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Evaluacion de tres programas de vacunacion contra laringotraqueitis infecciosa aviar usando dos vacunas vectorizadas comerciales en pollos de engorde.

EVALUATION OF THREE AVIAN INFECTIOUS LARYNGOTRACHEITIS VACCINATION PROGRAMMES USING TWO COMMERCIAL VECTORIZED VACCINES IN BROILERS

INTRODUCCION

La laringotraqueitis infecciosa aviar (LTI) es causada por el herpesvirus tipo 1 de las aves que afecta el tracto respiratorio alto. Entre los signos clinicos causados por la enfermedad se incluyen conjuntivitis, descarga nasal, estornudos, ronquera, disnea y depresion; los cuales pueden ser desde muy severos y con alta mortalidad por asfixia debido al exudado fibrino-hemorragico presente en el lumen de la traquea (Sellers et al, 2004), a una forma muy leve, no diferenciable de otras enfermedades respiratorias de pollos, denominada laringotraqueitis infecciosa "silenciosa, vacunal u ojos en forma de almendra" (Ou y Giambrone, 2012). El organo blanco del virus es la traquea (Ou y Giambrone, 2012).

La LTI ha sido reportada en muchos paises, siendo considerada principalmente como endemia en regiones de crianza intensiva, en aves de multiples edades y alojadas en galpones con alta densidad poblacional (Parra et al., 2015). En el Peru fue reportada por primera vez en agosto de 2008 (OIE, 2008). Como consecuencia de ello, se implementaron medidas de control como la inmunizacion mediante el uso de vacunas recombinantes (vectorizadas) (El Peruano, 2008) e inactivadas (OIE, 2009).

En el Peru existen pocos estudios sobre la proteccion conferida por vacunas recombinantes e inactivadas, aplicadas ya sea individualmente o en combinacion, en pollos de engorde. El objetivo de la presente investigacion fue comparar la proteccion conferida por tres programas de vacunacion contra LTI usando vacunas vectorizadas, mediante la evaluacion de la mortalidad, signos clinicos, lesiones macroscopicas e histopatologicas, respuesta serologica y parametros productivos.

MATERIALES Y METODOS

Lugar de Estudio

La crianza, vacunacion y desafio experimental de las aves se llevo a cabo en los modulos de experimentacion del Laboratorio de Patologia Aviar, asi como las necropsias y pruebas serologicas, en tanto que los examenes histopatologicos se hicieron en el Laboratorio de Patologia Veterinaria, ambos pertenecientes a la Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos (FMV-UNMSM), en Lima, Peru. El estudio se realizo entre julio y agosto de 2011.

Aves y Diseno Experimental

Se utilizaron 288 pollos BB machos de un dia de edad, de la linea Ross 308, procedentes de un mismo lote de reproductoras. Los pollos fueron distribuidos al azar en cuatro grupos de 72 aves con tres repeticiones (24 aves por repeticion por grupo).

Los tratamientos, segun las vacunas aplicadas, fueron los siguientes:

--Grupo A: Vacuna recombinante del virus de viruela aviar (DVA), que expresa el gen de la glicoproteina B del virus de LTI, aplicada al 1er dia de edad por via subcutanea.

--Grupo B: Vacuna inactivada emulsionada en aceite mineral, via subcutanea, y la vacuna DVA del grupo A, pero por puncion alar, ambas aplicadas a los 14 dias de edad.

--Grupo C: Vacuna recombinante de herpesvirus de pavo (HVT) asociado a celulas que expresan los genes de las glicoproteinas I y D del virus de LTI, aplicada al 1er dia de edad, via subcutanea.

--Grupo D: Sin vacuna (control).

Las aves, ademas, fueron vacunadas en la planta de incubacion contra la enfermedad de Newcastle (cepa B1) y la bronquitis infecciosa (cepa H120) por via de aspersion y contra la enfermedad de Marek (cepa HVT) via subcutanea. El grupo C no recibio esta ultima vacuna.

Las aves se encontraban bajo un sistema de aislamiento completo (evitando el ingreso de aves ajenas al estudio) y ambiente controlado. Dentro del modulo de crianza, las aves estuvieron separadas de acuerdo a cada repeticion por grupo, haciendo un total de 12 corrales contiguos pero separados por mallas metalicas. La alimentacion fue ad libitum con un concentrado de formula comercial, de acuerdo a la etapa de crianza.

Desafio Viral

Las aves fueron desafiadas a los 35 dias de edad con 0.3 ml de un inoculo que contenia un virus patogeno de ILT aislado de un brote de campo en aves de postura y con un titulo de [10.sup.7] [DIE.sub.50]. El desafio se realizo via intratraqueal (0.2 ml) y via ocular (0.1 ml).

Parametros de Evaluacion

El nivel de proteccion se determino mediante mortalidad, signos clinicos (respiratorios, conjuntivitis y depresion), lesiones macroscopicas e histopatologicas traqueales, respuesta serologica y parametros productivos (peso corporal, indice de conversion alimenticia [ICA] e indice de eficiencia productivo europeo [IEPE]).

