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Evaluacion molecular de genotipos de tomate por su resistencia a Meloidogyne incognita, Fusarium oxysporum y Ralstonia solanacearum con fines de mejoramiento.

Molecular screening of tomato genotypes for resistance to Meloidogyne incognita, Fusarium oxysporum and Ralstonia solanacearum for genetic improvement

INTRODUCCION

Las enfermedades del tomate preocupan a nivel mundial por las perdidas economicas debido a danos en el cultivo o el costo de las medidas de control (FAO, 2015).

El nematodo Meloidogyne incognita es posiblemente el parasito mas danino de los cultivos en el mundo (Trudgill y Blok, 2001), responsable de grandes perdidas en cultivos de importancia economica como el tomate (Solanum lycopersicum).

Se ha planteado que el gen Mi1-2 suprime el desarrollo y reproduccion de los nematodos formadores de agallas M. incognita, M. arenaria y M. javanica en tomate (Bleve-Zacheo et al., 2007; Verdejo-Luca y Sorribas, 2007). Se ha desarrollado un marcador tipo SCAR (siglas del ingles Sequenced characterized amplified region o Secuencia amplificada de una region conocida) ligado a este gen, denominado Mi-23, el cual es codominante, y amplifica un fragmento de 450 pb correlacionado con los fenotipos susceptibles de lineas de S. lycopersicum (mi/mi), otro de 400 pb con los resistentes (Mi/Mi) y ambos fragmentos (Mi/mi) con los heterocigotas (Seah et al., 2007a; Perez-Almeida et al., 2015). Mi-23F/Mi-23R tiene la ventaja de que no se necesita emplear enzimas de restriccion como en otro tipo de marcadores, no se amplifican falsos positivos en lineas resistentes a begomovirus, introgresadas de S. habrochaites y S. chilense, y pueden utilizarlo mejoradores que hayan introducido otras caracteristicas de resistencia ubicadas en la region Mi (Seah et al., 2007b).

La marchitez del tomate es causada por el hongo Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Sacc.) Snyder & Hans. Tres razas o patovares (1, 2 y 3) se distinguen por su virulencia en cultivares diferenciales de tomate que poseen distintos genes dominantes de resistencia (Mes et al., 1999). Basados en la existencia de resistencia dominante monogenica, se ha asumido una relacion gen por gen entre F. oxysporum f. sp. lycopersici y el tomate. Los patovares contienen genes de avirulencia los cuales corresponden a genes dominantes de resistencia en cultivares de tomate a los cuales son incapaces de infectar (Flor, 1971).

La estrategia de control de patogenos mas duradera y amigable con el ambiente consiste en desarrollar cultivares mejorados resistentes a la marchitez (Beckman, 1989). Para identificar genes dominantes de resistencia es esencial entender la interaccion entre patogeno y cultivo a un nivel genetico, es asi como los marcadores moleculares son utiles como herramienta (Grube et al., 2000; Foolad y Panthee, 2012).

La resistencia a Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 0 (ex raza 1) se introgreso de S. pimpinellifolium y fue mapeada al brazo corto del cromosoma 11 (Scott et al., 2004). Arens et al. (2010) desarrollaron un marcador SCAR dominante At-2F3/At2-R3 el cual amplifica un producto de 130 pb en los materiales resistentes, mientras que una delecion de siete nucleotidos impide amplificar productos en los susceptibles. El gen dominante I-2 de tomate confiere resistencia contra las razas 1 y 2 del patogeno. Fue introgresado del tomate silvestre S. pimpinellifolium (Stall y Walter, 1965) y mapeado al cromosoma 11 (Laterrot, 1976). El locus I-2 posee varios miembros (Ori et al. 1997). El marcador SCAR codominante I-2/5F e I-2/5R especificamente disenado en la secuencia del gen I-2 (Yu y Zou, 2008), distingue genotipos resistentes I-2 / I-2 con un fragmento de 693 pb; susceptibles i-2/ i-2, con 633 pb; y ambas bandas en los heterocigotas I-2/i-2. El locus I-3 introgresado de S. pennellii confiere resistencia a la raza 1, 2 y 3, fue mapeado al cromosoma 7 (Bournival et al., 1989; 1990). Aunque I e I-2 se han utilizado mas con fines de mejoramiento (Scott, 2008), actualmente I-3 se prefiere dado que la raza 3 se esta haciendo mas comun y existen pocos cultivares disponibles con el gen de resistencia I-3 (Foolad y Panthee, 2012). Los marcadores SCAR P7-43DF1/R1 y P743DF3/R1 se encuentran estrechamente ligados al gen I-3 en tomate (Barillas et al., 2008). Un gen I-7 adicional que confiere resistencia a la raza 3 de F. oxysporum f. sp. lycopersici se descubrio recientemente (Gonzalez et al., 2015). La acumulacion de varios genes de resistencia en el mismo genotipo es importante pues favorece la resistencia horizontal, mas dificil de romper por el patogeno y por ende mas duradera.

