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Evaluation of in vitro antioxidant activity of mate and green teas before and after biotransformation by lipases/Avaliacao da atividade antioxidante in vitro dos chas mate e verde antes e apos a biotransformacao por lipases.

INTRODUCAO

Os flavonoides sao compostos polifenolicos encontrados na maioria das bebidas derivadas de plantas. Atualmente, estas moleculas tem sido objeto de inumeras comprovacoes de suas propriedades funcionais, em especial relativa as suas propriedades antioxidantes. (9)

Apesar de abundantes nos alimentos, os polifenois nem sempre sao bem absorvidos apos a ingestao oral, pois se encontram na forma de glicosideos, esteres e polimeros. Ou seja, o efeito funcional esperado nao depende somente da quantidade ingerida, mas tambem de caracteristicas moleculares que podem influenciar na biodisponibilidade do composto. (10)

Segundo relatos, a acilacao dos flavonoides e capaz de favorecer a estabilidade dessas moleculas ao provocar o aumento da hidrofobicidade, o que favorece tambem a biodisponibilidade. (1,6) Alem disso, a introducao do grupamento acila em flavonoides glicosilados, segundo a literatura, e capaz de aumentar consideravelmente a atividade antioxidante dessas moleculas. (13,19)

A acilacao dos flavonoides vem sendo estudada com o uso da lipase de Candida antarctica. Hoje, sabe-se que a acao desta enzima e influenciada pelo solvente, pela quantidade de agua presente na reacao, pelo tipo de grupamento acil doador e pela estrutura do flavonoide. (1) Em geral, a ligacao do grupamento acila ocorre na regiao que possui a glicose. (6)

Por outro lado, no caso dos flavonoides agliconas, a regiao da esterificacao depende da natureza da enzima e do tipo de flavonoide. Contudo, a lipase de Pseudomonas cepacia parece ser a melhor enzima para a sintese de esteres a partir de flavonoides agliconas. (6)

No Brasil, o cha mate e a infusao mais consumida seguida do cha preto e de outros tipos, como por exemplo, os de frutas e os provenientes de outras ervas. Muitos dos chas sao consumidos para fins medicinais, segundo a sabedoria popular. O processamento do cha mate (Ilex paraguariensis) envolve basicamente as etapas de trituracao, secagem e tostagem das folhas, sendo que a erva mate se difere do cha mate apenas pela ausencia da etapa de tostagem. 12 Dentre os componentes da especie destacam-se os acidos fenolicos (cafeico, clorogenico, 3,4--dicafeoilquinico, 3,5--dicafeoilquinico e acido 4,5--dicafeoilquinico), os flavonoides pertencentes a classe dos flavonois (rutina, quercetina e kaempferol, principalmente glicosilados), as saponinas triterpenicas derivadas dos acidos ursolico e oleanolico e as metilxantinas. (2)

Por outro lado, o cha verde que e produzido a partir das folhas de Camellia sinensis, e largamente consumido em paises orientais e, devido a imigracao japonesa, tambem passou a ser utilizado no sudeste do Brasil. Na sua composicao, alem das catequinas e teaflavinas ja largamente descritas, encontram-se compostos como os flavonois (miricetina, quercetina e kaempferol, principalmente glicosilados) e acidos fenolicos. (4)

Dessa forma, tanto o cha mate quanto o cha verde sao ricos em polifenois glicosilados, (3) o que pode comprometer a biodisponibilidade e consequentemente a sua atividade antioxidante na forma in natura, porem, por outro lado, pode favorecer o processo de acilacao da molecula conforme ja mencionado, elevando a atividade antioxidante.

O presente estudo comparou a atividade antioxidante dos chas mate e verde in natura com os biotransformados por lipases de pancreas de porco e de Aspergillus niger. Alem disso, a atividade antioxidante dos chas in natura foi comparada a dos mesmos chas, porem liofilizados, a fim de verificar se o processo de liofilizacao seria capaz de comprometer a atividade antioxidante das amostras.

MATERIAIS E METODOS

Folhas de Ilex paraguariensis e de Camellia sinensis, do fornecedor Leao Jr. S.A., foram adquiridas no comercio local da cidade de Braganca Paulista.

As enzimas lipase de pancreas de porco e lipase de Aspergillus niger foram obtidas liofilizadas, da empresa Sigma-Aldrich Chemical Co.

