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Evento de Intoxicacion en Perros de Zona Urbana mediante Cebos Contaminados con Aldicarb.

POISONING EVENT IN DOGS IN AN URBAN AREA USING BAITS IMPREGNATED WITH ALDICARB

INTRODUCCION

Las intoxicaciones intencionales en animales de compania son una creciente problematica, no solo en Argentina sino en muchos otros paises, donde los compuestos organofosforados (OF) y carbamatos (CB) son los mas comunmente utilizados (Berny et al., 2010; Caloni et al., 2016). En un estudio realizado en Italia, se reporta que los insecticidas y los rodenticidas causaron el 40.8 y 27.6% de los eventos de envenenamiento, respectivamente, afectando mayormente a perros (71.1%) y gatos (15.8%) y un numero limitado de casos en caballos, cabras y ovejas (Caloni et al., 2016).

Reportes sobre intoxicaciones en animales de compania demuestran que los compuestos principalmente utilizados con este fin son los CB en general y aldicarb en particular (Verster et al, 2004; Xavier et al, 2007; Berny et al, 2010; Caloni et al, 2016). A nivel local, Ferre et al. (2015) confirmaron que el insecticida fue el agente causal de dos eventos de intoxicacion en perros en la ciudad de Mendoza, Argentina. En Argentina, no existen registros epidemiologicos de casos de animales intoxicados, como si ocurre con el Centro de Informacion y Asesoramiento Toxicologico (CIAT, Mendoza) para personas.

Debido al mecanismo de accion anticolinesterasico que presentan los CB y OF, la medicion de la actividad colinesterasa resulta util en el diagnostico, tratamiento y pronostico del individuo intoxicado. En el diagnostico, porque la actividad de la butirilco-linesterasa/ colinesterasa plasmatica (BChE) refleja la actividad de la acetilcolinesterasa del Sistema Nervioso Central (SNC), responsable de la presentacion de los signos (Groner et al., 2007); en el tratamiento, ya que si bien tanto OF como CB son agentes anticolinesterasicos, los signos del SNC son menos frecuentes en intoxicaciones con CB (Soler Rodriguez et al., 2006); y en el pronostico, dado que la determinacion de la actividad de BChE en el tiempo permite distinguir entre intoxicaciones causadas por compuestos OF y CB. Esta distincion resulta util en la clinica, ya que es posible la expresion de un sindrome intermedio o neuropatia retardada en intoxicaciones por OF (Hopper et al., 2002; Cabrera et al., 2009). El individuo intoxicado presenta signos clinicos por estimulo muscarinico y nicotinico; sin embargo, la acumulacion del neurotransmisor acetilcolina en las terminaciones sinapticas, principalmente muscarinicas, inicialmente excita y posteriormente inhibe la trasmision en el SNC (Campbell y Chapman, 2000; Verster et al., 2004).

En la practica veterinaria, el agente causal no es usualmente identificado dada la carencia de equipos de cromatografia liquida o gaseosa en los laboratorios veterinarios, lo cual dificulta las denuncias y registros oficiales de envenenamiento. El uso de tecnicas de laboratorio para la medicion de BChE y la cromatografia en capa fina son metodos factibles y de facil acceso para su uso en medicina veterinaria. La implementacion de estos metodos diagnosticos complementarios por parte de los profesionales podria ser la primera accion que aportaria a un futuro registro de intoxicaciones en la region. Esto resulta interesante en salud publica, pues facilita la identificacion de agentes toxicos que se encuentran a disponibilidad publica y que no son usados para los fines para los cuales fueron producidos.

El objetivo de este trabajo fue investigar un evento de 45 perros con signos de intoxicacion compatibles con agentes anticolinesterasicos, que se registro en un lapso de una semana en una zona urbana de la ciudad de Mendoza.

