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Ex vitro and in vitro leaf anatomy of Tabebuia roseo alba (Ridl.) Sand.--Bignoniaceae/ Anatomia foliar de ipe-branco (Tabebuia roseo alba (Ridl.) Sand.)--Bignoniaceae, proveniente do cultivo ex vitro e in vitro.

Introducao

Especies lenhosas propagadas in vitro sao frequentemente afetadas por varios fatores do meio de cultura, que podem ocasionar degeneracao metabolica e morfologica. A compreensao apropriada da estrutura basica de uma planta ou orgao e essencial e indispensavel para se chegar a um conhecimento adaptativo do vegetal (CASTRO, 2002). Diferentes condicoes ambientais influenciam diretamente a sua anatomia (LIMA, 2004). Alteracoes na morfologia foliar podem influenciar processos metabolicos e fisiologicos, associados, principalmente, a fotossintese e transpiracao. Muitas dessas evidencias indicam que o estado da agua e a fase gasosa durante os varios estagios da cultura de tecidos sao a chave dos fatores envolvidos na desorganizacao morfologica de plantas cultivadas in vitro (FIDELIS et al., 2000).

As desordens anatomicas sao menos significativas em caule e raizes, porem sua manifestacao nas folhas afeta os dois principais processos realizados por estas, isto e, a fotossintese e as trocas gasosas (DEBERG; MAENE, 1984).

A anatomia foliar em plantas micropropagadas e de grande importancia para estudos comparativos do desenvolvimento de seus tecidos e estruturas adaptativas, como espessura de cuticula, disposicao de celulas, dimensao e numero de estomatos, entre outros. Esses estudos podem servir de base para pesquisas relacionadas ao desenvolvimento durante a aclimatizacao, a qual se caracteriza por uma elevada mortalidade, muitas vezes, inviabilizando a micropropagacao de algumas especies (MARTINOTTO, 2004).

De acordo com Preece e Compton (1991), a elevada umidade relativa e a baixa irradiancia no ambiente in vitro sao os principais fatores que atuam na inducao de alteracoes e funcionalidade de orgaos e tecidos, levando-os a incapacidade de controlar as perdas de agua quando submetidos a condicoes adversas, como a aclimatizacao.

As plantas crescidas in vitro podem apresentar caracteristicas peculiares como: abundancia de espacos intercelulares, sistema vascular pouco desenvolvido e reduzida capacidade de sustentacao (esclerenquima e colenquima), estomatos nao-funcionais, baixa atividade autotrofica e outros tipos de desordens (CAMPOSTRINI; OTONI, 1996).

Em estudos histologicos de orgaos vegetativos de plantas propagadas in vitro foi verificado que eles apresentavam estruturas pouco diferenciadas se comparados com plantas cultivadas em casa-de-vegetacao ou ambiente natural (FIDELIS et al., 2000; SANTOS, 2001; SOARES, 2003).

Considerando a importancia do conhecimento da anatomia para a definicao de um protocolo de micropropagacao para o ipe-branco, este estudo teve como objetivo comparar a estrutura interna de folhas desta especie, oriundas de plantulas cultivadas ex vitro e in vitro.

Material e metodos

Para as avaliacoes anatomicas, foram utilizadas folhas coletadas do primeiro no de ramos, da base para o apice, de plantulas mantidas in vitro e de uma arvore adulta de campo (ex vitro) localizada proximo a Portaria do campus da Universidade Federal de Lavras (UFLA), situada a 855 m de altitude, 21[degrees]13'51.91"S de latitude e 44[degrees]59'41.01"W GRW de longitude.

As folhas de plantulas cultivadas in vitro foram oriundas de sementes de ipe-branco inoculadas em meio de cultura MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) com 50% de concentracao de sais, suplementado com 30 g [L.sup.-1] de sacarose e 1 g [L.sup.-1] de G[A.sub.3] e 0,6 g [L.sup.-1] de agar em tubo de ensaio, mantidas por 30 dias em sala de crescimento, em condicoes controladas de temperatura 25 [+ or -] 2[degrees]C, fotoperiodo de 16h e irradiancia de 35 [micro]mol [m.sup.-2] [s.sup.-1], fornecida por lampadas do tipo fluorescente branca fria.

Os materiais vegetais ex vitro e in vitro foram fixados em FAA (0,5% de formaldeido, 0,5% de acido acetico e 90% de alcool 70[degrees]GL) por 72h e, posteriormente, conservados em alcool 70[degrees]GL. O estudo anatomico das folhas se baseou no exame microscopico de secoes paradermicas abaxiais e adaxiais e secoes transversais do limbo foliar.

Para a avaliacao dos tecidos foliares (espessura da nervura central, limbo foliar, epiderme adaxial e abaxial e dos parenquimas palicadico e esponjoso), foram realizados cortes transversais na regiao mediana das folhas obtidos em microtomo, clarificados em solucao de hipoclorito de sodio (1%) por 10 min. e submetidos a coloracao de azul de astra (95%)/safranina (5%), baseada na metodologia adaptada de Kraus e Arduin (1997). As laminas foram montadas em glicerina 50%.

