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Evaluacion microbiologica y molecular de Moniliophthora perniciosa (Agaricales: Marasmiaceae).

MICROBIOLOGICAL AND MOLECULAR EVALUATION OF MONILIOPHTHORA PERNICIOSA (AGARICALES: MARASMIACEAE)

INTRODUCCION

El cacao presenta dos patogenos de alta incidencia, los hongos M. perniciosa y M. roreri, agentes causales de la enfermedad de la escoba de bruja y la moniliasis del cacao, respectivamente. Estos dos patogenos son los causantes de las mayores perdidas en produccion a nivel mundial. El estado fitosanitario del cultivo asociado a problemas de tecnologia, capacitacion tecnica del recurso humano y la perdida de la variabilidad genetica de las plantaciones, han producido un decreciente interes por parte de los agricultores en producir cacao en Colombia (MINISTERIO DE AGRICULTURA, 2004).

El agente causal de la escoba de bruja del cacao fue clasificado inicialmente por STAHEL en 1915 como Marasmius perniciosa, mas tarde fue transferido al genero Crinipellis por SINGER (1942), y luego fue denominado Moniliophthora perniciosa por AIME & PHILLIPS-MORA (2005). Este patogeno se ha visto infectando brotes, inflorescencias y frutos de Theobroma cacao y es endemico para muchas otras especies del genero Theobroma, Herraniay de las familias Solanaceae, Bignoniaceae y Malpighiaceae (RESENDE et al., 2000). Entre sus caracteristicas microbiologicas se destacan un micelio morfologicamente variable y generalmente dependiente del biotipo, que le brinda el hospedero o incluso el medio de cultivo. Sus esporas son blancas, laminillas no separables, micelio tabicado y poseen esporas externas de origen sexual (basidiosporas) que se forman sobre organos especiales llamados basidios; las basidiosporas son liberadas mediante un mecanismo de explosion, estas tienen vida corta, son fotosensibles y si no llegan a caer en un lugar apropiado para su desarrollo mueren en menos de una hora (GARCES, 2001).

La caracterizacion molecular de M. perniciosa y M. roreri, tradicionalmente ha partido de la extraccion de ADN obtenido de cultivos monosporicos, lo cual garantiza un ADN de muy buena calidad, pureza y exclusivo del organismo estudiado (VILLEGAS, 2005), sumado a que tal como lo afirman RODRIGUEZ & SAAVEDRA (2005), un factor limitante para investigar este patogeno es la escasez en campo de inoculo infectivo, debido a la estacionalidad y la fuerte influencia de la condiciones climaticas en la produccion de los basidiocarpos. Pero la obtencion de un ADN puro y de buena calidad proveniente de cultivos, tambien puede presentar una limitante en los estudios de patogenicidad y variabilidad genetica, conferida por la seleccion artificial de esporas en los medios de cultivo, asi se pueden caracterizar molecularmente esporas o biotipos que se presentan minoritariamente en el cultivo y que de ninguna manera presentan impacto en la produccion.

Los estudios del ADN ribosomal en numerosos basidiomicetos, han encontrado que los espaciadores transcritos internos (ITS), muestran una variacion que se convierte en un marcador taxonomico muy util para distinguir entre especies (VILGALYS & GONZALEZ, 1990; WHITE et al., 1990; MILLER et al., 1999; CHEN et al., 2000). En este estudio se utilizaron herramientas microbiologicas y moleculares, encaminadas a fortalecer el conocimiento taxonomico de este patogeno, y ademas se propone una metodologia rapida y confiable para su diagnostico.

MATERIALES Y METODOS

Recoleccion, aislamiento y determinacion de aislados

La recoleccion del material se realizo en la Granja Casa Luker S.A. (Palestina, Caldas, Colombia), ubicada a 1010 msnm, temperatura promedio de 22,5[grados]C y una precipitacion promedio anual de 2128 mm. Se colectaron doce muestras de basidiocarpos de tallos para M. perniciosa y dos muestras de fruto para M. roreri, provenientes de diferentes materiales de cacao (Tabla 1). Estas muestras se rotularon y almacenaron en papel aluminio y luego en bolsas de papel, para despues llevarlas a neveras de icopor con pilas refrigerantes. Las muestras permanecieron un maximo de 7 horas antes de su posterior tratamiento en el laboratorio.