Os reagentes: AAPH (2,2-azobis amidinopropano); [beta]-caroteno; acido cafeico; acido clorogenico; DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazila); fluoresceina; Folin-Ciocalteu[R] (molibdato, tungstato e acido fosforico); isoquercetina; quercetina; TPTZ (2,3,5-cloreto trifeniltetrazolium); Trolox[R] (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-acido carboxilico), tambem foram adquiridos da empresa Sigma-Aldrich Chemical Co.

Preparo dos chas

Os chas foram preparados por infusao de 5 gramas de folhas secas em 100 mL de agua fervente. A infusao foi deixada em repouso por 10 minutos, seguida de filtracao.

Uma porcao desse cha (in natura) seguiu para a etapa de biotransformacao por lipases, conforme metodo abaixo; outra porcao foi liofilizada a -40[degrees]C e sob pressao de 133x[10.sup.-3] bar (Heto Drywinner) e armazenada em freezer (-14[degrees]C a -18[degrees]C) e uma terceira porcao foi estudada na forma in natura, sem qualquer tratamento adicional.

Quantificacao dos polifenois e dos flavonoides totais das amostras in natura

Inicialmente amostras de chas mate e verde in natura foram analisadas, para que maiores conhecimentos a respeito da composicao dessas matrizes alimentares fossem adquiridos.

Para a realizacao do procedimento de quantificacao dos polifenois totais, foram dissolvidos 100,0 g de carbonato de sodio e 6,0 g de tartarato de sodio em quantidade suficiente para 500,0 mL de agua fervente. Apos o resfriamento da solucao, foram adicionados 750,0 [micro]L desta em cada tubo contendo 3,0 mL da amostra a ser analisada (in natura). A eles foram adicionados 75,0 [micro]L do reagente Folin-Ciocalteu[R] e em seguida foram incubados a 20[degrees]C durante 30 minutos. As absorbancias foram lidas em espectrofotometro, UV/Vis Jenway 6105, em comprimento de onda de 700 nm. Para a confeccao do branco, o procedimento foi o mesmo, porem, ao inves da solucao contendo as amostras, foi acrescentada apenas a solucao de carbonato e tartarato de sodio. A curva padrao utilizada foi a de acido galico em concentracoes que variaram de 0,0 - 500,0 mg/L. (22)

Para a realizacao do teste de quantificacao dos flavonoides totais, foram adicionados em cada tubo 1,0 mL de agua destilada. A eles foram acrescidos 250,0 [micro]L da amostra (in natura), 750,0 [micro]L de NaN[O.sub.2] a 5%, 75,0 [micro]L de Al[Cl.sub.3] a 10% e 0,5 mL de NaOH 1,0 M. O material foi deixado em repouso e a absorbancia foi lida em espectrofotometro, UV/Vis Jenway 6105, apos 6 minutos em 510 nm. A curva padrao utilizada foi a de quercetina em concentracoes que variaram de 5,0 - 75,0 [micro]g/mL. (25)

Caracterizacao quimica das amostras in natura por espectrometria de massas

Como forma de comprovar que as matrizes alimentares estudadas possuiam flavonoides glicosilados (substratos para a atuacao enzimatica) foi realizada uma analise qualitativa pelo metodo ESI-MS (Ionizacao por spray em espectrometro de massas: Micromass Q-TOF, modo negativo).

A limpeza do equipamento foi realizada utilizando uma solucao de metanol/agua adicionada de hidroxido de amonio a 0,1%, a fim de retirar os possiveis interferentes. Posteriormente, o equipamento foi calibrado com solucao de acido formico a 0,1%.

Foram pesados 50 mg de cada amostra (in natura) sendo homogeneizadas a 1,0 mL da mistura de alcool metilico e agua 1:1. O material foi filtrado e diluido na proporcao de 10 [micro]L da solucao filtrada em 990 [micro]L da solucao preparada de metanol/agua 1:1 adicionada de hidroxido de amonio a 0,1%. As amostras foram analisadas por injecoes de fluxo de 10 [micro]L/minuto, considerando uma faixa de massas para analise de 100 a 1000 u.

