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Evaluacion del perfil de acidos grasos de Isochrysis galbana mediante el uso de metodos acidos y alcalinos de transesterificacion.

Fatty acid profile evaluation of Isochrysis galbana through the use of acid and alkaline transesterification methods

Introduccion

En los ultimos anos, el interes por producir alimentos funcionales ha aumentado en la industria de comestibles. Este termino se introdujo desde los anos 80 en Japon, donde se muestra la capacidad que presentan ciertos alimentos de minimizar la incidencia de enfermedades cronicas a partir de una dieta determinada (Aronson, 2017). Asi, se han descrito mejoras del sistema inmune, sistema endocrino, nervioso, circulatorio y/o digestivo (Arai, 1996; Aronson, 2017). La busqueda de nuevos compuestos bioactivos ha crecido en los ultimos anos por la creciente demanda de interes de los consumidores. En particular, los Acidos Grasos Poliinsaturados (AGPI) son una de las familias definidas como compuestos de interes y/o compuestos bioactivos, que han tomado mas relevancia en el area de alimentos (Molino et al., 2019). Esto debido a que se ha demostrado sus multiples beneficios para la salud humana, como la regulacion de la presion sanguinea, prevencion de trombosis y/o regulacion de la glucosa en pacientes con diabetes (Lemahieu et al., 2015; Shahidi; Ambigaipalan, 2018). Dentro de esta familia de AGPI, se encuentra el Acido Docosahexaeoico (DHA) descrito por sus propiedades bioactivas como por su capacidad de potenciar el desarrollo de la memoria y aprendizaje en ninos, ademas de reducir en personas mayores problemas cardiovasculares (Kuda et al., 2016; Tang; Qin; Wang; Li; Tian, 2011).

La fuente tradicional de DHA es el aceite de pescado, pero puede ser insuficiente para la produccion alimentaria que demanda el mercado (Sprague; Dick; Tocher, 2016; Tang et al., 2011). Es por esto, que se han buscado otras fuentes alternativas como lo son las microalgas, descritas entre otras, por llegar a contener intracelularmente entre un 20 a un 50 % de su peso seco de lipidos. Incluso, bajo condiciones de estres pueden llegar a alcanzar hasta el 85 % de produccion de estos mismos (Chisti, 2007; Santos-Sanchez et al., 2016). Se describe en algunas especies que entre el 37 al 45 % de su peso puede ser contenido exclusivo de DHA (Santos-Sanchez et al., 2016). De esta manera, las microalgas en los ultimos anos han sido motivo de estudio por sus propiedades bioactivas y sus potenciales aplicaciones biotecnologicas (Mendes, Reis, Vasconcelos; Guerra; da Silva, 2009). La especie microalgas Isochrysis galbana, se conoce por poseer diversas propiedades positivas para la salud humana (Kim; Kang; Kwon; Chung; Pan, 2012), ademas de ser una especie utilizada ampliamente como alimento en acuicultura, precisamente por su potencial antioxidante (Mishra; Mishra, 2018). Recientes estudios demuestran el posible uso de I. galbana como fuente de varias biomoleculas importantes, como polisacaridos, acidos grasos, carotenoides, vitaminas, entre otros, que mejoran el valor nutricional, no solo en los piensos usados en acuicultura, sino destinados al consumo humano (Guedes; Amaro; Malcata, 2011; Mishra; Mishra, 2018), como por ejemplo en la produccion de DHA (Molina; Sanchez; Garcia; Fernandez; Acien, 1994; Qi et al., 2002). Particularmente, para poder realizar la extraccion y cuantificacion de los Acidos Grasos (AG) se lleva a cabo una reaccion de transesterificacion de los mismos. Este procedimiento es muy especifico y costoso, especialmente en aquellos destinados para la produccion de biodiesel, la transesterificacion es el proceso mas importante (Chen; Lee, 2018). En la Figura 1 se observa el diagrama general donde se utilizan solventes organicos (alcoholes) y catalizadores tanto acidos como basicos, que mejoran la extraccion de los AG desde la biomasa (aceites) (Fukuda; Kondo; Noda, 2001; Sung; Han, 2016). Finalmente, se producen los llamados Acidos Grasos Metilados AGM pudiendo ser cuantificados por cromatografia de gases (Sung; Han, 2016), mas un residuo que es glicerol como coproducto. En el caso de la transesterificacion acida, los reactivos mayormente descritos son el acido sulfurico, fosforico y clorhidrico, los cuales describen una catalisis mas lenta, pero mas conveniente para los gliceroles que presentan AG libres y con mayor contenido acuoso (Chen; Lee, 2018; Fukuda et al., 2001; Silitonga; Masjuki; Ong; Mahlia; Kusumo, 2017). Sin embargo, en la transesterificacion basica se utilizan comunmente carbonatos, hidroxidos de sodio y potasio, donde la catalisis puede llegar a ser hasta 4000 veces mas rapida que la acida, aunque los gliceroles y alcoholes deben ser anhidros, para evitar la saponificacion y reducir la eficiencia de la transesterificacion (Fukuda et al., 2001; Gonzalez; Gallego, 2011).

