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Evaluacion del poder discriminatorio de tecnicas de epidemiologia molecular en aislados Venezolanos de Mycobacterium tuberculosis.

Evaluation of discriminatory power of molecular epidemiology techniques in Mycobacterium tuberculosis Venezuelan isolates.

INTRODUCCION

La tuberculosis (TB) continua siendo un problema de salud publica a nivel mundial. La Organizacion Mundial de la Salud (OMS) ha estimado que cada ano se producen 9 millones de casos y mueren 1,7 millones de personas (1,2). La incidencia de TB en Venezuela es moderada, con aproximadamente 33 casos por cada 100.000 habitantes por ano (1,2).

El entendimiento de la dinamica de la transmision de la TB se ha logrado gracias a la aplicacion de diferentes tecnicas de epidemiologia molecular (EM). Entre las tecnicas mas utilizadas, se encuentra aquella basada en el polimorfismo de longitud de los fragmentos de restriccion, conocida como RFLP IS6110. El metodo fue considerado el estandar de oro por su alta capacidad de discriminacion, a pesar de tener como desventajas el ser laborioso, no generar formatos digitales que faciliten la interpretacion de los resultados y las comparaciones intra e interlaboratorios, ademas de requerir de mucho ADN de excelente calidad (3, 4).

En los ultimos anos, dos metodos alternativos basados en PCR han sido utilizados: el espoligotipaje y el analisis de Unidades Repetitivas Micobacterianas Interdiseminadas basado en el Numero Variable Repetidos Tandem conocida como MIRU- VNTR. La tecnica de espoligotipaje se fundamenta en la amplificacion por PCR del locus de repetidos directos (DR) (4,5) que pertenece a la familia de repetidos cortos palindromicos interdiseminados regularmente (CRISPR) (6). La tecnica ha sido util ya que el polimorfismo presente en la region DR ha permitido la asociacion de linajes con regiones geograficas a nivel mundial. Sin embargo, su principal desventaja radica en que es poco discriminatoria, por lo que no es util para detectar brotes ni cadenas de transmision (7).

El metodo MIRU-VNTR esta basado en la amplificacion por PCR de multiples loci con secuencias repetidas que estan presentes en el genoma de M. tuberculosis, y permite determinar el numero de repetidos en cada locus. Inicialmente, se empleo un sistema denominado "tradicional", que utilizaba 12 loci para estudios epidemiologicos (8), pero su discriminacion no era comparable con el metodo RFLP IS6110 (7). Finalmente, se propuso un formato estandarizado de 24 loci con una discriminacion comparable al metodo RFLP IS6110 y superior a espoligotipaje y un subgrupo de 15 loci para estudios epidemiologicos (9, 10). Por su capacidad discriminatoria, MIRU-VNTR 24 loci es actualmente considerado el metodo estandar de oro para la tipificacion genetica de M. tuberculosis (11).

Adicionalmente, en diferentes estudios se ha demostrado una variabilidad en el nivel del polimorfismo de los loci MIRU-VNTR que puede atribuirse al origen geografico de la cepa y a diferencias entre los linajes geneticos (9, 6). Por otra parte, basados en la diversidad alelica de los diferentes loci MIRU-VNTR, existen evidencias previas que sugieren, que el numero y la combinacion de loci MIRU-VNTR a utilizar para discriminar entre los genotipos, puede adaptarse a la poblacion de cepas M. tuberculosis encontradas en el area en estudio (13, 14).

En Venezuela, un estudio previo en una poblacion amerindia de alta incidencia de TB conocida como Waraos, constato que el 78% de los aislados de M. tuberculosis presentaban similitud genetica, por lo que se encontraban agrupados en clusters, pero ademas demostro que MIRU-VNTR 15 loci combinado con espoligotopaje, asi como MIRU-VNTR 24 loci, tienen la suficiente discriminacion para reemplazar el metodo RFLP IS 6110 (15). Otra investigacion previa a gran escala en Venezuela, en el que se aplico espoligotipaje, demostro que los linajes mas predominantes fueron Latin America-Mediterraneos (LAM) en 53%, seguido del genotipo T (10,6%) y Haarlem (5%). Los cinco espoligotipos mas frecuentes fueron los tipo compartidos o SIT 17 (18,6%), 93 (9,9%), 605 (7,2%), 42 (6,5%) y 53 (4,1%) (16).