Las escobas secas con presencia de basidiocarpos en diferentes estados de desarrollo, se llevaron al laboratorio. Las escobas que presentaron basidios en estadios tempranos de crecimiento, se almacenaron en camara humeda, y las que presentaron basidiocarpos en estadio optimo de desarrollo, se almacenaron en bolsas y se guardaron a 4[grados]C.

El basidiocarpo seleccionado se adhirio del pileo a la tapa de una caja de petri, con ayuda de vaselina y posteriormente se descargaron las esporas en la base de la caja, la cual contenia Agar Agua al 3%. Con un bisturi se corto la parte del medio de cultivo donde las esporas se localizaban y se monto sobre un portaobjetos, ubicando a 4X las esporas y traspasando a 10X una sola espora a cada uno de los medios de cultivo (PDA, Agar Malta y Agar Sabouraud). Se evaluo el crecimiento miceliar en los medios de cultivo, las cajas de petri se incubaron a 26[grados]C, por un periodo de ocho dias. Para M. roreri se realizo la descarga de las esporas directamente desde los frutos infectados y se efectuo el mismo procedimiento hasta la obtencion de cultivo monosporico (VILLEGAS, 2005).

Extraccion del ADN

Para la extraccion del ADN de cultivos monosporicos, se tomo una porcion de micelio del hongo y se macero con 200 [micron]l de buffer de lisis (EDTA 0,5 M, NaCl 5 M, SDS 10 mM), se llevo al bano maria por 5 minutos a 96[grados]C. La extraccion se realizo por el metodo fenol cloroformo alcohol isoamilico y precipitacion con etanol y acetato de sodio, el precipitado se resuspendio en 30 [micron]l de Tris-EDTA pH: 8,0 (Tris HCl 10 mM, EDTA 0,1 M) y se almaceno a 4[grados]C (modificado de GOODWIN & LEE, 1993.) La extraccion directa del ADN de fructificaciones, correspondio al corte de basidiocarpos y lavado con hipoclorito al 3% durante 1 minuto y agua destilada por 5 minutos, se maceraron los basidiocarpos correspondientes a cada material de cacao con 200 [micron]l de buffer de lisis (EDTA 0,5 M, NaCl 5 M, SDS 10 mM) e incubacion a 56[grados]C por una hora, extraccion por el metodo fenol-cloroformo-alcohol isoamilico (adicionando 0,3 g de glass beads al inicio de la extraccion), precipitacion con etanol y acetato de sodio. El precipitado se resuspendio en 30 [micron]l de Tris-EDTA pH: 8,0 y se conservo a 4[grados]C (modificado de NIH, 2005). La calidad y cantidad se determino por comparaciones con concentraciones conocidas en geles de agarosa al 1%.

Amplificacion por PCR

La amplificacion de secuencias repetidas del rRNA que contienen las regiones espaciadoras ITS1, ITS2 y el gen 5.8S, que se han convertido en marcadores moleculares para numerosas especies de basidiomicetos, se llevo a cabo con los iniciadores ITS-1 (5'TCC GTA GGT GAA CCT GCG G3'), ITS-4 (5'TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC3') propuestos por (WHITE et al., 1990; SARTORATO, et al., 2006). La mezcla de reaccion se llevo a cabo en 20 [micron]l que contenian de 100 a 200 ng de ADN, 800 [micron]M de la mezcla dNTP's, 1,5 unidades de Taq polimerasa (invitrogen), 1,5 mM de Mg[Cl.sub.2], 0,4 [micron]M de cada iniciador y 2 [micron]l del buffer 10X. La amplificacion se realizo en un termociclador (Bio-Rad PTC-200) con el siguiente perfil termico: desnaturalizacion inicial de 94[grados]C x 2,5 min, seguido de 35 ciclos de: Anillamiento: 60[grados]C x 40 s, Extension: 72[grados]C x 30 s, Denaturacion: 94[grados]C x 30 s, y una elongacion final de 72[grados]C por 5 minutos. Los productos de amplificacion se separaron en geles denaturantes de acrilamida al 4%, en camara de secuenciamiento C.B.S. Scientific corp., revelados con nitrato de plata (SANGUINETTI et al., 1994) y analizados fotograficamente por medio del programa Corel Photo-Paint version 11.633.