Por otro lado, la transesterificacion puede clasificarse como directa o indirecta (Figura 2), donde la principal diferencia se presenta en que la primera trabaja con la biomasa directamente (bien humeda o seca), y la segunda desde una extraccion lipidica de la biomasa (Gonzalez; Gallego, 2011; Silitonga et al, 2017).

De este modo, el trabajo presento una comparativa de los diversos perfiles de acidos grasos resultantes desde I. galbana a partir de una seleccion de 8 metodos de transesterificacion descritos en materiales y metodos. Esta experiencia se llevo a cabo en dos grupos que se engloban como metodos directos e indirectos llamados MTD y MTI, respectivamente, y a su vez con cuatro tipos de catalizadores agrupados como acidos y alcalinos (AC1--AC2 y AL1--AL2, respectivamente) para asi poder determinar la influencia en el perfil de acidos grasos y particularmente en el porcentaje obtenido de DHA, segun la metodologia usada de I. galbana.

Materiales y Metodos

Material y reactivos de estudio

La biomasa utilizada en este estudio fue la microalga Isochrysis galbana, obtenida desde la coleccion de microalgas del Laboratorio de Microalgas y Compuestos Bioactivos (Universidad de Antofagasta, Chile). En todos los casos, la microalga fue cosechada en su fase exponencial de crecimiento y liofilizada en un sistema de congelado en seco (Labconco Freezone 2.5L Benchtop Freeze Dry System, USA). Los reactivos usados para todos los ensayos fueron de calidad cromatografica. Finalmente, el patron externo usado en el equipo de cromatografia de gases GC--FID (Shimadzu 2010, Japon) fue AGM Mix C4-C24 estandar de SUPELCO y el patron interno C15:0 (TAG, tripentadecanoico >99 %, NU-CHEK PRE, INC), usando una concentracion por muestra de 10 ppm.

Extraccion y cuantificacion de lipidos totales

La extraccion de lipidos totales se realizo a partir de aproximadamente 20 mg de biomasa liofilizada de I. galbana, de acuerdo al metodo de extraccion cloroformo: metanol (2:1, v/v) modificado por Axelsson y Gentili (2014), con agitacion continua. La cuantificacion de los lipidos totales se realizo gravimetricamente mediante la siguiente formula 1:

L (%) = [(P2-P1)/(Biomasa)] x100 (1)

Donde L es el porcentaje de lipidos totales, P2 es el peso en gramos del vial mas el residuo de lipidos obtenidos desde la extraccion de biomasa liofilizada de I. galbana por el metodo descrito anteriormente, P1 es el peso en gramos del vial seco sin muestra y Biomasa es la biomasa liofilizada utilizada en gramos de I. galbana, por cada extraccion. Posteriormente, desde el residuo obtenido de lipidos se conservaron bajo atmosferica rica en [N.sub.2] y bajo oscuridad para continuar con el proceso de extraccion de acidos grasos denominado transesterificacion indirecta.