Biotransformacao das matrizes in natura

A esterificacao dos flavonoides dos chas foi realizada misturando-se 25,0 mL de cha (in natura) com 12,5 mL de solvente doador de grupamento acil (acido linoleico), 12,5 mL do solvente acetona, e lipase na concentracao de 10,0 g/L. O pH da solucao foi ajustado para permanecer entre 8-9, pH otimo para a atuacao enzimatica. Em seguida, a mistura foi incubada por 72 horas a 60[degrees]C, sob agitacao de 130 rpm (Incubadora Tecnal TE-421), e, posteriormente, armazenada em geladeira (2-8[degrees]C).

Extracao de polifenois

A etapa de extracao de polifenois foi realizada para os tres tipos de amostras (in natura, biotransformada e liofilizada) para que os testes de capacidade antioxidante pudessem ser realizados, posteriormente.

Foram adicionados 40,0 mL de alcool metilico a 50% a 10,0 mL de amostra. Este material foi homogeneizado e deixado em repouso por 60 minutos a temperatura ambiente. Apos o repouso, o material foi centrifugado a 13.000 rpm, 22[degrees]C por 15 minutos e o sobrenadante foi transferido para um balao volumetrico de 100 mL. Ao residuo foram adicionados 40,0 mL de acetona a 70% e submetido ao mesmo processo de extracao acima descrito. Em seguida, os sobrenadantes foram combinados em balao volumetrico de 100 mL e o volume completado com agua destilada. Os extratos provenientes das amostras in natura e biotransformada foram usados nos seguintes testes de capacidade antioxidante: TBARS, FRAP, DPPH, cooxidacao [beta]-caroteno/acido linoleico e ORAC; e os extratos provenientes da amostra liofilizada foram usados nos testes FRAP, DPPH, co-oxidacao [beta]-caroteno/acido linoleico, para fim de comparacao com a amostra in natura.

Determinacao das substancias reativas ao acido tiobarbiturico (TBARS)

Para cada teste, a 1,0 g de gema de ovo foi adicionado 1,0 mL do extrato da amostra a ser testada e 0,5 mL de H2O2, a fim de induzir dano oxidativo. O material foi homogeneizado com 5,0 mL de tampao fosfato de sodio 0,1 M pH 7,4 em vortex e ultra-som. Em seguida, 250 [micro]L do homogenato de cada amostra foram adicionados a outros tubos previamente identificados. A esses tubos foram acrescentados 25 [micro]L de BHT 4% metanolico, sendo homogeneizados novamente em vortex. Posteriormente foram adicionados 1,0 mL de acido acetico a 12%, 1,0 mL de acido tiobarbiturico a 0,73% e 750 [micro]L de tampao Tris-HCl 0,1 mol/L pH 7,4, sendo esses tubos depositados em banhomaria durante 60 minutos a 100[degrees]C. O material retirado do banho-maria foi colocado em banho de gelo, e em seguida foram adicionados 1,5 mL de N-butanol; os tubos foram entao novamente homogeneizados em vortex e centrifugados por 10 minutos a 5.000 rpm. A leitura da fase organica foi realizada em espectrofotometro, UV/Vis Jenway 6105, em 532 nm. A amostra controle (gema de ovo e peroxido de hidrogenio) seguiu o mesmo procedimento.

A curva padrao utilizada foi a de tetraetoxipropano (TEP) nas concentracoes de 0 a 0,007 mg de TE (15,21) e o experimento foi realizado em triplicata.

Poder antioxidante de reducao do ferro--"Ferric Reducing Ability of Plasma" (FRAP)

A partir do extrato obtido, foram preparadas, em tubos de ensaio, tres diluicoes diferentes (5:5, 1:9 e 9:1 mL de extrato/mL de agua destilada). Em ambiente escuro, foram adicionados 90 [micro]L de cada diluicao a outro tubo de ensaio contendo 270 [micro]L de agua destilada. A essa mistura, foram acrescentados 2,7 mL do reagente FRAP [tampao acetato 0,3 M pH 3,6; TPTZ (2,3,5-cloreto trifeniltetrazolium) 10 mM e solucao aquosa de cloreto ferrico 20 mM]. Em seguida, os tubos foram homogeneizados e mantidos em banhomaria a 37[degrees]C durante 30 minutos e a leitura foi realizada em espectrofotometro, UV/Vis Jenway 6105, em 595 nm. O reagente FRAP foi utilizado como branco para a calibracao do equipamento.

