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Evaluacion parasitologica y serologica de infecciones hemotropicas en venados de cola blanca (Odocoileus virginianus) en venezuela.

Parasitological and Serological Evaluation of Hemotropic Infections in White-Tailed Deers (Odocoileus virginianus) in Venezuela

INTRODUCCION

La anaplasmosis, tripanosomosis y babesiosis son enfermedades de interes veterinario que afectan a una amplia gama de mamiferos propiciando grandes perdidas economicas en explotaciones de bovinos (Bos taurus y Bos indicus) [14]. La anaplasmosis bovina es causada principalmente por Anaplasma marginale [2,13] organismo que se localiza dentro de los globulos rojos, tiene forma esferica y un tamano de 0,2 a 1 [micron]m [6]. El A. marginale es transmitido principalmente por garrapatas Ixodidae, tales como Rhipicephalus (Boophilus) microplus y Dermacentor spp. [9].

La babesiosis es causada por hemotropicos intraeritrociticos del genero Babesia, y su morfologia se asemeja a una pera con dimensiones que oscilan entre 1 a 5 [micron]m. Su transmision ocurre principalmente por garrapatas (Boophilus microplus) [8]. En Latinoamerica, la babesiosis bovina es causada por B. bigemina y por B. bovis [15] y la babesiosis equina por Theileria equi y Babesia caballi [21].

En Suramerica es aceptado generalmente que, la tripanosomosis bovina es causada por Trypanosoma vivax ylatripanosomosis equina por T. evansi y T. equiperdum [16]. Los tripanosomas son parasitos extracelulares que en su forma tripomastigota poseen una longitud que varia ampliamente entre 2 y 33 [micron]m. La region anterior es conica con nucleo en posicion central, poseen un flagelo y una membrana ondulante. En America son transmitidos mecanicamente por dipteros hematofagos [4].

Estas enfermedades estan ampliamente distribuidas, tanto en Venezuela como en otros paises tropicales y subtropicales, causando efectos negativos en la salud y productividad del ganado bovino y equino [14]. Anteriormente, se ha reportado el venado (Odocoileus virginianus) como reservorio de la anaplasmosis bovina [3, 17], asi como tambien se ha encontrado o infectado experimentalmente T. evansi y T. vivax en venados silvestres [1, 5, 20]. Respecto a la babesiosis, no se ha reportado en venados la presencia de los generos que causan la babesiosis bovina o equina, sin embargo, estos ungulados presentan otras especies silvestres de Babesia spp. [11].

Debido al interes que existe en la salud y productividad del ganado bovino y equino, el principal objetivo del presente trabajo fue evaluar directa e indirectamente la presencia de: A. marginale, T. vivax, T. evansi y Babesia spp. en venados de cola blanca (Odocoileus virginianus), los cuales coexisten, tanto con el ganado bovino como con el equino, en los llanos de Venezuela.

MATERIALES Y METODOS

Muestreo

El muestreo fue realizado en el hato "El Cedral", municipio Mantecal, estado Apure, Venezuela, en los meses de mayo y septiembre del 2001. Se capturaron cinco venados y con la finalidad de tranquilizarlos se utilizo un rifle de dardos (DIS-50K, ACES, EUA.) conteniendo 100 mg de Xilazina y 200 mg de Ketamina; al concluir el muestreo se utilizo como reversor 2 mL de Yohimbine. Una vez sedado el animal fue identificado con un zarcillo de plastico que se colocaba en la oreja derecha, cada zarcillo contenia una letra del abecedario (A; B; C; D; E), de esta manera se evito la recaptura del animal. Una vez capturado y dormido el animal se sangro de la vena yugular por medio de una puncion con una jeringa esteril, recolectando la muestra de sangre en tubos con y sin sal sodica del acido etilendiamino-tetra-acetico (EDTA) a una concentracion final de 0,15%. Del tubo sin EDTA se obtuvo el suero para la deteccion de anticuerpos anti agentes hemotropicos y las muestras conteniendo EDTA se usaron para el diagnostico parasitologico.

Diagnostico parasitologico

Las muestras de sangre colectadas en los tubos con EDTA fueron empleadas para determinar la infeccion activa por Anaplasma spp., Trypanosoma spp., y Babesia spp. mediante frotis de capa fina tenidos con May-Grunwald/Giemsa. La tecnica de microhematocrito (Woo) se utilizo para detectar la presencia de Trypanosoma spp. en movimiento [23].