MATERIALES Y METODOS

Ubicacion del Estudio

El evento de la intoxicacion se presento en el distrito El Bermejo (departamento de Guaymallen, Mendoza, Argentina) en diciembre de 2015. La zona ocupa una superficie de 5.25 [km.sup.2] y cuenta con una poblacion de 13 428 habitantes, lo que resulta en una densidad de poblacion de 2.6 hab/[km.sup.2], densidad media comparada con los demas distritos del departamento (Sistema Estadistico Municipal, 2001).

El Bermejo forma parte del area complementaria denominada zona de Preservacion Patrimonial. Se dispone de ordenanzas que regulan su crecimiento, protegiendolo de actividades que actuen en detrimento de su medio ambiente. Asi, la Ordenanza 224/1988 para "Preservar el entorno socio-economico y ecologico de la zona" y la Ordenanza 4893/ 1999 <<Prohibicion de la instalacion y radicacion, de usos o emprendimientos que degraden las caracteristicas generales del sitio y que provoquen un impacto de magnitud sobre el medio ambiente y sobre las actividades y vida propia de determinadas areas>> (Ordenanzas del Honorable Consejo Deliberante, Guaymallen).

Animales y Muestras

* Grupo intoxicado: Formado por 36 caninos adultos con similares signos de intoxicacion compatible con sobreestimulacion nicotinica (sialorrea, lagrimeo, incontinencia urinaria, diarrea, bradicardia, broncoconstriccion con aumento de secreciones bronquiales y miosis) y signos muscarinicos (temblores, rigidez muscular, debilidad y paralisis). Diez de estos animales (seis machos y cuatro hembras), tenian dueno y fueron asistidos clinicamente en dos veterinarias de la zona. A ocho de estos se les tomo una muestra de sangre para medir la actividad BChE, llegandose a recuperar exitosamente del cuadro agudo de intoxicacion. Los 28 caninos restantes fueron hallados muertos en la via publica y no se obtuvo informacion ni reclamos de su tenencia por algun propietario aparente.

* Grupo control: Formado por 13 caninos adultos sanos (nueve hembras y cuatro machos) que no habitaban en la zona de El Bermejo. Se les hizo una evaluacion clinica para asegurar que presentaban un estado sanitario optimo. Se les tomo muestras de sangre para la obtencion de valores de referencia de la actividad BChE en caninos adultos de la region.

El tratamiento proporcionado a los animales consistio en fluidoterapia endovenosa con solucion de cloruro de sodio al 0.9% y atropina 0.5 mg/kg. El 50% de la dosis total se administro via endovenosa y la mitad restante via subcutanea. Cuando fue necesario controlar las mioclonias y lograr la relajacion del animal, se administro 0.5 mg/kg de diazepan endovenoso a una concentracion de 10 mg/ml.

Las muestras de sangre (1 ml) se colectaron por puncion de la vena cefalica en tubos con 40 [micron]l de heparina sodica al 5% (500 Ul/ml). La sangre fue centrifugada el dia de la colecta a 500 g durante 10 min y el plasma resultante fue almacenado a -4[grados]C.

El cebo empleado para el envenenamiento de los canes fue extraido de la boca de uno de los animales del grupo de intoxicados y se mantuvo refrigerado a -8[grados]C en envase plastico con sello hermetico hasta el momento del analisis. El cebo tenia apariencia de tejido animal, de tamano 4x4 cm.

Determinacion de Butirilcolinesterasa

Se determinaron los niveles de BChE plasmatica utilizando el kit Colinesterasa (GT Lab[R]), metodo cinetico por espectrofotometria a 405 nm, pH 7.7 y 25[grados]C (Ellman et al., 1961). La reaccion utiliza butirilcolina como sustrato y se realizo a temperatura ambiente. En el kit, disenado para medicina humana, se efectuo la reduccion proporcional de los volumenes, para hacer dos determinaciones por cada 3 ml de sustrato butiriltiocolina provisto en cada vial. Los resultados fueron expresados en UI/l.