Extraccion de acidos grasos

La extraccion de acidos grasos se llevo a cabo desde la biomasa liofilizada de I. galbana, (Transesterificacion Directa, MTD) o desde la fraccion de lipidos explicada en el apartado anterior (Transesterificacion Indirecta, MTI). Ademas, en ambos casos se hizo una comparativa utilizando un catalizador acido o alcalino/basico (AC y AL, respectivamente), presentandose los diversos metodos resumidos en la Figura 3 junto con sus referencias. En todos los casos, los AGM fueron recuperados en n-hexano para proceder con el analisis de los mismos por cromatografia de gases--GC-FID.

Cuantificacion de acidos grasos por cromatografia gaseosa--GC-FID

Cuantificacion de AGMs: El cromatografo de gas (GC Shimadzu 2010, Japon) equipado con un Detector de Ionizacion de Llama (DIL) y con un inyector "split/splitless", fue usado para analizar la composicion de AGMs. En todos los casos, las muestras fueron inyectadas en una columna capilar RESTEK (30 m, 0,32 mm i.d., 0,25 [micro]m espesor). La temperatura del inyector se mantuvo a 250[grados]C en modo split, con una relacion de 4.5:1 y el gas portador fue nitrogeno a un flujo constante de 11,25 mL x [min.sup.-1]. La temperatura del horno fue de 80[grados]C por 5 min, posteriormente se incremento a 165[grados]C a 4[grados]C x [min.sup.-1] por 2 min, se continuo incrementando a 180[grados]C a 2[grados]C x [min.sup.-1] por 5 min. Se calento con un gradiente de 2[grados]C^min-1 a 200[grados]C por 2 min. Luego, nuevamente se calento con una velocidad de 4[grados]C x [min.sup.-1] a 230[grados]C por 2 min y finalmente esa temperatura se mantuvo por 2 min, alcanzando 250[grados]C a 2[grados]C x [min.sup.-1], mientras que la temperatura del detector fue de 280[grados]C. De forma individual, los AGMs fueron identificados mediante la comparacion de su tiempo de retencion con la mezcla del AGM estandar (AGM Mix C4-C24, Supelco Analytical) y fueron cuantificados, de acuerdo a la comparacion del area arrojada debajo de los picos del mix establecido mediante el software LabSolutions version 5 compatible con Windows.

Eficiencia de la transesterificacion: para conocer la eficiencia en la reaccion de transesterificacion de cada uno de los metodos utilizados, se anadio desde el comienzo de la reaccion una cantidad de patron interno de 100 ppm por muestra (Tripentadecanoico >99%, NU-CHEK PRE, INC), donde se calculo la eficiencia de la transesterificacion mediante la siguiente formula 2:

[??]TR,(%) = (IS2/(IS1)x100 (2)

Donde qTR es la eficiencia de la transesterificacion en porcentaje, IS2 es la concentracion del patron interno calculada en cromatografo de gases (GC-FID) y IS1 es la concentracion real anadida por muestra del patron interno (~100 ppm).

Analisis estadistico

Todas las muestras se realizaron por triplicado y, ademas, en el caso de patron interno para calculos de eficiencia de la transesterificacion se anadio una muestra mas sin biomasa, tan solo con el patron. Los criterios de aceptacion de cada uno de los parametros de validacion se calcularon mediante el software STATGRAPHICS Centurion XVI, version 16.1.18.