Aunque estudios previos han sugerido que MIRU-VNTR 24 loci posee mejor discriminacion que el metodo de espoligotipaje, fue en el presente estudio que por primera vez se aplicaba la tecnica a gran escala con los diferentes genotipos encontrados en Venezuela por la tecnica de espoligotipaje. Es por lo antes expuesto, que el objetivo de la investigacion fue evaluar la discriminacion del metodo MIRU-VNTR 24 loci solo y en asociacion con espoligotipaje en aislados clinicos de M. tuberculosis en Venezuela. Ademas, nos propusimos determinar la diversidad alelica de los 24 loci y comparar su poder discriminativo con el set de 15 loci (10), los 12 loci tradicionales (12t) (8), y un set de loci seleccionados que presentaran la mas alta diversidad alelica en la poblacion de cepas de M. tuberculosis en Venezuela. Por otra parte, se determino la capacidad de la tecnica de designar los aislados de M. tuberculosis venezolanos en su linaje correspondiente.

MATERIAL Y METODOS

Cepas micobacterianas: Se analizaron un total de 469 aislados clinicos de M. tuberculosis provenientes de diferentes regiones de Venezuela (Distrito Capital, Carabobo, Delta Amacuro, Sucre, Apure y Aragua), previamente caracterizados por espoligotipaje: 352 aislados LAM, 7 Haarlem, 3 S, 25 T, 1 Beijing, 76 del ST 605 y 5 aislados unicos (16), para evaluar la capacidad del metodo MIRU-VNTR 24 loci en la designacion de los aislados dentro de su linaje correspondiente. Posteriormente, para los estudios de discriminacion, se seleccionaron al azar un total de 104 cepas pertenecientes a diferentes linajes (Tabla I). Finalmente, el analisis de discriminacion se complemento con 431 cepas pertenecientes exclusivamente al linaje LAM (STs 17, 93, 42, 60, 64, 130, 216, 960, 1367, 1694, 1691, 1696, 1698, 1702 y 0,817/LAM) y al ST 605.

Extraccion del ADN: Las cepas de M. tuberculosis fueron recuperadas de muestras congeladas en glicerol y sembradas en medio de Lowenstein Jensen, incubadas a 37[grado]C por 3 a 4 semanas. El ADN fue extraido usando la tecnica de muerte celular por calentamiento. Se resuspendieron las colonias de M. tuberculosis obtenidas del medio de cultivo Lowensten Jensen en 200 [micron]l buffer TE (Tris-HCl 10 mM/EDTA 1mM pH 8,0), en tubos Eppendorf de 1,5 ml con tapa de seguridad. Se incubaron a 80[grado]C-85[grado]C por 20 a 30 min. usando un horno o en bano de Maria. Posteriormente, se procedio a centrifugacion por 2 a 3 min. a 15000 rpm. Finalmente, se tomo el sobrenadante que contenia el ADN genomico y se transfirio a un nuevo tubo Eppendorf. El ADN concentrado se preservo a -20[grado]C hasta su uso (6,17).

Tecnica de espoligotipaje: Fue realizada de acuerdo al protocolo internacional estandarizado (5). Las secuencias espaciadoras contenidas en el locus repetido directo se detectaron por hibridacion en membranas comerciales o preparadas en el laboratorio (5). Los ADN de M. tuberculosis H37Rv y de M. bovis BCG fueron utilizados como controles positivos. El patron de hibridacion de las 43 secuencias espadadoras fue transcrito del film a un formato Excel. Posteriormente, los espoligotipos obtenidos fueron comparados con la base de datos internacional SITVITWEB. Finalmente, los aislados fueron asignados en linajes y familias de acuerdo a las bases de datos internacionales (18).

