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Evaluacion morfologica de ovocitos caninos recuperados en diferentes fases del ciclo estral.

MORPHOLOGICAL EVALUATION OF CANINE OOCYTES RECOVERED IN DIFFERENT PHASES OF THE ESTROUS CYCLE

INTRODUCCION

El estudio de la biologia reproductiva de la perra domestica (Canis lupus familiaris) constituye un valioso modelo para la comprension y desarrollo de biotecnologias reproductivas con aplicacion en especies de canidos en peligro de extincion (Farstad, 2000; Luvoni, 2000). Ademas, las tecnicas de maduracion de ovocitos in vitro (MIV) y fecundacion in vitro (FIV) representan una alternativa para rescatar material genetico en hembras de alto valor y que presentan alteraciones reproductivas no hereditarias (Hishinuma et al, 2004).

Existe concordancia en destacar que debido a la particular fisiologia reproductiva de la perra, los progresos en el area de la reproduccion asistida han sido relativamente lentos al compararlos con otras especies, siendo el aspecto mas determinante de esta situacion la complejidad del gameto femenino, el cual se caracteriza por ser ovulado en estado de ovocito I (vesicula germinal), requiriendo reasumir y completar su proceso meiotico en el oviducto, y asi la madurez, entre 56 a 72 horas despues de la ovulacion (Luvoni et al., 2005; Reynaud et al., 2005).

Desde el primer reporte de MIV en ovocitos de perras (Mahi y Yanagimachi, 1976), se han realizado multiples ensayos con el proposito de generar un sistema eficiente de maduracion ovocitaria en cultivo para esta especie. Las caracteristicas especiales y unicas de ovular un ovocito I y el largo tiempo de maduracion en el oviducto han dificultado en gran medida los intentos de reproducir la MIV y la FIV en los ovocitos caninos, teniendose a la fecha un exito muy limitado. Por tanto, considerando que aun no hay suficientes antecedentes de los mecanismos que controlan la maduracion del ovocito, las investigaciones se han enfocado a identificar algunos factores intrinsecos y extrinsecos que influyen en la maduracion ovocitaria de esta especie (De los Reyes, 2011).

En terminos generales, los ovocitos caninos utilizados para MIV provienen de foliculos de diferentes tamanos, mostrando un bajo grado de maduracion en cultivos utilizando medios adaptados de tecnicas de MIV desarrolladas en otras especies. Esto ha motivado el estudio de factores que pudiesen influir en una mayor tasa de maduracion ovocitaria. Entre los factores estudiados cabe destacar: edad de la perra (Nickson et al., 1993; Strom Holst et al, 2001), tamano del ovocito (Hewitt y England, 1998a), densidad en el cultivo (Otoi et al., 2002), morfologia ovocitaria (Nickson et al, 1993), sistemas de co-cultivo (Hewitt y England, 1998b; Rodrigues y Rodrigues, 2003) y suplementaciones al medio de cultivo (De los Reyes et al, 2005; Bolamba et al, 2006; Vannucchi et al., 2009).

Un factor intrinseco que es senalado como controversial en los resultados de la MIV canina, es la influencia que podria ejercer el estado del ciclo estral de la hembra al momento de ser obtenidos los ovarios para la extraccion de ovocitos (Evecen et al., 2010; Chastant-Maillard et al., 2012). Esto se fundamenta en las notables variaciones en el ambiente hormonal de las hembras a traves del ciclo estral. La perra es una hembra monoestrica, no estacional y de ovulacion espontanea, con una a tres ovulaciones por ano, donde cada ciclo estral esta constituido por cuatro etapas o fases: anestro, proestro, estro y diestro. Hormonalmente el anestro se caracteriza por la ausencia de actividad esteroidogenica en los ovarios, el proestro es la etapa de mayor actividad folicular con un neto predominio estrogenico, el estro se relaciona con una disminucion en los niveles de estrogenos e incremento de progesterona asociado a la ovulacion y presencia de cuerpos luteos y el diestro es la fase de predominio progestagenico (Concannon, 2011).

Dados los antecedentes, el objetivo del presente estudio fue obtener y evaluar morfologicamente ovocitos caninos procedentes de hembras en las diferentes etapas del ciclo estral y comparar las proporciones de ovocitos potencialmente aptos para MIV.

MATERIALES Y METODOS

Obtencion de Ovarios y Fase del Ciclo Estral

La investigacion se desarrollo en el Hospital Clinico Veterinario de la Universidad Santo Tomas, Vina del Mar, Chile. Se ovariohisterectomizaron 30 hembras caninas adultas (2 a 6 anos), clinicamente sanas, con un peso corporal que fluctuo entre 10 y 30 kg.