Ralstonia solanacearum es un patogeno del suelo de gran importancia en las zonas tropicales y subtropicales, causa la enfermedad conocida como marchitez bacteriana, que afecta una gran diversidad de cultivos (Hernandez et al., 2005). Los estudios de herencia de la resistencia a esta enfermedad son complejos y se han obtenido resultados diferentes segun los materiales empleados. Segun Miao et al. (2009) estan involucrados dos genes de resistencia y con dominancia incompleta, los cuales tienen efecto complementario. Se han localizado dos marcadores dominantes tipo SCAR [TSCAR.sub.AAG/CAT] y [TSCAR.sub.AAG/CAT], a 4.6 y 8.4 cM del gen de resistencia TRSR-1, respectivamente.

Los parientes silvestres del tomate cultivado constituyen un rico acervo de genes de resistencia a estreses bioticos y abioticos, asi como de otras caracteristicas importantes para el mejoramiento del cultivo. De alli que la introduccion de genes silvestres al tomate cultivado sea la base para el logro de cultivares e hibridos con nuevas caracteristicas (Foolad, 2007). El uso de variedades resistentes a los principales estreses bioticos reduce el uso de plaguicidas y preserva el ambiente, pero para obtenerlas es fundamental disponer de un germoplasma caracterizado morfologica, molecular y agronomicamente. Para realizar tal caracterizacion se han desarrollado gran cantidad de marcadores moleculares en tomate, cuyas bases se actualizan rapidamente desde la secuenciacion del genoma (The Tomato Genome Consortium, 2012).

Algunos de estos marcadores moleculares, entre ellos los SCAR, se realizan a traves de una PCR sencilla y se analizan en geles de agarosa, lo cual esta al alcance de muchos laboratorios en America Latina. Por lo tanto pueden implementarse rutinariamente en tomate asi como en otros cultivos para facilitar el trabajo de los fitomej oradores apoyados por herramientas biotecnologicas.

Los marcadores moleculares tienen la potencialidad de complementar las pruebas de patogenicidad, con la ventaja de que la reaccion no esta enmascarada por la dominancia (Arens et al., 2010). Tienen como ventaja sobre las pruebas biologicas que se pueden discriminar individuos homocigotas resistentes de aquellos heterocigotas en los lotes de semillas o de plantulas en primeros estados de desarrollo (Arens et al., 2010).

En la presente investigacion se planteo el uso de marcadores moleculares asociados a genes de resistencia a Meloidogyne incognita, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, y Ralstonia s olanacearum para caracterizar accesiones de tomate, incluyendo variedades comerciales de Solanum lycopersicum, especies silvestres y familias avanzadas [F.sub.3], con fines de implementarlos en el proceso de mejoramiento genetico.