Para os estudos relativos a caracterizacao dos estomatos (numero medio por [mm.sup.2], diametro polar e equatorial, densidade estomatica e densidade dos tricomas), foram realizados cortes paradermicos na regiao mediana das folhas, na epiderme das faces abaxial e adaxial, manualmente com auxilio de lamina de aco, clarificados em solucao de hipoclorito de sodio (1%), por 5 min., e submetidos a coloracao de Azul de Toluidina. As laminas foram montadas em glicerina 50%.

A partir das secoes paradermicas e transversais, com o auxilio de ocular micrometrica, foram efetuadas as medicoes. As fotomicrografias foram obtidas utilizando-se microscopio Ken-a-Vision TT18 e camera digital Canon PowerShot A620. O software de Medicao utilizado foi o Sigma Pro.

O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, constituido de 24 repeticoes nos cortes transversais e 48 repeticoes nos cortes paradermicos, correspondentes a tres folhas oriundas de ipe-branco. Os tratamentos foram representados por duas condicoes de cultivo (ex vitro e in vitro). Apos a analise de variancia, utilizou-se o teste Scott-Knott a 5% de probabilidade, para a comparacao das medias entre tratamentos.

Resultados e discussao

Foram observadas diferencas anatomicas entre os tecidos de folhas provenientes do cultivo in vitro e ex vitro. Essas diferencas tambem foram observadas por diversos autores que compararam as anatomias de folhas in vitro e ex vitro de outras especies, como mama-cadela (Brosimum gaudichaudii) (FIDELIS et al., 2000), inga (Inga vera) (SOARES, 2003), Anonna glaba (DECCETTI, 2004), sangra d'agua (Croton urucurana) (LIMA, 2004), candeia (Eremanthus erythropappus) (ROSAL, 2004), cagaita (Eugenia dysenterica) (MARTINOTTO, 2004), abacaxi (BARBOSA et al., 2006), entre outras.

Diferenca nas caracteristicas anatomicas das folhas

As folhas de ipe-branco, cultivadas tanto in vitro como ex vitro, apresentaram organizacao dorsiventral. Esses resultados condizem com os de Metcalfe e Chalk (1957), em que todas as especies de Bignoniaceae sao dorsiventrais, sendo registrada estrutura isobilateral apenas no genero Kigelia. Por outro lado, Souza e Oliveira (2004), estudando Tabebuia avellanedae e T. chrysotricha, encontraram dorsiventralidade apenas nos eofilos e isobilateralidade nos metafilos.

Secoes transversais das laminas foliares de todos os ambientes de cultivo demonstraram que tanto a epiderme da face adaxial quanto a epiderme da face abaxial apresentam-se uniestraficadas. O parenquima palicadico esta voltado para a superficie adaxial e o parenquima esponjoso voltado para a superficie abaxial. Ocorre maior desenvolvimento de todas as folhas ex vitro e o parenquima palicadico e pouco diferenciado. Nas folhas provenientes do cultivo in vitro, nao se observou a presenca de cuticula nas faces adaxial e abaxial, conforme se visualiza na Figura 1. Segundo Fraguas (2003), a ausencia de formacao de ceras epicuticulares, aliada a alteracao na composicao quimica delas, e uma das caracteristicas que possivelmente pode ser induzida pela condicao in vitro, contribuindo para a dessecacao das mudas apos transferencia para a casa-de-vegetacao, causada pela excessiva perda de agua.

[FIGURA 1 OMITTED]

Uma das diferencas verificadas entre a regiao vascular da nervura central das folhas produzidas in vitro e ex vitro e o esclerenquima. Observa-se que fibras diferenciam-se sobre o floema nos feixes vasculares das folhas ex vitro e estao ausentes no cultivo in vitro. O esclerenquima e um tecido que fica proximo ao eixo vascular, responsavel por dar maior sustentacao as plantas. Soares (2003) tambem observou essa caracteristica ao comparar folhas de inga (Inga vera) in vitro e ex vitro e afirma que a ausencia dessa estrutura em folhas micropropagadas as torna menos resistentes e com aparencia mais fragil.

As folhas de ipe-branco sao hipostomaticas e apresentam tricomas estrelados em ambas as faces (Figura 2). Souza e Oliveira (2004) tambem encontraram estomatos somente na face abaxial nas especies de Tabebuia avellanedae e T. chrysotricha. Tricomas tectores tambem sao encontrados em T. avellanedae, apresentando-se com tamanho reduzido, extremidade afilada e sao unicelulares. Em T. chrysotricha, os tricomas tectores sao pluricelulares, alongados e ramificados (SOUZA; OLIVEIRA, 2004).

[FIGURA 2 OMITTED]

As folhas ex vitro, provindas de plantas de campo, tiveram espessuras superiores as do cultivo in vitro quanto a espessura do limbo foliar, da nervura central, da epiderme adaxial e abaxial e dos parenquimas palicadico e esponjoso (Tabela 1).