Cromatografia en Capa Fina

Se efectuo marcha toxicologica para toxicos organicos fijos, con recuperacion del extracto acido y utilizacion de columnas EXtrelut [R]NT3 de 15 ml segun el manual de procedimientos analiticos toxicologicos para laboratorios de baja complejidad, con leves modificaciones (Flanagan et al., 1995). Para la Cromatografia en Capa Fina (CCF) se utilizaron las siguientes placas como adsorbentes: TLC Silicagel 60 F254 20x20 cm (Merck[R]) y cuba vertical para cromatografia de 15x15x6 cm impregnada con solvente de corrida cuadruple : n-hexano/ciclohexano/cloroformo/ acetona (40/40/10/10), a 25[grados]C. Se sembraron testigos estandares de plaguicidas OF (clorpirifos, metamidofos, metidation), organoclorados y CB (aldicarb, carbaril, carbofuran y carbosulfan), y el extracto de la muestra en estudio. Se compararon las distancias recorridas por la muestra testigo y los estandares identificando la sustancia en la muestra en estudio cuando la distancia coincidia con la del testigo estandar conocido.

Analisis Estadistico

Para el estudio de los datos de actividad BChE se utilizo el programa estadistico Prism 6.0. Se aplico el test de Kolmogorov-Smirnov para comprobar el ajuste a una distribucion normal y el t-Student para analizar la diferencia de actividad enzimatica entre los grupos control e intoxicado (p<0.05).

RESULTADOS

Los valores de actividad BChE de los animales del grupo control e intoxicado fueron estadisticamente diferentes (p<0.01). Los ocho canes que recibieron atencion medica presentaron un 30% de inhibicion de la BChE y respondieron de forma favorable al tratamiento recuperandose del cuadro de intoxicacion. Los dos animales del grupo intoxicado que tenian valores notoriamente disminuidos de actividad BChE (92% de inhibicion) murieron.

En la placa de silicagel donde se sembro el extracto organico obtenido de la muestra de cebo contaminado se observo, mediante el vaporizado con el revelador de CB (4-nitro benceno diazonio-tetra-fluoroborato endietilen glicol/alcohol absoluto [1/9]), la presencia de una mancha que indica la presencia de aldicarb en la muestra estudiada. En la Figura 1 se observa que la distancia de recorrido de la muestra coincide con la del testigo aldicarb.

DISCUSION

Se identifico al insecticida carbamato aldicarb como el plaguicida presente en el cebo analizado. Este CB se utiliza en produccion fruticola como acaricida, insecticida y nematicida, de accion por contacto y sistemica. Es extremadamente toxico para peces, aves y mamiferos (Nelson et al., 2001). Los principales metabolitos biologicamente activos del aldicarb son el aldicarb sulfoxido, con 76 veces mas actividad anticolinesterasica, y el aldicarb sulfona, el cual es 25 veces menos toxico, pero con mayor persistencia en el organismo (Cazenave et al., 2005).

La Organizacion Mundial de la Salud lo clasifica toxicologicamente como extremadamente peligroso por lo que integra la lista de Pesticidas Altamente Peligrosos (HHP por sus siglas en ingles), para los que se recomienda un manejo particular (WHO, 2016). En la Union Europea esta prohibido el uso y la comercializacion de aldicarb debido a su alta toxicidad, baja seguridad al manejo y efectos ecotoxicologicos (Ruiz-Suarez et al., 2015).

En Argentina, aldicarb tiene limitaciones edaficas y de uso (Decreto Nacional No. 2, 1990), que limita su aplicacion a personal profesional o capacitado; sin embargo, Hynes (2014), mediante encuestas a trabajadores de fincas fruticolas en la ciudad de Mendoza encontro que solo el 26% de los usuarios cuenta con asesoramiento profesional, que el 29% los adquiere directamente, y que muchos de ellos solo siguen las recomendaciones del Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria (INTA), del Instituto de Sanidad y Calidad Agropecuaria de Mendoza (ISCAMEN) o del Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA).