Elaboracion del conjugado Anti-IgG de venado para los ensayos serologicos

Inmunoglobulinas G (IgG) de venado purificadas segun la metodologia descrita [7] fueron utilizadas para producir un inmunosuero anti-IgG de venado en conejo (Oryctolagus cuniculus). Para ello 1, mg de proteina emulsificada en 1 mL de adyuvante completo de Freund se inoculo por via subcutanea en un conejo. New Zeland. Una segunda inoculacion se administro luego de 21 dias (d), empleando el mismo protocolo pero con adyuvante Incompleto de Freund. A los 15 d se sangro el conejo por la vena marginal de la oreja, el suero obtenido se almaceno a -20[grados]C (refrigerador G&E, Venezuela) y posteriormente se utilizo para purificar IgG de conejo anti-IgG de venado que fueron acopladas a peroxidada [22] para obtener un conjugado a ser utilizado en el ensayo inmunoenzimatico de Western Blot o con fluoresceina para los ensayos de inmunofluorescencia indirecta [18].

Ensayo serologico "Western Blot"

Este ensayo se utilizo para detectar anticuerpos anti-Trypanosoma spp. y anti-Anaplasma marginale utilizando como material antigenico, extractos de T. evansi y la proteina recombinante Mayor de Superficie 5 (MSP5r de sus iniciales en ingles) de Anaplasma marginale [10, 12]. El material antigenico (MSP5r y extractos de T. evansi) fueron sometidos a una electroforesis en geles de acrilamida al 12%, en condiciones disociantes, posteriormente electro-transferidos a una membrana de nitrocelulosa [19]. Para ello se incubo el gel de poliacrilamida, la membrana de nitrocelulosa y los filtros (No 1703960, BioRad, Hercules, EUA) en tampon de transferencia (Glicina 39 mM, Tris 48 mM, SDS 0,0375 %, metanol 20% pH 8.0). Posteriormente se realizo la transferencia en el sistema Trans-Blots semi-dry (BioRad, Hercules, EUA), sometiendo el mismo a una corriente constante de 150 mA por 45 minutos (min). Una vez transferidas las proteinas a la membrana de nitrocelulosa se procedio a realizar el ensayo, iniciando con un bloqueo durante 1 hora en solucion salina tamponada (Tris-HCl, pH 7,5 con 5% de leche descremada). Posteriormente, las membranas fueron incubadas a 4[grados]C con los diferentes sueros diluidos 1:50 en la misma solucion salina tamponada (diluida 1:3) hasta el dia siguiente, se lavo con la solucion salina tamponada conteniendo 0,05% Tween-20, y se incubo el conjugado anti-venado diluido 1:250. Finalmente se lavo nuevamente y se visualizo la reaccion con la solucion 4-Cloro 1-naftol (Sigma, San Luis, EUA) y agua oxigenada. Como controles positivos se utilizaron suero de un bovino infectado experimentalmente con A. marginale y suero de un ovino (Ovis aries)infectado experimentalmente con T. evansi. Como control negativo se utilizo suero de un ovino sano.

Ensayo serologico de inmunofluorescencia indirecta

Este ensayo se utilizo para detectar la posible presencia de anticuerpos anti-T. evansi y anti-Babesia spp., utilizando como material antigenico frotis sanguineos de un raton (Mus musculus) fijados con acetona el cual fue infectado experimentalmente con T. evansi, cuya parasitemia era de 5-6x[10.sup.6] Tripanosomas/mL y frotis sanguineos de un bovino infectado experimentalmente con Babesia bovis, cuya parasitemia era de 2,42%. Siguiendo la metodologia de Todorovic y Long [18], la sangre, tanto del raton como del bovino fue lavada con tampon fosfato salino (PBS) pH 7,2 y resuspendida en PBS al 2% albumina bovina. Posteriormente se realizaron los frotis de sangre, los cuales se fijaron con acetona. Utilizando material oleoso, se demarco la region en la que se colocaron los sueros problemas, los mismos se prepararon a una dilucion 1:40 y se incubaron en un envase de plastico por 30 min a 37[grados]C. Luego se hizo un lavado con PBS y se anadio en cada pozo el conjugado IgG de conejo anti-IgG de venado acoplado a fluoresceina y se incubo a 37[grados]C por 30 min. Posteriormente se realizo un ultimo lavado y se observaron los frotis bajo el microscopio para fluorescencia (Leitz epiiluminacion, 100x, Alemania) en un cuarto oscuro. Como control positivo se utilizo suero de un raton infectado experimentalmente con T. evansi y suero de un bovino infectado experimentalmente con B. bovis, y como control negativo suero de raton y bovino sanos.