Tecnica MIRU-VNTR: Los 24 loci fueron amplificados usando multiplex PCR con los cebadores y las especificaciones del protocolo estandarizado por Supply y col. (10). Los productos de la amplificacion fueron analizados por electroforesis capilar en un secuenciador ABI 3130xl (Applied Biosystems), utilizando un marcador de peso molecular de 1000 bp marcado con el fluoroforo ROX (Bioventures). El tamano de los amplicones y el numero de repetidos se determino con el programa Gene Mapper (PE Applied Biosystems).

Analisis de diversidad alelica y discriminacion: La diversidad alelica (h) de cada locus MIRUVNTR se calculo de acuerdo a lo publicado por Sola y col., 2003 (19). Los perfiles geneticos de MIRU-VNTR y espoligotipaje, se analizaron con el programa MIRU-VNTR plus (20), disponible en la pagina web: http://www.miru-vntrplus.org/MIRU/index. faces. Los dendogramas se construyeron utilizando la opcion "categorical" y unweighted pair group method (UPGMA). La discriminacion de las tecnicas se evaluo con la formula de tasa de agrupamiento (c) (21).

RESULTADOS

Evaluacion del metodo MIRU-VNTR 24 loci en la designacion de aislados en su linaje correspondiente.

El analisis del dendograma arrojo una amplia diversidad genetica entre los 469 aislados. En ese sentido, se encontraron 276 patrones diferentes, que para efectos del presente trabajo seran denominados "mirutipos", que incluian 230 mirutipos unicos, no asociados a clusters y 46 mirutipos que agruparon 239 aislados. El tamano de los clusters oscilaba desde 2 hasta 53 cepas.

Los resultados fueron analizados por el programa MIRU-VNTRplus, que clasificaron 240 mirutipos (86,9%) en el linaje LAM, 28 (10,1%) linaje Haarlem, 2 (0,72%) linaje X, 3 (1,09%) linaje S, 1 al Beijing (0,4%) y 2 al Uganda/T (0,4%) (Fig. 1 primera y segunda partes). Posteriormente, la comparacion entre el linaje asignado por MIRU-VNTR 24 loci con la designacion por el metodo de espoligotipaje demostro que el 91,3% de los patrones identificados presentaron concordancia entre los dos metodos. En ese sentido, se observo que hubo una excelente analogia entre los mirutipos y espoligotipos para los linajes LAM, Haarlem, S, X y Beijing. Sin embargo, no se observo correspondencia con el linaje T, ya que los mirutipos presentaron relacion con otros tipos de linajes como Haarlem y LAM.

Analisis de la diversidad alelica:

Los resultados obtenidos sugieren que existen diferencias entre la capacidad discriminatoria de los diferentes loci MIRU-VNTR en las cepas analizadas. La diversidad alelica mas alta fue encontrada en el locus 4052 (QUB 26), seguido de los loci 2163b (QUB 11b), 2996 (MIRU26) y 424 (Mtub04). De acuerdo con los valores de discriminacion (h), se observo que estos cuatro loci fueron altamente discriminatorios en ambos grupos de cepas analizados. En los dos grupos, fue posible observar que los loci 154 (MIRU02), 577 (ETRC), 802 (MIRU40), 1644 (MIRU 16), 2461 (ETRB), 3171 (Mtub34) y 3192 (MIRU 31) resultaron ser moderadamente discriminatorios, mientras los loci 580 (MIRU04), 2059 (MIRU20), 2347 (Mtub29), 2687 (MIRU24) y 3007 (MIRU27) mostraron ser poco discriminatorios, y el locus 2687 (MIRU24) presento una diversidad alelica nula. Adicionalmente, se encontraron diferencias en la diversidad alelica entre el grupo de 104 aislados y el grupo de cepas LAM y el ST 605. En ese sentido, mientras los loci MIRU-VNTR 2531 (MIRU23), 3690 (Mtub39), 1955 (Mtub21), 2165 (ETRA), 2401 (Mtub30), 960 (MIRU10), presentaron moderada discriminacion en los 104 aislados de diferentes linajes, en el grupo de 431 aislados LAM y del ST 605 que representan la mayoria de los genotipos en Venezuela, se encontro poca discriminacion (Tabla II).