Os valores foram obtidos comparando as leituras encontradas com a curva padrao de sulfato ferroso (0-2000 [micro]M). (18) O valor final foi expresso em uM sulfato ferroso/g de extrato e o experimento foi realizado em triplicata.

Capacidade de sequestro do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH)

As determinacoes foram realizadas adicionando-se em cada eppendorf 250 [micro]L da solucao metanolica de DPPH (20 mg/mL) e 40 [micro]L de metanol (controle), ou o mesmo volume do extrato a ser analisado. Todas as leituras foram realizadas em espectrofotometro de microplaca, TP-Reader, em tres diluicoes diferentes (5:5, 1:9 e 9:1 mL de extrato/ mL de agua destilada), no comprimento de onda de 517 nm, apos 25 minutos de incubacao a 25[degrees]C.

A curva padrao realizada continha DPPH nas concentracoes de 10 a 60 [micro]M e o alcool metilico foi utilizado como branco para calibrar o espectrofotometro.

O decaimento da absorbancia das amostras (Aam) correlacionado ao decaimento da absorbancia do controle (Ac), resultou na porcentagem de sequestro de radicais livres (% SRL), que foi expressa atraves da equacao: (8)

% SRL = (([A.sub.c]--[A.sub.am])/ [A.sub.c]) x 100

O experimento foi realizado em triplicata.

Co-oxidacao [beta]-caroteno/acido linoleico

Para o preparo da mistura reativa, foram adicionados a um erlenmeyer, 20 [micro]L de acido linoleico, 200 mg de tween 40, 25 [micro]L de solucao de [beta]-caroteno a 2,0 mg/mL em cloroformio e 500 [micro]L de cloroformio. Posteriormente, a mistura foi submetida a completa evaporacao do cloroformio sob nitrogenio e a esta mistura isenta de cloroformio, foram adicionados 25 mL de agua previamente saturada com oxigenio. Em cada cavidade foram adicionados 250 uL da mistura reativa e 10 [micro]L do extrato ou de metanol, no caso da amostra controle. A placa foi incubada a 45[degrees]C, por aproximadamente 2 minutos, para acelerar as reacoes de oxidacao e iniciar o descoramento do [beta]-caroteno. As lei turas foram realizadas para a absorbancia inicial e para a absorbancia final (apos duas horas) em espectrofotometro de microplaca, TP-Reader, com comprimento de onda de 470 nm. A queda da absorbancia das amostras (Aam) foi correlacionada com a queda da absorbancia do controle (Ac), obtendo-se a porcentagem da inibicao da oxidacao (% I) atraves da equacao: (7)

% I = (([A.sub.c]-[A.sub.am])/ [A.sub.c]) x 100

O experimento foi realizado em triplicata.

Capacidade de absorcao de radicais oxigenio--"Oxygen RadicalAbsorbance Capacity" (ORAC)

A capacidade antioxidante dos extratos foi avaliada utilizando-se o ensaio ORAC com fluoresceina como fluorescente e AAPH (2,2-azobis amidinopropano) como fonte de radical livre. Os experimentos foram realizados em placas de microtitulacao de acordo com metodologia descrita por Prior et al. (17) e Ou et al. (16) com modificacoes. 20 As solucoes estoques dos extratos (50 mg/mL) foram preparadas em tampao fosfato 75 mM (pH 7,2)/DMSO (99:1) e diluidas 100, 500, 1.000, 5.000 e 10.000 vezes com o tampao fosfato. O Trolox[R] foi analisado nas concentracoes de 3,125; 6,250; 12,500; 25,000 e 50,000 [micro]M, empregando-se o mesmo sistema diluente. A leitura foi realizada utilizando-se filtro fluorescente (excitacao X = 485 nm e emissao [lambda] = 528 nm) em leitor de microplaca, Biotek Synerg-2, monitorando a cinetica de reacao a cada 2 minutos por um periodo de 70 minutos (temperatura = 37[degrees]C). Os resultados foram expressos como umol de Trolox equivalente (TE) por grama de extrato liofilizado em base seca (umol de TE/g). Como controle positivo utilizou-se acido cafeico, acido clorogenico, quercetina e isoquercetina e como controle negativo a solucao diluente. O experimento foi realizado em triplicata.