Trabalhos com cortes histologicos da nervura de folhas obtidas in vitro e ex vitro de cafeeiro (SANTOS, 2001) e inga (Inga vera) (SOARES, 2003) obtiveram resultados bastante semelhantes, com aumento do numero de celulas do xilema em largura e espessura, em plantas oriundas do ambiente natural.

Plantas cultivadas ex vitro apresentaram espessuras superiores as do cultivo in vitro em todos os tecidos. Resultados semelhantes tambem foram encontrados por Fidelis et al. (2000), Lima (2004) e Martinotto (2004) trabalhando, respectivamente, com mama-cadela (Brosimun gaudichaudii), sangra d'agua (Croton urucurana) e cagaita (Eugenia dysenterica), cultivadas em ambiente natural e in vitro.

No ambiente natural, a alta intensidade luminosa contribui para o espessamento foliar e a elongacao do parenquima palicadico (CASTRO, 2002). Folhas de plantas crescidas em ambientes ensolarados apresentam taxa fotossintetica mais elevada e sao menores, mais pesadas e mais espessas por unidade de area, em comparacao com plantas crescidas a sombra (BOARDMAN, 1977; BJORKMAN, 1981). O aumento na espessura da folha, especialmente pelo alongamento ou adicao de celulas palicadicas, esta relacionado a reducao na resistencia do mesofilo ao dioxido do carbono (NOBEL, 1977) e correlacionado com aumento de fatores potencialmente limitantes a fotossintese, como a RuBisco, carregadores de eletrons ou condutancia estomatal (BJORKMAN, 1981). Chazdon e Kaufman (1993), estudando duas especies de Piper, observaram que a capacidade fotossintetica estava correlacionada com a espessura do mesofilo.

Plantas mantidas ex vitro apresentaram menor numero de estomatos e maior numero de tricomas. O maior numero de estomatos observados em plantulas cultivadas in vitro, provavelmente, foi provocado pelo ambiente do tubo, com alta umidade e temperatura amena. Esses resultados concordam com Martinotto (2004) que observou, em seu estudo com E. dysenterica, que a densidade estomatica e maior em folhas de plantulas in vitro do que em folhas de campo. As condicoes ambientais que influenciam as trocas gasosas provocam alteracoes no desenvolvimento estomatico; segundo Fraguas (2003), a baixa luminosidade e a pequena troca gasosa do ambiente in vitro provocam aumento no numero de estomatos, pois estes sao menos funcionais que os estomatos ex vitro.

A densidade estomatica das folhas de ipe-branco in vitro e ex vitro difere estatisticamente. No cultivo in vitro, onde a umidade era alta, ocorreu maior numero de estomatos por area. Isso se deve ao fato de os estomatos serem os responsaveis pelas perdas de agua nas plantas, diminuindo sua densidade nas plantas de ambiente natural, onde menor quantidade de estomatos diminui a perda de agua e possibilita a sobrevivencia em condicoes de estresse hidrico. O maior numero de tricomas nas folhas ex vitro tambem contribui para diminuir o excesso de transpiracao. Os estomatos de folhas cultivadas in vitro sao maiores em comparacao com os estomatos de folhas ex vitro.

Conclusao

Folhas de plantas cultivadas ex vitro apresentaram cuticula e esclerenquima que sao ausentes nas folhas in vitro. Em comparacao com as do cultivo in vitro, folhas ex vitro tambem apresentaram maior espessura quanto ao limbo foliar, a nervura central, a epiderme adaxial e abaxial e aos parenquimas palicadico e esponjoso, alem de menor numero de estomatos e maior numero de tricomas. Os estomatos de folhas cultivadas in vitro sao maiores que os estomatos de folhas ex vitro.

DOI: 10.4025/actascibiolsci.v31i3.1937

Received on April 6, 2008.

Accepted on October 7, 2008.

Referencias

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Leticia Caravita Abbade *, Patricia Duarte de Oliveira Paiva, Renato Paiva, Evaristo Mauro de Castro, Agda Rabelo Centofante e Cynthia de Oliveira

Laboratorio de Cultura de Tecidos de Plantas, Setor de Fisiologia Vegetal, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras, Cx. Postal 3037, 37200-000, Lavras, Minas Gerais, Brasil. * Autor para correspondencia. E-mail: leticiabbade@yahoo.com.br
Tabela 1. Espessura media do limbo foliar e da nervura central
de laminas foliares de ipe-branco cultivado ex vitro e in vitro por 30
dias.

                       Espessura ([micro]Am)

Tipo de Cultivo   Limbo Foliar   Nervura Central

Ex vitro          177,44 a       951,55 a
In vitro           84,95 b       360,21 b

* Medias seguidas de mesma letra nas colunas nao diferem pelo teste
de Tukey em nivel de 5% de significancia.
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Author:Abbade, Leticia Caravita; Paiva, Patricia Duarte de Oliveira; Paiva, Renato; de Castro, Evaristo Mau
Publication:Acta Scientiarum Biological Sciences (UEM)
Article Type:Report
Date:Jul 1, 2009
Words:2627
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