Analisis de las tasas de agrupamiento, discriminacion y comparacion con la tecnica de espoligotipaje:

Los resultados mostraron que MIRU-VNTR con 24 loci es mas discriminatorio que la tecnica de espoligotipaje en ambos grupos (Tabla III), detectando un mayor numero de patrones geneticos diferentes. Por otra parte, MIRU-VNTR 24 loci, espoligotipaje y la combinacion MIRU VNTR 24 loci y espoligotipaje, mostraron mayor discriminacion en el grupo de 104 aislados que en el grupo de 431 cepas LAM y ST 605, segun los valores de la tasa de agrupamiento, el porcentaje de aislados no agrupados y el porcentaje de aislados agrupados. Finalmente, fue posible evidenciar que la combinacion de MIRU-VNTR 24 loci con espoligotipaje incremento ligeramente la diferenciacion genetica, evidenciandose una disminucion en la tasa de agrupamiento, y un aumento en el numero de genotipos distintos detectados en los dos grupos de cepas estudiadas.

Evaluacion de diferentes combinaciones de loci MIRU-VNTR

La evaluacion de las combinaciones de diferentes loci MIRU-VNTR se realizo con la finalidad de encontrar un numero reducido de loci que generara una discriminacion aproximada a la de 24 y 15 loci en los aislados de M. tuberculosis venezolanos. Para el analisis se incluyo la combinacion de 12 loci tradicionales (12t), los cuatro loci que mostraron la mas alta diversidad alelica en la presente investigacion, y una combinacion de 12 loci que fueron denominados 12inv, que incluyeron los 4 loci con mas alta diversidad alelica y 8 loci que poseian una discriminacion moderada en el grupo de 431 aislados del presente estudio. Los resultados revelaron que la tecnica presenta una excelente resolucion para las combinaciones de 15, 12inv y 4 loci. De ellas, las combinaciones de 15 y 12inv permitieron diferenciar un mayor numero de genotipos con respecto a la combinacion de 4 loci. Todas las combinaciones de loci MIRU-VNTR, incluyendo solo los 4 loci con la mas alta diversidad alelica, mostraron ser mas discriminatorios que la combinacion 12t. Por otra parte, fUe posible observar que el acoplamiento de espoligotipaje con cada combinacion incremento la resolucion. Se observaron pequenas diferencias en la discriminacion genetica generada entre la combinacion de 12inv y 15 loci para los 104 aislados. Las tasas de agrupamiento obtenidas para 15 loci fueron de 21% para MIRUVNTR y de 15% para MIRU-VNTR acoplado a espoligotipaje, mientras que para 12inv fue de 23% para MIRU-VNTR y de 17% para MIRU-VNTR combinado con espoligotipaje. En el caso de los 431 aislados, se observaron valores similares en las tasas de agrupamiento para 12inv y 15 loci, siendo de 52% para MIRU y de 46% para MIRU VNTR acoplado a espoligotipaje. Relacionado al numero de patrones geneticos diferentes, no se observo diferencia para 12inv y 15 loci en la aplicacion de MIRU-VNTR acoplado a espoligotipaje en el grupo de 104 aislados, con valores de 88 patrones diferentes. De igual manera, no se obtuvo diferencia en el grupo de 431 aislados cuando se evaluaron con MIRU-VNTR, donde se encontraron 207 genotipos diferentes. Ligeras diferencias fueron halladas en los 431 aislados cuando se combino MIRU-VNTR y espoligotipaje, con valores de 230 genotipos diferentes para 12inv y 232 para 15 loci. Los valores de las tasas de agrupamiento y patrones diferentes de 24 loci MIRU-VNTR presentaron marcadas diferencias en las 431 cepas y en las 104 aislados cuando se compararon con 12inv y 15 loci. (Figs. 2A y 2B).