Analise estatistica

O software utilizado na analise foi o GraphPad Instat Program version 3.0 (GraphPad Software, San Diego, CA). Os testes foram realizados em triplicata e expressos em media [+ or -] desvio padrao. As medias entre o controle e as amostras foram comparadas pelo metodo estatistico T-student. Para a comparacao entre amostras foi realizado teste F seguido do teste T nao pareado e valores de p < 0,05 foram considerados significativos.

[FIGURE 1 OMITTED]

RESULTADOS E DISCUSSAO

Quantificacao dos polifenois e dos flavonoides totais das amostras in natura

O cha verde demonstrou apresentar maior quantidade de polifenois totais e flavonoides totais por grama de folhas frescas do que o cha mate. Enquanto o cha verde apresentou 104,09 [+ or -] 2,30 e 80,30 [+ or -] 1,10 mg/g de polifenois e flavonoides respectivamente, o cha mate apresentou 87,01 [+ or -] 1,20 e 75,50 [+ or -] 0,50 mg/g de folhas frescas, respectivamente. Sendo que, os polifenois foram expressos em mg de equivalentes de acido galico/g de cha in natura e os flavonoides em mg de equivalentes de quercetina/g de cha in natura.

Com relacao a quantificacao de polifenois e flavonoides totais, segundo estudos de Tsai et al., (25) os valores para o cha mate foram de 100,0 mg/g de extrato e 170,0 mg/g de extrato, respectivamente. Ao quantificarem os polifenois do cha verde os mesmos autores encontraram 150,0 mg/g de extrato de polifenois e 75,0 mg/g de extrato de flavonoides.

Os dados do presente estudo foram consistentes com os reportados pela literatura com relacao a maior quantidade de polifenois e de flavonoides totais no cha verde. Contudo, e possivel uma variacao na composicao das amostras quando e realizada uma comparacao entre este estudo e os dados da literatura ou mesmo em uma comparacao entre literaturas, pois estes constituintes variam em funcao do modo de cultivo, tipo de solo, clima, local de cultivo, dentre outros fatores.

Caracterizacao quimica das amostras in natura por espectrometria de massas

A fim de verificar se realmente as matrizes alimentares apresentavam flavonoides glicosilados, o que favoreceria a biotransformacao pelas lipases estudadas, foi realizado 0 fingerprint das amostras de chas in natura. O metodo utilizado foi o ESI-MS (Ionizacao por spray, modo negativo).

Na Figura 1 encontram-se uma serie de compostos que foram identificados no cha mate e que sao responsaveis por sua atividade antioxidante. No espectro da Figura 1 podem ser observadas especies ionizadas de compostos como a quercetina (m/z 301), cafeoilglicose (m/z 341), acido feruloilquinico (m/z 367) e rutina (m/z 609), flavonoide glicosilado.

No espectro do cha verde (Figura 2), podem ser identificados como acidos fenolicos, derivados dicafeoilquinicos (m/z 515) e flavonoides glicosilados (m/z 609, m/z 593, m/z 447). A faixa de leitura adotada foi de 100 a 1000 m/z.

Peroxidacao lipidica: indice de TBARS

A fim de garantir a validade do teste no que diz respeito a limitacao ou reducao do dano oxidativo frente a utilizacao de matrizes alimentares com conhecido poder antioxidante, inicialmente foi avaliado o nivel de peroxidacao lipidica da gema de ovo e da gema de ovo adicionada de peroxido de hidrogenio ([H.sub.2][O.sub.2]). Conforme esperado, o dano na amostra adicionada de [H.sub.2][O.sub.2] foi superior, apresentando maior concentracao de malondialdeido (mg/g de amostra). Os niveis de malondialdeido (mg/g) nas amostras de gema de ovo com H2O2 pre tratadas com cha mate biotransformado, com enzima de pancreas de porco ou lipase de Aspergillus niger, foram de 8,0 [+ or -] 0,1 (x[10.sup.-3]) e de 5,8 [+ or -] 0,1 (x[10.sup.-3) nas amostras de cha verde biotransformado, com enzima de pancreas de porco ou lipase de Aspergillus niger, sendo significativamente mais baixas que a concentracao de malondialdeido nas amostras sem biotransformacao, in natura, 10,0 [+ or -] 1,6 (x[10.sup.-3).