Se han presentado casos accidentales de intoxicaciones en seres humanos al utilizar aldicarb como rodenticida (Lima y Reis, 1995). La DL 50 de aldicarb en caninos es de 6.5 mg/kg, ocurriendo la muerte por falla respiratoria (Arnot et al., 2011). La DL en humanos es de 0.8 mg/kg (Waseem et al., 2010), de alli la importancia del control del uso indebido de estos toxicos, al presentar el hombre mayor sensibilidad que otras especies. Aldicarb, ademas de ser usado como plaguicida, se sigue utilizando para intoxicaciones intencionales (Martinez-Haro et al., 2008; Anastasio y Sharp, 2011).

En esta investigacion se obtuvieron valores propios de referencia para la actividad BChE (4390 [+ o -] 1548 UI/L en caninos adultos machos y hembras) que, considerando los desvios estandares, son comparables a las reportadas por otros autores, siguiendo la misma metodologia: 3276 [+ o -] 845 y 3013 [+ o -] 1081 para machos y hembras, respectivamente (Maia et al., 2012) y 5071 [+ o -] 891 UI/L (Evans, 1990).

La actividad BChE tiene un amplio rango de variabilidad en animales clinicamente sanos, pudiendo alcanzar niveles del 30%. Debido a esto es la conveniencia de obtener valores de referencia propios en cada laboratorio (Maia et al., 2012). Los valores de referencia propios pueden aplicarse en el diagnostico diferencial entre OF y CB. Asi, una segunda determinacion a las 24 h puede inferir la presencia de un OF si se mantiene el nivel de inhibicion o de un CB si la actividad enzimatica ha aumentado, ya que los primeros producen una inhibicion irreversible de la BChe y los segundos una inhibicion reversible (Colovic et al., 2013).

Tanto la enzima acetilcolinesterasa (AChE) cerebral como la BChE sanguinea son inhibidas por los CB y OF. En el presente estudio la inhibicion de BChE fue del 42% en el grupo intoxicado con respecto al grupo control. Este valor fue semejante al 50% reportado por Talcott y Peterson (2013) donde los signos clinicos son visibles; sin embargo, en este estudio, todos los animales presentaron signos compatibles con intoxicacion, de mayor o menor gravedad. La BChE plasmatica es considerada un indicador mas sensible que la AChE en la intoxicacion por anticolinesterasicos asociada a los eritrocitos en caninos, al igual que en humanos, ya que suele ser inhibida en mayor grado, incluso antes de que los signos clinicos de la intoxicacion aparezcan (Maia et al., 2012).

Una de las intenciones de este trabajo fue de promover en la practica veterinaria la medicion de la colinesterasa en animales intoxicados como herramienta orientativa de la exposicion a OF y CB, insecticidas de mayor frecuencia en este tipo de eventos (Ferre et al., 2015). Asimismo, presentar la posibilidad de aplicar la metodologia de cromatografia en capa fina (CCF) (Afful et al., 2008), de baja complejidad y costo que permitio identificar el agente causal. El mayor inconveniente en la aplicacion de este metodo es el uso de solventes y de estandares de plaguicidas peligrosos para la salud de los laboratoristas, por lo que se requiere de una campana de extraccion de gases y vapores, asi como de personal especializado. Tiene, ademas, la desventaja de ser un metodo cualitativo.

Los plaguicidas domesticos, rodenticidas, piretroides y OF son los principales causantes de intoxicacion por plaguicidas en humanos en Mendoza (Ferre et al., 2015). Los grupos de plaguicidas agricolas reportados por el CIAT-Mendoza como principal causa de intoxicacion en humanos son los CB (24.7%) y los OF (24.1%) (S. Saracco, Mendoza, comunicacion personal). Esta informacion de la poblacion humana respalda el hallazgo de un CB en el presente evento y otro CB, carbofuran, el ano anterior en Mendoza (Ferre et al., 2015). Estos eventos sustentan el hecho de que el uso de determinados plaguicidas en intoxicaciones intencionales en animales es un reflejo del tipo de de plaguicida utilizado en agricultura en la region (Martinez-Haro et al., 2008).