DISCUSION

Para un metodo de epidemiologia molecular, el hecho de asignar genotipos en el linaje correspondiente es importante, dado que sugiere que la tecnica puede ser aplicada a estudios de evolucion y analisis filogeograficos. Los resultados demostraron una excelente consistencia en la clasificacion por linajes empleando el metodo MIRU-VNTR 24 loci comparado con espoligotipaje. Hallazgos similares han sido reportados previamente y han sugerido que la asignacion de linajes por MIRU-VNTR 24 loci posee correspondencia con espoligotipaje, Polimorfismo Nucleotido Sinonimo (PNS) y Largas Secuencia de Polimorfismo (LSP) (20, 22, 23). Con respecto a los miembros del linaje T, no se encontro buena concordancia, lo cual tambien ha sido reportado con anterioridad (20). Estudios previos con marcadores geneticos como PNS sugieren que los miembros del linaje T constituyen cepas geneticamente heterogeneas, y pueden encontrarse asociados a diferentes grupos geneticos, entre ellos, el linaje LAM y Haarlem (24).

El analisis de la diversidad alelica revelo que los loci 4052 (QUB26), 2163b (QUB11b), 2996 (MIRU26), 424 (Mtub04) son los mas polimorficos, lo que podria indicar que evolucionen de manera mas rapida entre los linajes de M. tuberculosis incluidos en el presente estudio. Resultados similares fueron publicados previamente (10). Sin embargo, se encontraron diferencias en el polimorfismo del resto de los loci MIRU-VNTR con respecto a otras publicaciones (10, 22). En la presente investigacion se observo que los loci 2347 (Mtub29), 4348 (MIRU39) y 580 (MIRU04), son poco discriminatorios, contrario a los estudios de Supply y col.(17) y Valcheva y col.(25), quienes demostraron que son moderadamente discriminatorios. Otras diferencias fueron observadas cuando se obtuvo moderada discriminacion en los loci 154 (MIRU02), 2461 (ETRB), 3192 (MIRU31) y 3171 (Mtub34), diferente a las observaciones halladas por los estudios anteriormente citados, donde encontraron que cada uno de ellos generaba poca discriminacion. Los loci 802 (MIRU40), 577 (ETRC), 2531 (MIRU23), 3690 (Mtub39), 1955 (Mtub21), 2165 (ETRA), 2401 (Mtub30) y 960 (MIRU10), han sido reportados como altamente discriminatorios (7, 17, 22, 26), sin embargo, los resultados del presente estudio indican que poseen una discriminacion moderada.

En ese sentido, es posible inferir que las discrepancias encontradas podrian estar relacionadas al origen geografico del aislado, al genotipo circulante en un area geografica especifica, y la variabilidad existente entre los diferentes grupos geneticos. En el estudio de Valcheva y col. (25) realizado en Bulgaria, la mayoria de los aislados pertenecian al Linaje S. En el caso de la investigacion de Supply y col. (10), estudiaron una poblacion de 824 aislados de diferentes regiones geograficas y representantes de los principales linajes en el mundo, lo que explicaria el alto grado de polimorfismo encontrado en su investigacion. En el presente estudio, se hallaron diferencias en la diversidad alelica entre el grupo de las 104 cepas analizadas y el grupo de 431 aislados en los loci MIRU-VNTR 2531 (MIRU23), 3690 (Mtub39), 1955 (Mtub21), 2165 (ETRA), 2401 (Mtub30), 960 (MIRU10). Los resultados podrian estar relacionados a la diversidad genetica del grupo de los 104 aislados, quienes estaban representados por varios linajes, mientras que, el grupo de 431 aislados clinicos pertenecian principalmente al linaje LAM predominante en el pais y al ST 605 o cepa Carabobo, unico en Venezuela (16).