MATERIALES Y METODOS

Se tomaron hojas libres de enfermedades de los siguientes materiales vegetales: 3 variedades comerciales de tomate (S. lycopersicum L.), esto es Sena, Floradade y 135; 16 accesiones silvestres de tomate [Solanum pimpinellifolium (06); S. lycopersicum var cerasiforme (02); S. neorickii (04); S. habrochaites (04)]; asi como 125 plantas [F.sub.3] derivadas de cruzamientos en los cuales se utilizo la variedad 135, cultivada por los agricultores de la provincia de Loja (Ecuador), como progenitor femenino y como donantes de polen accesiones silvestres de S. neorickii, S. pimpinellifolium, S. lycopersicum var. cerasiforme, S. habrochaites, asi como progenitores comerciales importados (S. lycopersicum). Estos cruzamientos habian sido realizados en la Universidad Nacional de Loja en anos previos.

Extraccion de ADN. Las hojas seleccionadas se maceraron con mortero y pestillo de porcelana en 1 mL del bufer de extraccion (100 mM Tris HCl pH 8,0; 1,4 M NaCl, 20 mM EDTA, 2 % CTAB, 1 % polietilenglicol y 0,5 % de sulfito de sodio) precalentado a 75 [grados]C (Risterucci et al., 2000; Perez-Almeida et al., 2011), se transfirio el macerado a microtubos de 1,5 mL, se incubo a 65 [grados]C por 20 min a 550 rpm. Luego se dejaron enfriar a temperatura ambiente y se agrego 1 mL de cloroformo: isoamilalcohol en proporcion 24:1. Despues de centrifugar por 15 min a 14 mil rpm se transfirio el sobrenadante a un tubo nuevo y se agrego 1 mL de etanol absoluto y 50 qL de acetato de sodio 3 M con pH 5,2 invirtiendo suavemente hasta observar la formacion del pelet de ADN. Los microtubos se colocaron a -20 [grados]C por 12 h para recuperar el maximo de ADN. Se realizo un lavado con etanol al 70 % y se seco el exceso colocando los tubos en una centrifuga a 45 [grados]C por 30 min. El ADN fue resuspendido en 50 pL de bufer TE 1X (100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA 0,5 M y pH 8).

La calidad del ADN se verifico en un gel de agarosa al 1% y la cantidad de ADN obtenido por cada muestra se determino por absorbancia utilizando un lector Synergy HT. Las diluciones de ADN de trabajo fueron preparadas a 25 ng x [micron][L.sup.-1].

Amplificacion por reaccion de la cadena de la polimerasa (PCR). Las muestras se amplificaron en un termociclador Eppendorf utilizando los marcadores tipo SCAR Mi23F: 5'-TGGAAAAA TGTTGAATTTCTTTTG-3', Mi23R: 5'-GCATA CTATATGGCTTGTTTACCC-3 ' (Seah et al., 2007a; Perez et al., 2015); At-2F3 5'-CGAATCT GTATATTACATCCGTCGT-3'; At2-R3 5'- GG TGAATACCGATCATAGTCGAG-3 ' (Arens et al., 2010); I-2/5F 5'- CAAGGAACTGCGTCTGT CTG-3'; I-2/5R 5 ' -ATGAGCAATTTGTGGCCA GT-3' (Yu y Zou, 2008); P7-43DF1 5'-GGTAAA GAGATGCGATGATTATGTGGAG-3 '; P7-43D F3 5'-CACGGGATATGTTRTTGATAAGCATG T-3'; P7-43DR1 5'- GTCTTTACCACAGGAAC TTTATCACC-3' (Barillas et al., 2008); TSCARAAT/CGAF 5'- TAGATGGAATCCAATAT CAGG-3'; [TSCAR.sub.AAT/CGA]R 5'- AACCACAGTG AAGGAATATACA-3 ' (Miao et al. 2009), descritos en la literatura como asociados a los genes Mi-1.2,I-1,1-2,1-3, y TRSR-1 de resistencia a Meloidogyne incognita, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, y Ralstonia solanacearum. Se preparo la mezcla de PCR en un volumen total de 10 [micron]L que contenia 3 mM Mg[Cl.sub.2], 10x Buffer GoTaq Promega, 400[micron]M dNTPs, 10 [micron]M de cada iniciador, 1U GoTaq polimerasa Promega y 50 ng de ADN genomico.