La mortalidad se registro diariamente en cada grupo. El examen clinico en cada ave se realizo en forma diaria determinandose el inicio, presentacion, severidad y desarrollo de los signos clinicos posdesafio. Se emplearon cuatro grados de severidad (0-3) en la evaluacion de los signos respiratorios y tres grados para conjuntivitis (0-2) (adaptados de Devlin et al, 2008), en tanto que se emplearon tres grados (0-2) para evaluar la depresion (Devlin et al., 2006).

Las lesiones en traquea se evaluaron a partir del sacrificio de cinco aves por grupo a los 5, 7, 9, 11 y 13 dias del desafio. Las lesiones macroscopicas se evaluaron en base a cinco grados (0-4) (Devlin et al., 2007). Para la evaluacion microscopica, se emplearon seis grados (0-5) (Guy et al, 1990) en muestras de cada una de las traqueas de las aves sacrificadas, que fueron fijadas en formol al 10%.

La respuesta serologica se evaluo a partir de la toma de muestra de sangre a 20 aves de cada grupo antes (35 dias de edad) y 15 dias despues del desafio (50 dias de edad), mediante la puncion de la vena alar. Se determino la respuesta de anticuerpos contra el virus de LTI por la prueba de ELISA indirecta usando un kit comercial (Synbiotics ProFlock[R] LT, San Diego, California, EEUU).

El peso se registro por ave en forma semanal, empleando una balanza digital de 15 kg de capacidad y de 1 g de precision. El ICA se evaluo cada semana posterior al desafio y El IEPE solo se evaluo a los 49 dias de edad (14 dias posdesafio). El ICA fue el resultado del alimento consumido dividido por el peso vivo, en tanto que para el IEPE se uso la siguiente formula: (Viabilidad x Peso vivo (kg) / Edad (dias) * ICA)*100.

Analisis Estadistico

Los signos clinicos y las lesiones macroscopicas e histopatologicas (categorizadas en grados de lesion) se analizaron mediante la prueba de Kruskal Wallis, y para determinar diferencias entre grupos se empleo la prueba de Kruskal Wallis de dos vias. La prueba de Chi cuadrado se utilizo para determinar la asociacion entre tratamientos y grados, cuando las variables (signos clinicos y lesiones macroscopicas e histopatologicas) presentaban hasta 3 grados de severidad (0, 1 y 2). Los resultados fueron analizados con un nivel de confianza del 95%.

La evaluacion del peso corporal, ICA e IEPE se realizo mediante un analisis de varianza, y el analisis pos-estimacion (en funcion de p<0.05), mediante la prueba de comparacion multiple de medias de Bonferroni.

El analisis de los datos se realizo aplicando el paquete estadistico STATA 10.

RESULTADOS

La mortalidad acumulada a los 14 dias del desafio fue de 0, 1.4, 2.8 y 2.8% para los grupos A, B, C y D, respectivamente. Las lesiones observadas en la necropsia de las aves muertas posdesafio no fueron caracteristicas de LTI, siendo compatibles con muerte subita (muerte de aves en buena condicion, con lesiones congestivas en higado, rinones, bazo, y leve edema en pulmones); sin embargo, las aves del grupo D presentaron material caseoso en pleura y pulmones.

Previo al desafio, las aves no mostraron signos clinicos. Luego del desafio, el principal signo clinico fue la ronquera, que se manifesto a partir del dia 2, donde las aves del grupo C mostraron tendencias hacia los signos mas leves y las aves del grupo D (control) mostraron tendencias a presentar el mayor grado promedio. Asimismo, el dia 6 del desafio, el grupo control presento signos respiratorios mas severos que los otros grupos (p<0.05). Por otro lado, no se encontraron diferencias estadisticas entre grupos en relacion a la sintomatologia respiratoria en los dias 4, 8,10, 12 y 14 del desafio (Cuadro 1).

Las aves de los grupos C y D presentaron tendencias a un menor y mayor grado promedio de conjuntivitis, respectivamente (p<0.05), los dias 6 y 8 posdesafio, mientras que no hubo diferencias estadisticas entre grupos los dias 2, 4, 10, 12 y 14 posdesafio (Cuadro 2).

Solo las aves de los grupos C y D mostraron depresion, siendo mas severa en algunas aves del grupo D, aunque sin diferencias estadisticas entre tratamientos. La presencia de lesiones macroscopicas en traquea (hemorragia petequial, sangre y mucosidad) fue estadisticamente similar entre tratamientos.