La presencia de genotipos unicos aislados en regiones geograficas especificas de Venezuela, como el caso de los STs 1691, 1696, 1698, 1702 y la cepa Carabobo, asi como el predominio de los STs 17, 93, 42 y 53 previamente descritos (16), indujo a evaluar la discriminacion de espoligotipaje, MIRU-VNTR 24 loci y la combinacion de ambos en un grupo de aislados con diversidad genetica y otro grupo que representara una distribucion de genotipos similar a los descritos en Venezuela. En ese orden de ideas, la tecnica de espoligotipaje mostro ser menos discriminatoria con respecto a MIRU-VNTR 24 loci como ha sido descrito anteriormente (3, 10, 24, 27), y cuando espoligotipaje fue acoplado a MIRU-VNTR 24 loci, en el grupo de 104 aislados con diversidad genetica, la deteccion en el numero de clusters apenas se incremento ligeramente, como ha sido demostrado en investigaciones previas (9, 10, 27-29). Sin embargo, cuando la combinacion de ambas tecnicas fue utilizado en el analisis de 431 cepas, el numero de patrones diferentes mejoro considerablemente, debido principalmente a la subdivision por espoligotipaje en ciertos clusters definidos por MIRU-VNTR 24 loci. Se pudo constatar, que espoligotipaje subdividio unicamente 2 clusters de MIRU-VNTR 24 loci. Las cepas de los ST1698 y ST 605 conformaron un cluster por MIRU-VNTR 24 loci, pero el uso adicional de la tecnica de espoligotipaje las subdividio, ya que la cepa 1698 posee un espaciador adicional en la posicion 15. Un caso similar se presento con otro cluster, conformado por aislados del ST1696 y ST93, identicas por MIRU-VNTR 24 loci, donde la subdivision generada por espoligotipaje se debio a la diferencia en 3 secuencias espaciadoras adicionales (posiciones 4,5 y 6) en los aislados del ST1696.

Con base a este hallazgo, inicialmente fue posible sugerir la aplicacion de la combinacion de MIRU-VNTR 24 loci y espoligotipaje en estudios epidemiologicos en Venezuela, con el fin de lograr un mayor grado de diferenciacion y asi definir con mayor certeza posibles brotes y transmision de la TB. Ademas, el presente estudio demostro que la combinacion de 15 loci detecto menos genotipos que el formato de 24 loci, como ha sido reportado previamente (27, 28). Sin embargo, todas las combinaciones de loci MIRU-VNTR ensayadas, incluyendo los 4 loci mas discriminativos, resultaron ser mas discriminatorios que la combinacion 12t, como fue demostrado en un estudio previo (10). Este resultado permitio proponer una nueva combinacion de 12 loci MIRU-VNTR (12inv) para los genotipos circulantes en el pais, basado en los 4 loci con mas alta diversidad alelica, acoplados con otros 8 loci moderadamente discriminativos, que juntos proporcionaron una discriminacion similar a los 15 loci MIRU-VNTR propuestos por Supply y col., en el 2006 (10) y superior al formato 12t propuesto en el ano 2001 (8). Por otra parte, la adicion de espoligotipaje a cada combinacion MIRU-VNTR mejoro la diferenciacion genetica.

Estos ultimos resultados, sugieren que la combinacion 12inv acoplado a espoligotipaje, pudiese ser utilizado para la deteccion de brotes y transmision, ya que los valores obtenidos para la diferenciacion de patrones geneticos y tasas de agrupamiento son proximos a los obtenidos para el formato de 15 loci acoplado a espoligotipaje. Investigaciones previas, han propuesto el uso de un reducido numero de loci MIRU-VNTR, para discriminar genotipos particulares segun la region geografica del aislado, como lo son el caso de Shamputa y col., en Korea (29), y Zhou y col., en China (30), aplicados todos al genotipo Beijing que circula principalmente en el continente Asiatico. Recientemente, Asante-Poku y col. (31), propusieron el uso de un total de 8 loci MIRU-VNTR con la suficiente discriminacion para los estudios de EM de los linajes 4 y 5 de M. africanum en Ghana.