RESULTADOS Y DISCUSION

De los cinco venados capturados, solo dos, el D y el E, resultaron positivos a A. marginale utilizando el diagnostico parasitologico, TABLA I y FIG. 1, con una parasitemia de 1,14 y 1,51%, respectivamente. En la FIG. 2 se pudo observar que, solo el suero del venado A presento una mayor reactividad anti-MSP5r de Anaplasma marginale, a pesar de que en los frotis sanguineos de dicho venado no se encontro este hemotropico. Por otra parte, en la FIG. 3 se observo que los sueros de los venados C y D presentaron una intensa banda de reaccion con un polipeptido de aproximadamente 58 Kd del extracto antigenico, lo cual es consistente con la presencia de anticuerpos anti-Trypanosoma spp.

[FIGURA 1 OMITIR]

[FIGURA 2 OMITIR]

[FIGURA 3 OMITIR]

Con el ensayo de inmunofluorescencia indirecta se encontro nuevamente que los sueros de los venadosCyDtenian anticuerpos anti-Trypanosoma spp, y no se observo ninguna reaccion anti-Babesia (no mostrado).

De los tres generos de hemotropicos (Anaplasma, Trypanosoma y Babesia) buscados en venados (Odocoileus virginianus) en este estudio, solo A. marginale fue encontrado de forma directa por frotis de sangre en los venados D y E. El suero del venado A reacciono positivamente contra la proteina recombinante de A. marginal (rMSP5), sin embargo, no se observo este hemotropico en la sangre de este venado, lo cual sugiere que la presencia de este microorganismo era muy baja o inexistente pero que ciertamente estuvo infectado en algun momento con esta rickettsia pues aun se muestra seropositivo. Contrariamente los venados D y E fueron seronegativos pero positivos parasitologicamente. Esto es consistente con la posible presencia de una infeccion reciente que aun no ha generado una respuesta inmune por anticuerpos detectables. Los sueros de los venados C y D reaccionaron consistentemente de forma positiva por Western Blot e inmunofluorescencia indirecta a T. evansi, aunque la presencia del parasito no pudo ser detectada por metodos directos. Debido a la reaccion cruzada que existe dentro de genero Trypanosoma, la sola presencia de anticuerpos anti T. evansi no permite diferenciar la especie de este protozoo entre T. evansi o T. vivax.

CONCLUSIONES

La observacion directa de Anaplasma marginale mediante frotis sanguineos y la deteccion de anticuerpos anti-A. marginale y anti-T.evansi sugiere que el venado Odocoileus virginianus, podria estar participando como hospedador o reservorio natural en esta area de los llanos de Venezuela. Este estudio abre una linea de investigacion para comprobar si realmente el venado Odocoileus virginianus es reservorio natural de A. marginale y T. evansi que afectan de forma negativa el ganado bovino y equino en Venezuela. Para esto, es necesario estudiar otros factores como la identificacion de los vectores en el area, el potencial de transmision de los hemotropicos del venado a bovinos y equinos, y viceversa, asi como la patogenecidad de los hemotropicos provenientes del venado y que pudieran transferirse al ganado.

AGRADECIMENTO

Trabajo de investigacion realizado con el apoyo financiero del Decanato de Investigacion y Desarrollo de la Universidad Simon Bolivar y del FONACIT a traves de los proyectos G97-00634 y G98-003462.

Recibido: 06/09/ 2012. Aceptado: 31/10/2012.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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Adriana Silva-Iturriza (1,2), Ernesto Panier (1), Armando Reyna-Bello (3), Trina Perrone (2) ([cruz]) y Pedro Aso (1) *

(1) Universidad Simon Bolivar, Departamento de Biologia Celular. (2) Instituto Venezolano de Investigaciones Cientificas, Centro de Biofisica y Bioquimica, Laboratorio de Fisiologia de Parasitos. (3) Universidad Nacional Experimental Simon Rodriguez-IDECYT, Centro de Estudios Biomedicos y Veterinarios, Laboratorio de Inmunobiologia * 58-212-9064216, pedrom@usb.ve
TABLA I
DIAGNOSTICO PARASITOLOGICO POR FROTIS
SANGUINEOS COLOREADOS

Venado        Anaplasma spp.    Trypanosoma spp.     Babesia spp.

A                Negativo           Negativo           Negativo
B                Negativo           Negativo           Negativo
C                Negativo           Negativo           Negativo
D            Positivo (1,14%)       Negativo           Negativo
E            Positivo (1,51%)       Negativo           Negativo

Entre parentesis valores expresados como porcentaje de eritrocitos
infectados en 100 campos observados.
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Author:Silva-Iturriza, Adriana; Panier, Ernesto; Reyna-Bello, Armando; Perrone, Trina; Aso, Pedro
Publication:Revista Cientifica de la Facultad de Ciencias Veterinarias
Date:Jan 1, 2013
Words:2553
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