Se utilizo el siguiente programa de PCR: desnaturalizacion a 94 [grados]C por 5 min, seguido por 35 ciclos de amplificacion (desnaturalizacion a 94 [grados]C por 30 s, alineacion de los iniciadores a 54 [grados]C por 30 s, extension a 72 [grados]C por 1 min), extension final a 72 [grados]C por 7 min. Las amplificaciones se replicaron tres veces para confirmar los resultados.

Los productos de amplificacion se separaron mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa al 1,5 %, tenidos con Sybr Safe (1 [micron]L x [mL.sup.-1]), aplicando 100 V - 400 mA durante 1 h en buffer TAE 1X pH 8 y se visualizaron en un transiluminador ChemiDoc XR Biorad.

Para la determinacion del tamano de los fragmentos se utilizaron los marcadores de peso molecular de ADN de 100 pb y 1 kb plus de Promega.

RESULTADOS Y DISCUSION

Del total de 144 materiales estudiados, destaco la variedad Sena como portadora de la banda asociada al gen de resistencia al nematodo Meloidogyne incognita, al utilizar el marcador Mi23. El resto de los materiales resultaron susceptibles. En la Figura 1 se muestran las amplificaciones de algunos materiales a manera ilustrativa y la variedad Sena, con el patron de bandas caracteristico. Esta variedad se encuentra aun en uso en el pais y puede servir como control positivo de analisis sucesivos.

[FIGURA 1 OMITIR]

Cabe senalar que los tamanos observados son ligeramente menores a los visualizados en el reporte original de Seah et al (2007a), pero mantienen una diferencia de aproximadamente 50 pb, como senalado anteriormente por Perez et al. (2015). Es interesante destacar que este marcador ha mostrado correlacion entre los ensayos biologicos y moleculares (Arens et al., 2010), pese a la influencia del ambiente en la reaccion hospedero patogeno in vivo.

No se observo amplificacion en las accesiones de materiales silvestres utilizados en esta evaluacion, lo cual era de esperarse pues la region Mi se introgreso a materiales cultivados a partir de S. peruvianum.

Utilizando el marcador SCAR At2-F3/At2-R3 se observo que gran numero de las accesiones analizadas mostraron la banda asociada al gen de resistencia I-1 a aproximadamente 130 pb (Figuras 2A y 2B ilustran algunos materiales), el cual se conoce como ligado a la resistencia en I-1 (Arens et al., 2010). Los cebadores SCAR At2-F3/At2-R3 fueron disenados para amplificar solo en variedades con resistencia, pues uno de ellos es el cebador reverso homologo a los 7 pb adicionales presentes en materiales con resistencia y el otro cebador positivo ancla en una region comun en resistentes y susceptibles.

[FIGURA 2 OMITIR]

Por otro lado, el marcador asociado al gen I-2 de resistencia a F. oxysporum f. sp. lycopersici pudo discriminar materiales por bandas asociadas a susceptibilidad (aproximadamente a 693 pb) o resistencia (aproximadamente a 633 pb) (Figura 3). Se encontraron materiales como los silvestres PS3 y PS16 de la Peninsula de Santa Elena, los cuales amplificaron la banda asociada con la resistencia con los cebadores I-2/5F// I-2/5R (Figura 3) asi como Pimpi de Puerto Ayora (no se muestra). Estos resultados se pueden explicar dado que la resistencia a la raza 2 del patogeno fue introgresada a materiales cultivados a partir de S. pimpinellifolium por lo cual estos materiales poseen la resistencia naturalmente.

En cuanto a I-3, la mayor parte de los materiales revelaron dos bandas (heterocigotas), excepto numeros 19, 20 (Figura 4) y 78.2 (no se muestra) que amplificaron la banda asociada a la resistencia, y otros como 26.1 que mostraron la banda asociada a la susceptibilidad. La resistencia encontrada hasta ahora y que ha sido introgresada a los materiales comerciales proviene de S. pennellii (Catanzariti et al., 2015; Gonzalez et al. 2015).