En cada hembra se establecio la fase del ciclo estral mediante citologia vaginal y estudio macroscopico de la superficie de ambos ovarios, definiendo la presencia o ausencia de foliculos [mayor que o igual a] 5 mm y cuerpos luteos. El edema y sangrado vulvar fueron considerados en el diagnostico del proestro. Se descartaron seis hembras con patologias o alteraciones macroscopicas de los ovarios.

Una vez definida la fase del ciclo estral, se distribuyeron seis hembras por fase. Los ovarios obtenidos fueron almacenados y transportados al laboratorio en solucion Dulbecco's fosfato buffer salino (PBS) en un frasco esteril.

Obtencion de Ovocitos

Los ovarios, luego de la evaluacion macroscopica, fueron trasladados a placas Petri que contenian solucion PBS, para la obtencion de ovocitos mediante cortes de la corteza ovarica (slicing). Se hicieron cortes seriados, de aproximadamente 2 mm, en sentido longitudinal y transversal, utilizando hojas de bisturi oftalmico y bajo observacion con lupa estereoscopica (Fujii et al., 1999).

Para mejorar la observacion y recoleccion de los ovocitos, se agregaron 5 gotas de eosina al 5% al medio. Cada placa se dejo sedimentar por 5 min y el sedimento fue diluido en otra placa a fin de observar mas claramente y recuperar los ovocitos. Estos fueron recolectados con micropipetas adelgazadas en uno de sus extremos y conectadas a una jeringa de 1 ml. Los ovocitos fueron traspasados a otra placa que contenia 4 gotas de solucion PBS para su clasificacion.

Clasificacion de Ovocitos

Mediante una lupa estereoscopica (40X) se clasificaron los ovocitos siguiendo el criterio propuesto por Wood y Wildt (1997), en el cual se evalua la integridad/homogeneidad del citoplasma y la presencia y numero de capas del cumulus oophorus. Se describen cuatro categorias: Categoria I (excelente): con citoplasma facil de identificar, homogeneo, oscuro, nucleo esferico y excentrico, con cinco o mas capas completas de celulas de cumulo; Categoria II (bueno): con citoplasma homogeneo y oscuro, nucleo esferico y excentrico, con 2 a 4 capas completas de celulas de cumulo; Categoria III (regular): el citoplasma poco homogeneo, aspecto vacuolado y de transparencia por fragmentacion, y con 1 a 2 capas de celulas de cumulo, que pueden estar incompletas; Categoria IV (pobre): citoplasma heterogeneo, con transparencia, fragmentacion, y no posee cumulo o sus celulas estan dispersas. Los ovocitos de las categorias I y II se consideraron potencialmente aptos para MIV y los de las categorias III y IV no aptos para MIV.

Analisis Estadistico

Para el analisis estadistico de las categorias de ovocitos segun fase del ciclo estral se utilizo la prueba de Chi-cuadrado. Se utilizo la prueba de rangos multiples LSD de Fisher para determinar diferencias entre grupos. Las tasas de recuperacion de ovocitos potencialmente aptos para MIV por hembra y por fase del ciclo estral se analizaron mediante la prueba binominal de proporciones. En ambos analisis se considero un valor de p<0.01 como estadisticamente significativo. Se utilizo el programa computacional Win Episcope 2.0.

RESULTADOS Y DISCUSION

La evaluacion de los ovarios permitio establecer una fase sin estructuras (anestro), dos fases con presencia de foliculos [mayor que o igual a]5 mm y sin cuerpos luteos (proestro-estro) y otra fase con solo presencia de cuerpos luteos (diestro); criterios que concuerdan con Otoi et al. (2002) y Evecen et al. (2010).

Se registraron 8.3 [+ o -] 5.8 y 11.5 [+ o -] 2.9 foliculos [mayor que o igual a]5 mm en los grupos de proestro y estro, respectivamente, en tanto que en el grupo en diestro se registraron 8.6 [+ o -] 1.5 cuerpos luteos. La citologia vaginal tuvo como principal caracteristica el predominio de celulas parabasales en anestro (>60%), equivalencia entre celulas intermedias y superficiales, y mayor presencia de eritrocitos en proestro, predominio de celulas superficiales en estro (>70%) y predominio de celulas intermedias en diestro, lo cual esta de acuerdo con lo expuesto por otros autores (Feldman y Nelson, 1996; Concannon, 2011).

Se recolectaron 7750 ovocitos de los 148 ovarios procesados. De estos ovocitos, 5375 (69.4%) fueron clasificados morfologicamente como potencialmente aptos para MIV y 2375 (30.6%) como no aptos para MIV (Cuadro 1). No se observaron diferencias en el numero de ovocitos recolectados entre los ovarios izquierdo y derecho en cada fase del ciclo estral.

