postraduccionales, infiriendo ademas que estos mecanismos biologicos se incrementan hacia los momentos finales del cultivo, cuando tambien aumento la progresion meiotica, intensidad de fluorescencia y mucificacion, lo cual sugiere una relacion entre todas estas variables. La preproteina incremento progresivamente durante el cultivo alcanzando significancia desde las 72 h (P<0,05), tanto para denudados como para COCs, pero en los denudados el incremento significativo se mantuvo hasta las 96 h. El incremento de la proteina madura alcanzo significancia a las 72 h en denudados y a las 96 h en COCs. Los niveles de expresion para ambas proteinas fueron menores en ovocitos denudados que en COCs, lo cual permite inferir la presencia de BMP-15, tanto en el ovocito como en las celulas del cumulus, reforzando la informacion reportada en los metodos de inmunofluorescencia. Sin embargo, los valores de BMP-15 en el ovocito fueron mayores que en las celulas del cumulus, denotando que los ovocitos son la principal fuente de produccion de BMP-15 en la perra. Por otra parte, mientras que la proteina madura mantuvo un aumento progresivo hasta las 96 h en cultivo de COCs, en los ovocitos denudados detuvo su aumento a las 96 h, este hecho podria denotar una mayor participacion de las celulas del cumulus hacia los momento final de la maduracion in vitro de los ovocitos y explicar otro papel relevante de estas celulas en la maduracion de ovocitos de la perra. Todo lo anteriormente expuesto, concuerda con lo descrito en la fisiologia reproductiva de la perra, en donde la maduracion (MII) y mucificacion se logran tardiamente en el oviducto, 72 a 96 h post ovulacion [19, 23], el mismo en que se consiguen altos niveles de BMP-15 en condiciones in vitro.

CONCLUSIONES

BMP-15 esta presente, tanto en el ovocito como en las celulas del cumulus de la perra, sus niveles aumentan progresivamente conforme avanza el cultivo in vitro y esta correlacionada a la progresion meiotica y mucificacion, siendo relevante en la maduracion del ovocito canino.

AGRADECIMIENTO

Este trabajo fue patrocinado por los proyectos 1110265 y 1140658 del Fondo Nacional de Desarrollo Cientifico y Tecnologico (FONDECYT).

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Recibido: 25/09/2015 Aceptado: 13/06/2016

Rodrigo Andres Castro-Sanchez (1) * y Jaime Alfredo Palomino-McKenney (1).

(1) Laboratorio de Reproduccion Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile, Santiago de Chile. Becario CONICYT * Telefono: 56 9 87906221; Correo electronico: rocavet@gmail.com

Leyenda: FIGURA 1. DISTRIBUCION PORCENTUAL DE COCS CANINOS SEGUN GRADO DE EXPANSION DE LAS CELULAS DEL CUMULO Y TIEMPO DE MADURACION

Leyenda: FIGURA 2. INMUNOLOCALIZACION DE BMP-15 EN OVOCITOS DENUDADOS (A, B Y C) Y EN COCS (D, E Y F) USANDO MICROSCOIA DE CONTRASTE DE FASE (A Y D), FLUORESCENCIA CONVENCIONAL (B Y E) Y CONFOCAL (C Y F).

Leyenda: FIGURA 3. DISTRIBUCION PORCENTUAL DEL PATRON DE INMUNOFLUORSCENCIA DE BMP-15 (BAJO, MEDIO, ALTO) EN OVOCITOS DE PERRA SEGUN TIEMPO DE CULTIVO. Letras distintas indican diferencia entre barras (P<0,05) a, b y c: Patron bajo; d y e: Patron medio; f y g: Patron alto. *, #: Simbolo distinto dentro de grupo denotan diferencia (P<0,05)

Leyenda: FIGURA 4. INMUNOFLUORESCENCIA DE BMP-15 Y PROGRESION MEIOTICA EN OVOCITOS DE PERRA. Imagen muestra patrones representativos de intensidad de fluorescencia (Bajo:b; Medio: b; Alto: a) en relacion al estado nuclear (GV: Vescicula germinativa; GVDB: Ruptura de vescicula germinativa; PB: Corpusculo polar; MII: Metafase II).