RESULTADOS

Dos muestras de M. perniciosa y dos de M. roreri (hospederos EET8 y Escabino), se evaluaron microbiologicamente en los diferentes medios de cultivo. Los medios que permitieron el mayor crecimiento del hongo fueron PDA (Papa - Dextrosa Agar) y Malta, por lo tanto se decidio producir el inoculo de los patogenos en estos dos medios de cultivo y realizar la extraccion de ADN.

La amplificacion de secuencias repetidas del rRNA con los iniciadores ITS1 - ITS4, presentaron un producto de 750 pb de M. perniciosa y de 710 pb para M. roreri, para todos los aislados monosporicos y basidiocarpos de los dos patogenos (Figura 1), confirmando el diagnostico rapido y preciso de los dos patogenos. Ademas, tenemos que los resultados de nuestro estudio, confirman que el ADN obtenido del metodo de extraccion directa es de buena calidad, lo cual se evidencio por su facil amplificacion a traves del PCR, utilizando diferentes concentraciones de ADN y por la realizacion de amplificaciones comparativas con el ADN del cultivo monosporico. Ambos metodos de obtencion de ADN presentaron buena sensibilidad, reproducibilidad y estabilidad en cuanto a su capacidad de amplificacion por PCR con los marcadores ITS seleccionados.

[FIGURA 1 OMITIR]

DISCUSION

La amplificacion de secuencias repetidas del rRNA, especificamente de la region ITS, permitio corroborar rapida y eficientemente a M. perniciosa y diferenciarlo de M. roreri. En este trabajo no se encontro polimorfismo intraespecifico y, por lo tanto, no se pueden discriminar biotipos usando este marcador molecular, lo cual concuerda a lo reportado por VILGALYS & GONZALEZ (1990), WHITE et al. (1990), MILLER et al. (1999), CHEN et al. (2000) y ARRUDA et al. (2003), donde encontraron que los ITS en numerosos basidiomicetos es considerado un marcador taxonomico para diferenciar especies.

Los productos del PCR obtenidos de la amplificacion con los iniciadores ITS1 - ITS4, para M. perniciosa presentaron un producto unico de peso molecular aproximado correspondiente a 750 pb, lo que concuerda con lo encontrado por ARRUDA et al., (2003), en 120 aislados monosporicos de M. perniciosa provenientes de diferentes localidades y hospederos de cacao, y los trabajos de LANA (2004) realizados en tres regiones geograficas de Brasilia, que muestran que la variabilidad genetica en esta region parece ser reducida para esta especie. Asi tenemos que los iniciadores ITS1 e ITS4, para M. roreri, presentaron productos unicos de 710 pb, lo cual concuerda con lo reportado por PHILLIPS-MORA et al. (2007), quienes encontraron una banda diagnostica aproximada de 741 pb para 94 aislados de M. roreri provenientes de Brasilia, utilizando los iniciadores ITS4 e ITS5.

Los estudios de M. perniciosa y M. roreri, presentan resultados interesantes y algunas veces contradictorios, asi PHILLIPS-MORA et al. (2007) afirman que M. perniciosa y M. roreri, estan intimamente relacionados y probablemente comparten un ancestro comun, evidenciando su relacion, incluso proponen la hipotesis que M. roreri sea la fase asexual de M. perniciosa. Esta hipotesis es discordante con los resultados encontrados en este estudio, ya que si estos dos hongos fueran una misma especie, el diagnostico molecular deberia arrojar un perfil molecular similar para ambos aislamientos patogenicos.