[FIGURE 2 OMITTED]

[FIGURE 3 OMITTED]

Influencia da biotransformacao na capacidade antioxidante das amostras

O cha mate biotransformado com o emprego da enzima de pancreas de porco mostrou eficacia no poder redutor (FRAP). O cha verde, tratado pelas duas enzimas, mostrou maior poder redutor, (Figura 3), quando comparado as amostras desse mesmo cha antes da biotransformacao (in natura). O processo de liofilizacao das amostras nao interferiu na atividade antioxidante dos chas, segundo esse teste, pois nao houve diferenca significativa do poder redutor dos chas in natura e dos liofilizados, ambos sem biotransformacao.

A capacidade de sequestro do radical DPPH (Figura 4), do cha mate, tratado com a enzima oriunda de pancreas de porco, apresentou aumento significativo quando comparada com a da amostra controle (in natura). O tratamento com a lipase de Aspergillus niger nao melhorou esta acao. Por outro lado, nao houve alteracao significativa na atividade antioxidante do cha verde in natura com relacao a amostra biotransformada. Com relacao ao processo de liofilizacao, novamente este mostrou nao interferir na atividade antioxidante de ambos os chas, quando estabelecida comparacao entre as amostras in natura e as liofilizadas.

Na inibicao da oxidacao em sistema de co-oxidacao do [beta]-caroteno/acido linoleico (Figura 5), independente da enzima utilizada, tanto o cha mate com o verde mostraram maior eficacia quando comparadas as amostras controle (in natura). Novamente o processo de liofilizacao nao alterou a atividade antioxidante das amostras (Figura 5).

Conforme os resultados apresentados pelo teste ORAC, Tabela 1, os chas mate e verde biotransformados apresentaram valores de atividade antioxidante superiores ao dos chas in natura.

Com relacao aos ensaios antioxidantes, os resultados do presente trabalho corroboraram com os apresentados por estudos anteriores que utilizaram outras enzimas para a mesma finalidade. (13,19) Este fato evidencia que as enzimas e as condicoes enzimaticas adotadas nesse trabalho foram capazes de biotransformar as amostras, o que levou ao incremento na atividade.

Ate o momento, apenas as enzimas lipases de Candida antarctica e de Pseudomonas cepacia haviam sido estudadas com o intuito de acilar moleculas de flavonoides, conforme os estudos de Ardhaoui et al. (1) e de Chebil et al. (6)

[FIGURE 4 OMITTED]

[FIGURE 5 OMITTED]

Os resultados apresentados neste estudo corroboram com os dados de Mellou et al., (13) onde foi relatado que a introducao do grupamento acila em flavonoides glicosilados era capaz de aumentar consideravelmente a atividade antioxidante, o que pode ser confirmado pelos resultados positivos na avaliacao do potencial antioxidante das amostras tratadas enzimaticamente.

Os diferentes ensaios adotados tiveram como finalidade fornecer dados que permitissem a comparacao do desempenho de uma mesma amostra perante principios distintos de analise, visto que, conforme descrito na literatura, cada ensaio possui a sua limitacao. Como explicitado por Castro-Gamboa & Pauletti (5) o DPPH permite a obtencao de resultados para compostos puros, enquanto que a avaliacao de matrizes complexas e muitas vezes dificultada, tornando os resultados pouco confiaveis. No metodo da co-oxidacao do [beta]-caroteno/acido linoleico, outras substancias oxidantes e/ou redutoras presentes na matriz alimentar, alem da substancia objeto de estudo, podem oferecer interferencias nos resultados. (21) E embora artigos cientificos descrevam o ORAC como um dos melhores metodos para a avaliacao da atividade antioxidante, (14) ha controversias. Thaipong et al., (23) por exemplo, descreveu que em seus experimentos o metodo FRAP foi mais reprodutivel quando comparado ao DPPH e ao ORAC.