Resultados y Discusion

El perfil de acidos grasos mayoritarios presentes en I. galbana se muestran en la Tabla 1, segun el metodo de transesterificacion acida y alcalina utilizado. Se observa que, entre metodos de extraccion directos e indirectos, estos ultimos logran extraer un perfil mas variado de AG. La extraccion de lipidos fue llevada a cabo con la mezcla de solventes descritas anteriormente, cloroformo:metanol, 2:1 (v/v) (Axelsson; Gentili, 2014), la cual fue demostrada en varios estudios como la mezcla de solventes mas eficientes en la extraccion de lipidos (D'Oca et al., 2011; Sheng; Vannela; Rittmann, 2011). Por otro lado, se puede constatar que, entre las catalisis acida y alcalina, esta ultima fue la mas efectiva en la obtencion de AGPI, pero no de Acidos Grasos Monoinsaturados (AGMI), los cuales tienen un alto interes para la fabricacion de alimentos funcionales (Xu; Qian, 2014). Cabe destacar que, ambas catalisis presentan como mas abundantes el acido palmitico (C16:0), palmitoleico (C16:1), oleico (C18:1), y acido linolenico (C18:3). Segun Velasquez et al., (2012), un AG exclusivo de la catalisis alcalina es el acido linolenico (C18:3), y para la catalisis acida el acido miristico (C14:0) y acido miristoleico (C14:1), los cuales tambien fueron observados en el perfil de I. galbana.

Respecto a la abundancia obtenida de DHA, en la Tabla 1 se muestra que una mayor cantidad obtenida fue a traves del metodo MTI-AL2 (12,32 %) seguido por MTI-AC1 (2,20 %), lo que reafirma lo descrito anteriormente donde la fase lipidica que involucra la extraccion indirecta potenciaria la obtencion de DHA a partir de la microalga, para asi generar alimentos funcionales con multiples beneficios para la salud humana (Kim et al., 2012).

En la Figura 4 se observa el contenido de AGMs obtenido a partir de la microalga I. galbana, de acuerdo al metodo de transesterificacion utilizado respecto a biomasa y a la cuantificacion de lipidos. El metodo MTD-AL1 fue el que mayor contenido de AGM respecto a biomasa y lipidos arrojo 59,60 y 124,15 mg/g, respectivamente, lo que permite establecer que la fase lipidica realizada en la extraccion indirecta, no tiene mayor influencia en el contenido obtenido como AGM total. Estos resultados demuestran que al ser la extraccion directa la mas efectiva para extraer mayor cantidad de AG desde la microalga, el proceso es mas rapido y economico en cuanto a la utilizacion de solventes. Sin embargo, de acuerdo a lo descrito por Fukuda et al, (2001); Santos-Sanchez et al, (2016), la transesterificacion alcalina es mas rapida que la acida. Sin embargo, los metodos MTD-AL2 y MTI-AL2 fueron los que menos concentraciones de AGM alcanzaron, aunque la proporcion de DHA fue del 12 % en el caso de MTI-AL2. Aunque fue el caso con mayor abundancia de todos no implico el hecho de que fuera el que mayor cantidad obtuviera, puesto que hubo un 0,28 % de AGM respecto a biomasa seca. De esta manera, el metodo MTD-AL1 fue no solo el que mejor resultado obtuvo de AGM, sino tambien el mejor con respecto a la abundancia relativa de DHA, siendo inferior a lo descrito por Santos-Sanchez et al. (2016), llegando a alcanzar 5,9 % de DHA.

La Figura 5 presenta la eficacia de cada metodo de transesterificacion calculado a partir del patron interno anadido desde el comienzo de la reaccion.