Finalmente, quedo demostrado que el uso de un numero reducido de loci MIRU-VNTR acoplado a espoligotipaje, en este caso 12 inv loci MIRU VNTR, permitira investigar la transmision de la TB, reducir tiempo y costos, y plantea el uso apropiado de las tecnicas de EM para estudios de M. tuberculosis en Venezuela, por lo que adicionalmente, se sugiere que en regiones geograficas con distribucion de genotipos particulares, sean evaluadas las diversidades alelicas para asi optimizar el uso de las combinaciones de loci MIRU-VNTR.

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Philip Supply y Eve Willeri del Instituto Pasteur de Lille-Francia por su invalorable aporte en el entrenamiento de la tecnica MIRU-VNTR 24 loci. Al Centro de Analisis de Secuencias Nacional (Cesaan)-Instituto Venezolano de Investigaciones Cientificas. A los entes financiadores, FONACIT, Programa Alma Mater, CDCH UC, y FONACIT Proyecto G-2005000393.

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Maria Victoria Mendez [1], Cristy Leon [2], Arnelly Escalona [2], Edgar Abadia [2], Omaira Da Mata [3], Jacobus de Waard [3] y Howard Eugene Takiff [2].

[1] Universidad de Carabobo-Sede Aragua, Maracay, Venezuela.

[2] Laboratorio de Genetica Molecular, Instituto Venezolano de Investigaciones Cientificas (IVIC), Caracas, Venezuela.

[3] Instituto de Biomedicina-Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela.

Autor de Correspondencia: Maria Victoria Mendez. Universidad de Carabobo-Sede Aragua. Maracay, Venezuela. Telef. 00584144748241. Correo electronico: mvmendezster@gmail.com.

Leyenda: Fig. 1. Primera Parte. Dendograma basado en la comparacion con la base de datos internacional y 276 patrones de MIRU-VNTR analizados en el presente estudio (cuadros amarillos), usando unweighted pair group method (UPGMA) y el coeficiente categorical

Leyenda: Fig. 1. Segunda Parte. Dendograma basado en la comparacion con la base de datos internacional y 276 patrones de MIRU-VNTR analizados en el presente estudio (cuadros amarillos), usando unweighted pair group method (UPGMA) y el coeficiente categorical

Leyenda: Fig. 2. Discriminacion del Metodo MIRU-VNTR solo o en combinacion con espoligotipaje. (A) Tasas de agrupamiento. En el eje de las y esta el porcentaje de las tasas de agrupamiento. El eje de las X representa las tasas de agrupamiento. Los diamantes ((A)) y cuadrados ((B)) corresponden a los valores obtenidos en 104 cepas de MIRU-VNTR solo y combinado con espoligotipaje respectivamente. Los triangulos ((C)) y las equis (x) representan los valores en 431 aislados para MIRU-VNTR solo y combinado con espoligotipaje respectivamente. (B) Patrones Diferentes. El eje de las y representa el numero de patrones diferentes. El eje de las x representa las diferentes combinaciones de locis MIRU-VNTR como fueron definidos en la tabla anexa. Los diamantes ((A)) y cuadrados ((B)) corresponden a los valores obtenidos en 431 cepas de MIRU-VNTR solo y combinado con espoligotipaje respectivamente. tLos triangulos ((C)) y equis (x) representan los valores en 104 aislados para MIRU-VNTR solo y combinado con espoligotipaje respectivamente
TABLA I
DISTRIBUCION DE 104 CEPAS
CLASIFICADAS POR FAMILIAS Y TIPOS
COMPARTIDOS

FAMILIA        ST     Numero de Cepas Analizadas

LAM2           17                 25
LAM1           20                  4
LAM3           33                  2
S              34                  2
T3             37                  1
LAM9           42                 11
T5             44                  1
HAARLEM 1      47                  2
HAARLEM 3      50                  3
T1             53                  6
T5 MAD2        58                  1
LAM4           60                  1
Haarlemt       62                  1
LAM6           64                  2
T1             86                  1
LAM5           93                 13
LAM3          130                  1
BEIJING        1                   1
T1            167                  1
LAM9          216                  1