La mayor cantidad de ovocitos fueron recuperados en las fases de proestro y estro (86.6%), destacandose, ademas, la mayor proporcion de ovocitos aptos para MIV (93.2%) en estos dos grupos. Por otro lado, no se encontraron diferencias entre ambas etapas del ciclo estral. Estos resultados coinciden parcialmente con Williangham-Rocky et al. (2003), quienes determinaron que las mayores tasas de MIV para ovocitos caninos se alcanzaron en la fase de estro, situacion que podria explicarse por el estado del desarrollo folicular, donde predominaron los foliculos pre-ovulatorios en los cuales los factores de crecimiento u otras vias de senalizacion paracrinas pueden influir en la calidad de los ovocitos (De los Reyes et al., 2014). En anestro y diestro solo se recupero el 13.4% de los ovocitos totales, representando el 71.7% de los ovocitos clasificados como no aptos para MIV, concordando con el trabajo de Chastant-Maillard et al. (2012).

El Cuadro 2 muestra la distribucion de ovocitos potencialmente aptos para MIV obtenidos por hembra segun fase del ciclo estral. El mayor numero de ovocitos se obtuvo durante la fase de estro (448.0 [+ o -] 52.7) y el menor durante el anestro (21.8 [+ o -] 4.0), habiendo diferencias significativas en el numero de ovocitos por cada fase del ciclo estral.

Al analizar los resultados de las categorias de ovocitos potencialmente aptos para MIV, utilizando el coeficiente de variacion (CV = media/desviacion estandar x 100) como una medida de dispersion, se encontraron CV de 18.3, 15.3, 11.8 y 49.6% para el anestro, proestro, estro y diestro, respectivamente, rangos que fueron comunes para variables biologicas (Zar, 1999). No obstante, en la fase de diestro se observo una alta dispersion en los valores promedios de ovocitos aptos para MIV, lo que podria deberse a la presencia de cuerpos luteos en los ovarios, que dificultaron el proceso de corte de los ovarios, alterando la recoleccion de ovocitos.

Se concluye que la evaluacion morfologica de los ovocitos permitio establecer que la calidad y cantidad de ovocitos recuperados durante las fases de estro y proestro del ciclo estral, en terminos de su potencial uso para MIV, fueron mejores y mayores a los ovocitos obtenidos en el anestro y diestro.

http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v26i3.11181

LITERATURA CITADA

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25. Zar J. 1999. Biostatistical analysis. 4th ed. New Jersey, USA. Prentice Hall. 929 p.

Alfonso Sanchez R. (1,2), Carolina Ahumada C. (1)

(1) Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Santo Tomas, Vina del Mar, Chile

(2) E-mail: teriogenologiachile@vtr net

Recibido: 19 de enero de 2015

Aceptado para publicacion: 4 de mayo de 2015
Cuadro 1. Numero y calidad de ovocitos recuperados de
48 ovarios de perras segun fase del ciclo estral
de las perras (1)

                     Ovocitos para
                     maduracion in
                       vitro (n)        Total de
Fase del ciclo                          ovocitos
estral             Aptos     No aptos     (n)

Anestro           131 (a)    314 (a)    445 (a)
Proestro          2324 (b)   837 (b)    3161 (b)
Estro             2688 (b)   867 (b)    3555 (b)
Diestro           232 (a)    357 (a)    589 (a)

Total               5375       2375       7750

(a,b) Diferentes superindices dentro de columnas indican
diferencias significativas (p<0.01)

(1) Seis perras por fase

Cuadro 2. Promedio [+ o -] desviacion estandar
de ovocitos potencialmente aptos para maduracion
in vitro obtenidos por perra y por fase del ciclo
estral (6 perras por fase)

Ovocitos          Anestro                  Proestro

Hembra      21.8 [+ o -] 4.0 (d)    387.3 [+ o -] 59.4 (b)
Fase        74.2 [+ o -] 9.2 (d)    526.8 [+ o -] 71.8 (b)

Ovocitos           Estro                   Diestro

Hembra     448.0 [+ o -] 52.7 (a)   38.7 [+ o -] 19.2 (c)
Fase       592.5 [+ o -] 53.0 (a)   98.2 [+ o -] 12.7 (c)

(a,b,c,d) Diferentes superindices dentro de filas
indican diferencias significativas (p<0.01)
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Author:Sanchez R., Alfonso; Ahumada C., Carolina
Publication:Revista de Investigaciones Veterinarias del Peru (RIVEP)
Date:Jul 1, 2015
Words:2962
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