La caracterizacion molecular de hongos fitopatogenos por lo general utiliza cultivos monosporicos realizados a partir de aislamientos en campo, disminuyendo las dificultades que representa la obtencion de material de partida en cantidad suficiente bajo condiciones climaticas o estacionales desfavorables a la produccion de basidiocarpos. Sin embargo, la desventaja evidente de la utilizacion de cultivos de hongos en el laboratorio es la seleccion artificial de esporas que ocurre en los medios artificiales de cultivo, privilegiando la proliferacion de ciertos genotipos que no necesariamente representan adecuadamente la diversidad genetica en campo.

En el presente estudio, los medios de cultivo PDA y Malta presentaron los mejores resultados para el crecimiento del patogeno, lo que concuerda con RODRIGUEZ & SAAVEDRA (2005), quienes encontraron un buen crecimiento en PDA, asi como un crecimiento del micelio mas denso que los otros medios de cultivo. La extraccion de ADN directamente de basidiocarpos del hongo puede ser un limitante para los analisis moleculares, dependiendo de la herramienta usada, asi tenemos que marcadores moleculares aleatorios como polimorfismos de fragmentos amplificados al azar (RAPD), pueden presentar problemas a la hora de utilizar ADN obtenido bajo estas condiciones. Sin embargo, en este trabajo se demuestra que los marcadores de tipo especifico ITS (especie especifico) presentan ventajas en cuanto a la reduccion de tiempo y costos de analisis, evitando ademas el riesgo de contaminacion que representan los medios de cultivo.

Otro aspecto importante de la extraccion directa, es que cuando se utilizan marcadores moleculares que determinan biotipos y diversidad genetica (IGS y SSR), el uso de medios de cultivo favorece la amplificacion del biotipo mayoritario o seleccionado en el cultivo, que posiblemente no sobrevivirian en el entorno natural, y no del basidiocarpo que se encuentra infectando la planta. La importancia de un metodo diagnostico certero, radica en el nivel de confianza que ofrece a quien este interesado en conocer el estado real de la situacion fitosanitaria de un cultivo. Una vez que se tiene certeza del diagnostico del patogeno, se pueden tomar medidas eficientes para el control que ahorren tiempo y dinero.

AGRADECIMIENTOS

A la Vicerrectoria de Investigaciones y Postgrados de la Universidad de Caldas, por la financiacion de este proyecto. Al Grupo de Investigacion GEBIOME (Genetica, Biodiversidad y Fitomejoramiento), por su soporte logistico, academico, tecnico y humano. A Casa Luker y Granja Luker, por permitirnos colectar el material vegetal. Al laboratorio de Marcadores Moleculares de Cenicafe, dirigido por la Dra. Pilar Moncada, por su entrenamiento tecnico y apoyo. A Luis Eduardo Zuluaga, por su asesoria en la etapa de campo.

BIBLIOGRAFIA

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Carlos Alberto Orozco (1), Carolina Osorio S. (1), Maria Jose Botero (1), Fredy A. Rivera Paez (1), German Ariel Lopez Gartner (1)

* FR: 3-IX-2010. FA: 28-V-2010.

(1) Grupo de Investigacion Genetica, Biodiversidad y Fitomejoramiento --GEBIOME--, Departamento de Ciencias Biologicas, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Caldas, Manizales, Caldas, Colombia. E-mail: german.lopez@ucaldas.edu.co; fredy.rivera@ucaldas.edu.co
Tabla 1. Procedencia de M. perniciosa y M. roreri utilizadas en el
estudio.

Hospedero             M. perniciosa    M. roreri

T. cacao IMC67              X
T. cacao TCA644             X
T. cacao EET8               X              X
T. cacao ICS95              X
T. cacao CAP34              X
T. cacao CCN51              X
T. cacao ESCABINO           X              X
T. cacao ICS60              X
T. cacao ICS1               X
T. cacao ICS39              X
T. cacao TSH565             X
T. cacao LUKER40            X
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Author:Orozco, Carlos Alberto; Osorio S., Carolina; Botero, Maria Jose; Rivera Paez, Fredy A.; Lopez Gartne
Publication:Boletin Cientifico Centro De Museos De Historia Natural
Article Type:Report
Date:Jan 1, 2011
Words:3052
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