T1            522                  1
605           605                  9
LAM5          960                  1
LAM5          1367                 1
LAM2          1691                 3
LAM5          1694                 1
LAM5          1696                 3
LAM5          1702                 3
T1            1905                 1
T1            1926                 1

             TOTAL                104

STs: Tipos compartidos o Shared Types

TABLA II
DIVERSIDAD ALELICA EN 104 AISLADOS DE DIFERENTES LINAJES Y 431
AISLADOS CLINICOS PERTENECIENTES AL LINAJE LAM Y EL ST 605 DE M.
TUBERCULOSIS

LOCUS/ALIAS     DIVERSIDAD ALELICA     DIVERSIDAD ALELICA
                     N = 104         N = 431 (LAM y ST 605)

2687/MIRU24            0.00                   0.00
2347/Mtub29            0.03                   0.06
4348/MIRU39            0.07                   0.04
580/MIRU04             0.08                   0.03
2059/MIRU20            0.08                   0.05
3007/MIRU27            0.12                   0.13
4156/QUB4156           0.28                   0.10
154/MIRU02             0.30                   0.36
577/ETRC               0.35                   0.39
2531/MIRU23            0.36                   0.13
3690/Mtub39            0.35                   0.09
1955/Mtub21            0.36                   0.09
2165/ETRA              0.37                   0.11
2401/Mtub30            0.39                   0.07
2461/ETRB              0.41                   0.45
3192/MIRU31            0.41                   0.45
960/MIRU10             0.47                   0.23
1644/MIRU16            0.52                   0.46
3171/Mtub34            0.53                   0.51
802/MIRU40             0.56                   0.38
424/Mtub04             0.64                   0.63
2996/MIRU26            0.7                    0.69
2163b/QUB11b           0.72                   0.66

4052/QUB26             0.85                   0.77

Altamente discriminatorio: >0.6

Moderadamente discriminatorio 0.3-0.6

Pobremente discriminatorio: <0.3

TABLA III
ANALISIS POR METODO DE TIPIFICACION GENETICA (ESPOLIGOTIPAJE Y
MIRU-VNTR 24 LOCI) EN 104 AISLADOS DE DIFERENTES ESPOLIGOTIPOS Y
431 AISLADOS DE LA FAMILIA LAM Y EL ST605.

Metodo de Tipificacion Genetica (Numero de cepas probadas)

Parametros                 MIRU-VNTR          MIRU-
que evaluan la              24 loci          VNTR 24
Discriminacion               (104)          loci (431)

Tasa de Agrupamiento (c)    18,27 %           43,2 %
Numero de Cluster              8                43
Aislados Agrupados (%)     27 (25,96)       228 (52,9)
Aislados no agrupados      77 (74,04)       203 (47,1)
  en cluster (%)
Patrones Diferentes            85              246

Parametros                 ESPOLIGOTIPAJE    ESPOLIGOTIPAJE
que evaluan la                  (104)             (431)
Discriminacion

Tasa de Agrupamiento (c)       71,15%            95,82 %
Numero de Cluster                14                12
Aislados Agrupados (%)       88 (84,62)        425 (98,6)
Aislados no agrupados        16 (15,38)          6(1.4)
  en cluster (%)
Patrones Diferentes              30                18

Parametros                     Combinacion            Combinacion
que evaluan la             MIRU-VNTR 24 Loci y    MIRU-VNTR 24 loci y
Discriminacion             ESPOLIGOTIPAJE (104)   ESPOLIGOTIPAJE (431)

Tasa de Agrupamiento (c)          14,4 %                 37,4 %
Numero de Cluster                   S                      40
Aislados Agrupados (%)          23 (22,12)             210 (46,6)
Aislados no agrupados           81 (77,8)              250 (53,4)
  en cluster (%)
Patrones Diferentes                 89                    270
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Author:Mendez, Maria Victoria; Leon, Cristy; Escalona, Arnelly; Abadia, Edgar; Da Mata, Omaira; de Waard, J
Publication:Investigacion Clinica
Date:Mar 1, 2016
Words:6057
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