Leyenda: FIGURA 5. WESTERN BLOT DE BMP-15 DURANTE MADURACION In vitro DE COCS (IZQUIERDA) Y OVOCITOS DENUDADOS (DERECHA). BANDAS OBTENIDAS EN ELECTROFORESIS SON REPRESENTADAS ABAJO. INTENSIDAD DE BANDA SON GRAFICADAS ARRIBA. Letras distintas denotan diferencia, A, B, C, D: Representan barras de preproteina. a, b, c, d: Representan barras de proteina madura. * denota diferencia entre niveles de preproteina y proteina madura dentro de grupo (P<0,05)
TABLA I
DISTRIBUCION PORCENTUAL DE OVOCITOS DENUNADOS DE PERRA CON DISTINTOS
TIEMPOS DE MADURACION, SEGUN PATRON DE EXPRESION DE BMP-15 Y GRADO DE
PROGRESION MEIOTICA.

              Patron de
Grupos de     expresion
ovocitos       BMP-15        Grados de Progresion meiotica

                              GV = 44          GVBD = 32
No                A              --                --
madurados         M        8 (15,69) (aA)    2 (3,92) (aBx)
N = 51            B       35 (68,63) (bAx)   6 (11,76) (bBx)
IVM por 48h       A              --           1 (1,92) (a)
N = 52            M              --          9 (17,31) (bAy)
                  B        1 (1,92) (Ay)     6 (11,54) (cBx)
IVM por 72h       A              --                --
N = 54            M              --          4 (7,41) (aAx)
                  B              --          1 (1,85) (bAy)
IVM por 96h       A              --          1 (1,85) (aA)
N = 54            M              --          2 (3,70) (aAx)
                  B              --                --
Ovulados          A              --                --
N = 20            M              --                --
                  B

              Patron de
Grupos de     expresion
ovocitos       BMP-15      Grados de Progresion meiotica

                              MI = 114           MII = 41
No                A              --                 --
madurados         M              --                 --
N = 51            B              --                 --
IVM por 48h       A        1 (1,92) (ax)            --
N = 52            M       13 (25,00) (bAx)    2 (3,85) (Bx)
                  B       19 (36,54) (cCx)          --
IVM por 72h       A       10 (18,52) (aAy)    5 (9,26) (aBx)
N = 54            M       26 (48,15) (bBy)    3 (5,56) (bAx)
                  B        4 (7,41) (cBy)     1 (1,85) (cA)
IVM por 96h       A       28 (51,85) (aBz)    8 (14,81) (aCy)
N = 54            M        9 (16,67) (bBz)    3 (5,56) (bAx)
                  B        2 (3,70) (cAy)     1 (1,85) (cA)
Ovulados          A        2 (10,00) (Ax)    15 (75,00) (aBz)
N = 20            M              --           3 (15,00) (bx)
                  B

              Patron de
Grupos de     expresion
ovocitos       BMP-15     Total N = 231 (%)

No                A               --
madurados         M           10 (19,61)
N = 51            B           41 (80,39)
IVM por 48h       A            2 (3,85)
N = 52            M           24 (46,15)
                  B           26 (50,00)
IVM por 72h       A           15 (27,78)
N = 54            M           33 (61,11)
                  B            6 (11,11)
IVM por 96h       A           37 (68,52)
N = 54            M           14 (25,93)
                  B            3 (5,56)
Ovulados          A           17 (85,00)
N = 20            M            3 (15,00)
                  B

Los datos se presentan como % dentro de los grupos de maduracion.
IVM = Maduracion in vitro. Patrones de expresion: A = Alto; M = Medio;
B = Bajo. Grados de progresion meiotica: GV = Vescicula germinativa;
GVBD = Ruptura de vescicula germinatica; MI = Metafase I; MII =
Metafase II. a,b: Valores dentro de la misma columna y grupo de
ovocitos con diferentes superindices, difieren (P<0,05) A,B,C: Valores
dentro de una misma fila con diferente superindice, difieren
(P < 0,05). x,y,z: Valores dentro de una misma columna y patron de
fluorescencia con diferente superindice, difieren (P < 0,05).
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Author:Castro-Sanchez, Rodrigo Andres; Palomino-McKenney, Jaime Alfredo
Publication:Revista Cientifica de la Facultad de Ciencias Veterinarias
Date:Jul 1, 2016
Words:4810
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