En el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiologica (SINAVE) de Argentina se denuncian las intoxicaciones de personas por plaguicidas, por monoxido de carbono, por medicamentos y por otros toxicos (Ministerio de Salud, 2011). Por Resolucion Nacional No. 394 del Ministerio de Salud y Accion Social de 1994, se establecio que la intoxicacion por plaguicidas propiamente dicha es un evento de notificacion obligatoria en todo el territorio nacional, incorporandose al SINAVE cuando se observara la ocurrencia de brotes. En el caso de la practica veterinaria, se deberian registrar las denuncias e incluir los datos de los animales afectados, signos clinicos, etc., tal y como se lleva a cabo en otros paises (Caloni et al., 2016). Esto ayudaria a mejorar el plan de accion en virtud del tratamiento del paciente y efectuar un pronostico preciso para los propietarios del mismo. El reporte de estos eventos en la casuistica veterinaria tiene una implicancia directa en la tarea de control y fiscalizacion de uso de plaguicidas que pueden tener comercializacion prohibida, pero que no han sido aun retirados del mercado.

http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v28i3.12849

Agradecimientos

Al CONICET y a la Universidad Juan Agustin Maza y DICyT (Mendoza) por el financiamiento del trabajo; a la Dra. Raquel Fernandez por la supervision de la pericia toxicologica; al Dr. Sergio Saracco, Director del CIAT- Mendoza; al MV Pablo Vallejos y MV Georgina Hidalgo, propietarios de las clinicas veterinarias de El Bermejo, Guaymallen (Mendoza), que colaboraron activamente en esta investigacion; y a los propietarios de los animales por la informacion proporcionada que permitio estimar la magnitud del evento.

LITERATURA CITADA

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Eliana L.R. Saldena (1), Valentina Hynes (1), Daniela M. Ferre (1,2), Martin Quero (1,2), Veronica Neuilly (1-3), Nora B.M. Gorlau (1,2,3)

(1) Facultad de Ciencias Veterinarias y Ambientales, Universidad Juan Agustin Maza, Mendoza, Argentina

(2) Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas--CONICET, Mendoza, Argentina

(3) Cuerpo Medico Forense y Criminalistico, Mendoza, Argentina

(4) E-mail: noragorla@gmail.com

Recibido: 7 de diciembre de 2016

Aceptado para publicacion: 19 de mayo de 2017

Caption: Figura 1. Placa de silicagel con revelador para carbamatos. C(-) control negativo, T: testigo de aldicarb, M: muestra, extracto de cebo contaminado
Cuadro 1. Valores de actividad butirilcolinesterasa plasmatica (UI/l)
(promedio [+ o -] desviacion estandar) en caninos con signos de
intoxicacion compatibles con agentes anticolinesterasicos (El
Bermejo, Mendoza, Argentina)

Grupo                  Butirilcolinesterasa (UI/l)

Control (n = 13)      4 390.7 [+ o -] 1 548.4 (a)
Intoxicado            2 607.9 [+ o -] 1380.2 (b)
Sobrevivientes (n=8)  3 175.7 [+ o -] 776.7
Fallecidos (n=2)        336.5 [+ o -] 154.8

(a, b) Superindices diferentes entre grupos indican diferencia
estadistica (p=0.0092)
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Author:Saldena, Eliana L.R.; Hynes, Valentina; Ferre, Daniela M.; Quero, Martin; Neuilly, Veronica; Gorlau,
Publication:Revista de Investigaciones Veterinarias del Peru (RIVEP)
Date:Jul 1, 2017
Words:3977
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