Se observa que los materiales 19 y 20 muestran la banda asociada con la resistencia, mientras que el 26.1, la de susceptibilidad. El resto de materiales muestran ambas bandas, como heterocigotas; o fallan en amplificar.

A partir de estos resultados se seleccionaron los materiales para continuar el proceso de mejoramiento tomando en cuenta dos criterios fundamentales: rendimiento y la respuesta molecular la cual se establecio segun el patron de bandas del marcador asociado a la resistencia ante cada raza de F. oxysporum f. sp. lycopersici asi como la reaccion a M. incognita. De esta manera se escogieron 32 materiales presentados en el Cuadro 1.

[FIGURA 3 OMITTED]

[FIGURA 4 OMITTED]

Adicionalmente los materiales seleccionados fueron analizados con el marcador [TSCAR.sub.AAT/CGA] asociado a la resistencia a Ralstonia solanacearum (Miao et al., 2009), mostrando las bandas de tamano correspondiente a resistencia (Figura 5). Ya estos autores observaron que las lineas susceptibles no amplifican cuando se emplean estos marcadores dominantes.

Los genotipos promisorios identificados en la caracterizacion molecular deben ser validados in vivo a traves de la realizacion de ensayos de interaccion hospedero patogeno, los cuales permitiran corroborar las observaciones in vitro.

En este trabajo se pudo determinar cuales materiales geneticos se pueden usar como testigos resistentes o susceptibles en investigaciones locales. Los materiales que resultaron heterocigotas resistentes en familias [F.sub.3] con buenas caracteristicas agronomicas seran autofecundados para separar homocigotas resistentes y asi avanzar en la obtencion de nuevos materiales geneticos para suministrar a los productores de tomate.

[FIGURA 5 OMITIR]

CONCLUSIONES

Se validaron marcadores moleculares disenados para tres de las principales enfermedades que afectan actualmente al tomate, por medio de los cuales fue posible separar genotipos de una poblacion bajo mejoramiento. El uso de los marcadores moleculares asociados a la resistencia a Meloidogyne incognita y Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici permitio diferenciar genotipos resistentes, susceptibles y heterocigotas; mientras que los marcadores utilizados para detectar la reaccion a Ralstonia solanacearum evidenciaron presencia de resistencia en la poblacion estudiada. Algunos materiales geneticos se pueden emplear como testigos resistentes o susceptibles en investigaciones locales futuras.

AGRADECIMIENTO

Al Programa Prometeo de la Secretaria de Ciencia, Educacion y Tecnologia (SENESCYT) del Ecuador, por financiar esta investigacion.

A la Universidad de Guayaquil, Universidad Nacional de Loja y Laboratorio de Biologia Molecular del Centro de Investigaciones Biotecnologicas del Ecuador-Escuela Superior Politecnica del Litoral (CIBE-ESPOL) por facilitar el uso de sus instalaciones para los experimentos.

LITERATURA CITADA

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Recibido: Septiembre 8, 2015 Aceptado: Marzo 18, 2016

Iris Perez-Almeida [1], Rafael Morales-Astudillo [2], Reina Medina-Litardo [3], Galo Salcedo-Rosales [3], Andrea F. Dascon [4] y Tulio Solano-Castillo [2]

[1] Investigador Prometeo U de Guayaquil. Dpto. Biotecnologia. Instituto Nacional de Investig. Agropecuarias (INIAP). Estacion Experimental Litoral Sur. Canton Yaguachi, Provincia del Guayas, Ecuador. e-mail: iris.perez@iniap.gob.ec

[2] Ingenieria Agropecuaria, Universidad Nacional de Loja, Ecuador

[3] Facultad de Ciencias para el Desarrollo, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad de Guayaquil. Ecuador

[4] Universidad de Azuay, Escuela de Biologia, Ecologia y Gestion. Ecuador
Cuadro 1. Materiales seleccionados en este estudio de acuerdo a
los criterios: respuesta molecular a enfermedades y rendimiento.