Segundo Tomei & Salvador, (24) cada tipo de metodologia apresenta suas vantagens e desvantagens. Os metodos diretos (ORAC e o da co-oxidacao de [beta]-caroteno/acido linoleico, por exemplo) mostram-se mais adequados para avaliacao da atividade antioxidante, pois em geral sao mais sensiveis. A desvantagem apresentada por estes metodos e que muitos deles sao tempo-dependentes, o que sugere que suas aplicacoes requerem experiencia em reacoes de cinetica quimica. Por outro lado, metodos indiretos bemdesenvolvidos como, por exemplo, o DPPH e o FRAP, sao adequados, de facil manipulacao e, apesar de nao apresentarem a mesma especificidade, tambem permitem uma adequada avaliacao da atividade antioxidante. No entanto, um impasse na aplicacao dos metodos indiretos e a sua baixa reprodutibilidade, sendo a razao principal o fato dos resultados serem altamente dependentes da concentracao de reagentes e do tempo de incubacao.

Huang et al. (11) e Ou et al. (16) compararam alguns metodos diretos e indiretos sob o ponto de vista do mecanismo de reacoes envolvidas no protocolo experimental e sugeriram que o ORAC e o Folin-Ciocalteu seriam os ensaios adequados para avaliar a atividade antioxidante de alimentos, produtos naturais e fluidos biologicos, apresentando vantagens uma vez que minimizam a possibilidade de ocorrencia de reacoes falso-positivas.

Devido as limitacoes e vantagens de cada metodo apresentadas, pode-se dizer que e sempre prudente que os dados obtidos por metodos indiretos sejam correlacionados com os dados obtidos por metodos diretos a fim de se obter uma maior seguranca analitica dos resultados.

E valido tambem ressaltar que a Agencia Nacional de Vigilancia Sanitaria, conforme RDC no. 26 de maio de 2009, aprova o uso de enzima lipase de pancreas de porco e de Aspergillus niger em alimentos comercializados para uso humano no Brasil, o que proporciona abertura para que a industria alimenticia desenvolva produtos com maior absorcao pelo organismo humano e maior potencial antioxidante, favorecendo o consumidor e explorando ainda mais os beneficios da dieta.

CONCLUSAO

As enzimas lipase de pancreas de porco e lipase de Aspergillus niger podem ser utilizadas quando se deseja aumentar a atividade antioxidante de substancias que possuem flavonoides, no entanto, nao ha vantagem no uso de uma enzima com relacao a outra.

Com relacao ao processo de liofilizacao para conservacao e armazenamento de amostras naturais, ficou claro que este nao provocou alteracoes na atividade antioxidante das amostras estudadas.

O presente estudo mostrou aumento na atividade antioxidante das amostras de chas mate e verde quando biotransformadas por lipases de pancreas de porco e Aspergillus niger, no entanto, tornam-se necessarios estudos complementares para maiores esclarecimentos do processo.

Recebido em: 08/09/2011

Aprovado em: 16/09/2012

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Camila Morais Goncalves da SILVA **

Mario Antonio BRAGA **

Viviane Roberta Vieira SOBRAL **

Carlos Augusto Real MARTINEZ ***

Patricia de Oliveira CARVALHO ***

* Trabalho elaborado com apoio financeiro da FAPESP no.2009/09224-3 e CAPES.

** Instituto de Biologia--Departamento de Bioquimica--UNICAMP--13083970--Campinas--SP--Brasil. E-mail: camilafarmacia1@yahoo.com.br.

*** Laboratorio Multidisciplinar--Universidade Sao Francisco--12900000--Braganca Paulista--SP--Brasil.
Tabela 1--Analise dos chas mate e verde pelo ensaio ORAC antes e apos
a biotransformacao pela enzima lipase de pancreas de porco (1) e
Aspergillus niger (2).

Amostra                            Ensaio ORAC (umol de
                                    TE [g.sup.-1]) (a)

cha mate nao biotransformado      3447,36 [+ or -] 9,00
cha mate + lipase 1              4099,18 [+ or -] 0,25 *
cha mate + lipase 2              4095,35 [+ or -] 0,35 *
cha verde nao biotransformado     3557,56 [+ or -] 5,15
cha verde + lipase 1              4098,87 [+ or -] 0,75+
cha verde + lipase 2              4098,36 [+ or -] 0,25+

Media [+ or -] desvio padrao.

(a) Os resultados foram expressos como micromols de Trolox[R]
(TE) equivalente por grama de substancia. * p< 0,05.
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Author:da Silva, Camila Morais Goncalves; Braga, Mario Antonio; Sobral, Viviane Roberta Vieira; Martinez, C
Publication:Alimentos e Nutricao (Brazilian Journal of Food and Nutrition)
Date:Oct 1, 2012
Words:5001
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