El metodo MTD-AL1 presento la mayor eficacia con un 93,03 % seguido por MTI-AC1 con un 87,61 %. Sin embargo, el metodo MTI-AC2 fue uno de los mas bajos (~21 %), siendo el que en la Figura 4 se presenta con un contenido promedio de AGM respecto a biomasa (35,33 mg/g), esto, de acuerdo a otros autores, podria haber ocurrido porque en si la catalisis acida es lenta, y podrian haberse degradado una cantidad de acidos grasos presentes en la biomasa (Fukuda et al., 2001). Por ultimo, los metodos MTI-AL2 y MTD-AL2 son los que menos eficiencia tuvieron (~1,0-7,0 %), coincidiendo con que fueron los que menores concentraciones de AGM respecto a biomasa y lipidos presentaron (Figura 4). Estos resultados coinciden en parte con lo descrito por Chen y Lee (2018), en el estudio de optimizacion de transesterificacion de acidos grasos de la microalga Monoraphidium sp como metodos directos. El trabajo concluye con una mejora del rendimiento de AGM, usando transesterificacion acida en vez de alcalina tanto desde la biomasa humeda como seca. Ademas, propone una transesterificacion continua de catalizadores, acidos y basicos dando lugar a mejores resultados una combinacion de ambas, lo cual podria ser planteado para proximas investigaciones. Similares resultados se observaron en el trabajo desarrollado por Chamola, Khan, Raj, Verma y Jain (2019), a partir de un diseno Box Behnken (Narula; Thakur; Uniyal; Kalra; Jain, 2017), cuyos factores fueron el porcentaje de metanol, de catalizador (acido o alcalino) y la concentracion de los mismos. Su estudio refleja una mejora en el rendimiento de AGM bajo catalisis acida, la cual presenta datos muy seguidos con la alcalina (89,5 y 87,4 % de rendimiento de AGM, respectivamente). Aunque nuestro estudio destaca MTD-AL1 (catalizador alcalino 2,5M NaOH), es el unico caso, pues de forma general tanto en metodos directos como indirectos resultaron mas eficientes las reacciones con catalizadores acidos ([H.sub.2]S[O.sub.4]) y en mayor porcentaje (10 % v/v).

Conclusiones

Entre los ocho metodos de extraccion utilizados, el mas eficiente para la extraccion de DHA fue MTI-AL2 con mas del 12 % en abundancia relativa de DHA. Sin embargo, debido al poco contenido de acidos grasos la productividad de DHA no es consistente. Por otro lado, MTD-AL1 fue el proceso con el perfil mas rico en mono y poliinsaturado (43,97 % y 16,4 %, respectivamente, ademas de contener mayor contenido de AGM respecto biomasa del ~6 %, lo que implica aproximadamente el 12,4 % del contenido de lipidos de I. galbana. Si realizamos una comparacion entre los metodos de extraccion directos e indirectos, los metodos directos lograron extraer mayor cantidad de DHA que los indirectos, por lo que el proceso de extraccion se realizo de forma mas rapida, lo que impide que algun AG se degrade. Finalmente, se observo en todos los casos que la microalga I. galbana es una microalga marina con un perfil rico en acidos grasos utiles en aplicaciones alimentarias, ademas de contener DHA, importante ingrediente funcional, lo que hace I. galbana puede ser una potencial candidata como fuente natural de compuestos bioactivos.

doi: https://doi.org/10.23850/22565035.1574

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Elena Medina-Perez (1)

Maria Ruiz-Dominguez (2)

Juan Morales-Espinoza (3)

Pedro Cerezal-Mezquita (4)

(1) Universidad de Antofagasta (Chile); correo: e-b-medina@hotmail.com: ORCID: http://orcid.org/0000-0003-3289-0522

(2) Universidad de Antofagasta (Chile); correo: maria.ruiz@uantof.cl; ORCID: http://orcid.org/0000-0001-6520-7940

(3) Universidad de Antofagasta (Chile); correo: iuan.morales@uantof.cl

(4) Universidad de Antofagasta (Chile); correo: pedro.cerezal@uantof.cl: ORCID: http://orcid.org/0000-0003-0822-0844

Recibido: 01-07-2018 Aceptado: 12-03-2019

Leyenda: Figura 1. Reaccion del proceso de Transesterificacion Fuente: elaboracion propia

Leyenda: Figura 2. Comparacion de los metodos de extraccion de acidos grasos directo e indirecto llevados a cabo desde la microalga I. galbana. (1) glicerol y agua Fuente: elaboracion propia