                       Respuesta molecular a enfermedades
                            (Marcador utilizado (2))

Material    Origen    Rendimiento   Nematodos   Fusarium

14.1       SLc X SL      Alto           S          R
21.1       SLc X SL      Alto           S          R
129.4      SLc X SL      Alto           S          na
129.2      SLc X SL      Bueno          S          R
136.3      SP X SL       Alto           S          R
145.2      SP X SL       Alto           S          R
69.3       SLc X SL     Mediano         S          R
69.4       SLc X SL      Bueno          S          R
141.5      SLc X SL     Mediano         S          R
150.2      SLc X SL      Bueno          S          R
178.2      SP X SL      Mediano         S          R
130.6      SLc X SL      Bueno          S          R
90.6       SLc X SL     Mediano         S          R
55.5       SLc X SL      Bueno          S          R
120.1      SLc X SL      Bueno          S          R
37.1       SLc X SL      Bueno          S          R
61.3       SN X SL       Bueno          S          R
78.2       SLc X SL      Bueno          S          R
26.1       SLc X SL      Bueno          S          R
83.6       SLc X SL      Bueno          S          R
88.5       SLc X SL      Bueno          S          R
121.4      SLc X SL      Bueno          S          R
129.1      SLc X SL      Bueno          S          R
102.1      SP X SL       Bueno          S          R
143.3      SLc X SL      Bueno          S          R
135        SL            Bueno          S          R
135.15     SLc X SL      Bueno          S          R
135.9      SLc X SL      Bueno          S          R
142.3      SH X SL       Bueno          S          R
131.1      SH X SL       Bueno          S          R
55.2       SH X SL       Bueno          S          R
179.3      SH X SL       Alto           S          R

                       Respuesta molecular a enfermedades
                             (Marcador utilizado (2))

Material    Origen    Fusarium   Fusarium raza   Bacteria

14.1       SLc X SL      S             S            R
21.1       SLc X SL      S             S            R
129.4      SLc X SL      na           na            na
129.2      SLc X SL      S             S            R
136.3      SP X SL       HT           HT            R
145.2      SP X SL       HT           HT            R
69.3       SLc X SL      S             S            R
69.4       SLc X SL      S             S            R
141.5      SLc X SL      S             S            R
150.2      SLc X SL      S            HT            R
178.2      SP X SL       HT           HT            R
130.6      SLc X SL      S             S            R
90.6       SLc X SL      S            HT            R
55.5       SLc X SL      S            HT            R
120.1      SLc X SL      na           na            na
37.1       SLc X SL      S             S            R
61.3       SN X SL       S             S            R
78.2       SLc X SL      S             S            R
26.1       SLc X SL      S             S            R
83.6       SLc X SL      HT           HT            R
88.5       SLc X SL      HT            S            R
121.4      SLc X SL      HT            S            R
129.1      SLc X SL      na           na            na
102.1      SP X SL       HT           HT            R
143.3      SLc X SL      S            HT            R
135        SL            S             S            R
135.15     SLc X SL      S             S            R
135.9      SLc X SL      S             S            R
142.3      SH X SL       S            na            na
131.1      SH X SL       S            HT            R
55.2       SH X SL       S            HT            R
179.3      SH X SL       R            HT            R

(1) SL = Solanum lycopersicum; SLc = S. lycopersicum var.
cerasiforme; SH = S. habrochaites; SP = S. pimpinellifolium;
SN = S. neorickii. (2) Marcadores moleculares SCAR: Mi23 =
Mi-23F/Mi-23R; I1 = At2-F3/At2-R3; I2 = I-2/5F/I-2/5R; I3 =
I3F3/R1 P7-43DF3/P7-43DR1; TRSW = RS1 TSCARAAT/CGAF/ TSCARAAT/
CGAR. na = no amplificaron; S = Susceptible; R = Resistente;
HT = Heterocigota (presenta bandas de susceptibilidad y resistencia
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Author:Perez-Almeida, Iris; Morales-Astudillo, Rafael; Medina-Litardo, Reina; Salcedo-Rosales, Galo; Dascon
Publication:BIOAGRO
Date:Aug 1, 2016
Words:4524
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