Leyenda: Figura 3. Resumen de los metodos utilizados para la transesterificacion de AG a partir de biomasa liofilizada de Isochrysisgalbana Metodos de Transesterificacion Directos (MTD): MTD- AC1 (catalizador 10% [H.sub.2]S[O.sub.4] : MeOH* (v/v), (Lamers et al., 2010)), MTD-AC2 (catalizador 1 % [H.sub.2]S[O.sub.4] : MeOH (v/v) (Rahman; Aziz; Al-khulaidi; Sakib; Islam, 2017)), MTD-AL1 (catalizador 2,5 M NaOH en MeOH, (Sung; Han, 2016)) y MTD-AL2 (1 % KjCO3 : MeOH (p/v) (Velasquez-Orta; Lee; Harvey, 2012)). Metodos de Transesterificacion Indirectos (MTI): MTI- AC1 (catalizador 10 % [H.sub.2]S[O.sub.4] : MeOH (v/v) (Lamers et al., 2010)), MTI-AC2 (catalizador 1 % [H.sub.2]S[O.sub.4] : MeOH (v/v) (Rahman et al., 2017)), MTI-AL1 (catalizador 2,5 M NaOH en MeOH, (Sung; Han, 2016)) y MTI-AL2 (1 % [K.sub.2]C[O.sub.3] : MeOH (p/v) (Velasquez-Orta et al., 2012) *MeOH: metanol.

Fuente: elaboracion propia

Leyenda: Figura 4. Contenido de AGMs respecto a biomasa y lipidos de la microalga I. galbana y abundancia relativa de DHA (%) Fuente: elaboracion propia

Leyenda: Figura 5. Eficacia de los metodos de transesterificacion directos e indirectos Fuente: elaboracion propia
Tabla 1.
Metodos de transesterificacion

                             Metodo Directo (MTD)

Acidos grasos              AC1     AC2     AL1     AL2
  C4:0                     --      --      --     5,37
  C14:0                   20,44   18,73   13,76   2,17
  C16:0                   33,22   35,42   21,99   4,94
  C18:0                    --      --      --      --
[SIGMA] Saturados         53,66   54,15   35,75   12,48
  C14:1                   1,37     --      --      --
  C16:1                   11,25   9,43    9,78    2,15
  C18:1                   33,08   35,13   34,19    --
  C24:1                    --      --      --      --
[SIGMA] Monoinsaturados   45,7    44,56   43,97   2,15
  C18:2                    --      --      --     12,24
  C18:3                    --      --     15,80   40,28
  C20:4                    --      --      --      --
  C20:3                    --      --      --     5,04
  DHA (C22:6)             0,64    1,29    0,60    0,10
I Poliinsaturados         0,64    1,29    16,4    57,66
Otros                      --      --     3,88    27,71

                             Metodo Indirecto (MTI)
Acidos grasos              AC1     AC2     AL1     AL2
  C4:0                    1,27    0,23    1,39    8,43
  C14:0                   20,68   20,51   19,16   19,41
  C16:0                   41,91   38,37   27,45    --
  C18:0                   0,81    2,97     --      --
[SIGMA] Saturados         64,67   62,08    48     27,84
  C14:1                    --      --     2,85     --
  C16:1                    --     9,17    9,61     --
  C18:1                   3,95    25,46   23,40   12,17
  C24:1                    --      --      --     4,25
[SIGMA] Monoinsaturados   3,95    34,63   35,86   16,42
  C18:2                   3,38     --      --      --
  C18:3                   0,97     --     13,99   10,62
  C20:4                    --     0,83     --     10,11
  C20:3                    --     1,35     --      --
  DHA (C22:6)             2,20    1,11    2,15    12,32
[SIGMA] Poliinsaturados   6,55    3,29    16,14   33,05
Otros                     24,82    --      --     22,69

Perfil de acidos grasos mayoritarios presentes en I. galbana, segun
los metodos de transesterificacion usados (% area, n=3, [+ o -]SD no
fue representada en la tabla, pero fue menor a 5 %)

Fuente: elaboracion propia
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Author:Medina-Perez, Elena; Ruiz-Dominguez, Maria; Morales-Espinoza, Juan; Cerezal-Mezquita, Pedro
Publication:Informador Tecnico
Date:Jan 1, 2019
Words:4762
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