Los cuatro grupos de aves presentaron lesiones histopatologicas a partir del dia 5 del desafio. Las tendencias en mayor grado de lesiones traqueales se observaron en los grupos B y D en el dia 9 posdesafio y en los grupos A y B en el dia 11 posdesafio; asimismo, la tendencia hacia el menor grado de lesiones ocurrio en el grupo C en el dia 11 posdesafio. Por otro lado, en los dias 5, 7 y 13 posdesafio no se encontraron diferencias estadisticas entre grupos (Cuadro 3). La infiltracion mononuclear fue de forma difusa; sin embargo, en algunas traqueas se presentaron, ademas, algunas zonas a manera de foliculos, que en los casos con grado 2 eran menores que aquellos en casos con grado 3, donde algunos foliculos llegaron a deformar la mucosa traqueal. El grupo C presento menor tamano y cantidad de foliculos linfoides respecto de los otros grupos. No obstante, en ningun momento se hallaron corpusculos de inclusion ni sincitios.

Los promedios geometricos de titulos de anticuerpos previos al desafio fueron de bajo nivel en los cuatro grupos de aves, siendo mas altos en las aves del grupo B. Sin embargo, 15 dias despues del desafio, los grupos A y B presentaron una clara seroconversion con titulos aritmeticos promedio de 2910 y 1960, respectivamente (Cuadro 4).

El comportamiento productivo de las aves en terminos de peso vivo fue estadisticamente similar entre grupos. La ganancia de peso a la semana 7 vario entre 1536 y 1643 g, el ICA vario entre 2.36 y 2.53, y el IEPE vario entre 430.6 y 493.3. Los resultados del IEPE a los 14 dias del desafio para los tratamientos A, B, C y D fueron de 455.93, 471.84, 493.30 y 430.61, respectivamente

DISCUSION

La presentacion de signos respiratorios y conjuntivitis fue inicialmente menor en el grupo C y mayor en el grupo D (Control); no obstante, a partir del dia 10 del desafio los signos clinicos fueron minimos o no detectables en todos los grupos. Asimismo, el grado de conjuntivitis solo vario entre grupos en los dias 6 y 8 posdesafio con tendencias hacia menores grados en el grupo C y hacia mayores en el grupo control (grupo D). Si bien no se hallaron diferencias entre grupos en lesiones traqueales macroscopicas, se debe mencionar que no solo se observo exudado mucoso y hemorragico como respuesta al desafio viral, descrito por Devlin et al. (2007), sino que, ademas, algunas traqueas presentaron hemorragias petequiales con o sin congestion.

Los cuatro grupos presentaron lesiones histopatologicas en traquea de grado muy variable, con tendencias en mayor grado en los grupos B y D en el dia 9 y en los grupos A y B en el dia 11 posdesafio. En el dia 11, el grupo C presento el menor grado de lesiones.

A pesar que en el dia 9 el grupo A presento un grado bajo de lesiones, el nivel se elevo en el dia 11, lo que estaria indicando que la recuperacion en esas aves no fue sostenida. En cambio, el grupo C, que presento un grado bajo de lesiones desde el dia 9, mostro una recuperacion sostenida en el tiempo. Ademas, este grupo presento menor tamano y cantidad de infiltracion mononuclear a manera de foliculos linfoides. Esto indicaria que las lesiones histopatologicas en el grupo C estarian mas relacionadas a la inmunidad protectiva vacunal que aparentemente impidio que la cepa de desafio replicara menos que en los otros grupos vacunales, reflejandose en un menor grado de signos respiratorios y de conjuntivitis. Estudios similares reportaron que existe menor desarrollo de los foliculos secundarios en traqueas con menor estimulo antigenico (Reese et al, 2006) y que menores lesiones histopatologicas traqueales podrian estar asociadas a menores tasas de replicacion del VLTI (Kirkpatrick et al., 2006).

Las lesiones observadas en la necropsia indicarian que las aves del grupo control presentaron complicaciones secundarias por E. coli como consecuencia del dano causa do por el virus de desafio, tal como ha sido senalado por Bagust y Johnson (1995).

Respecto a los resultados serologicos, las aves que recibieron la vacuna recombinante en vector DVA (grupos A y B) mostraron los mas altos titulos de anticuerpos, mientras que las aves control y las aves vacunadas con la vacuna recombinante en vector HVT (grupo C) mostraron una debil o negativa respuesta inmune activa. Estos resultados indican que la vacuna recombinante en vector DVA induce una respuesta de anticuerpos detectable por la prueba de ELISA empleada a diferencia de la vacuna recombinante en vector HVT. Asimismo, Tong et al. (2001) detectaron una respuesta de anticuerpos por la prueba de ELISA en aves vacunadas con una vacuna recombinante DVA/LTI similar a la del presente estudio. Los resultados demuestran tambien una lenta seroconversion en pollos de engorde despues de un reto experimental.

Se ha senalado que una posible razon por la que las vacunas recombinantes de DVA/LTI no inducen muy buena proteccion contra LTI, es la presencia de anticuerpos maternos en pollos muy jovenes que proceden de reproductoras vacunadas contra DVA como parte de su programa de vacunacion habitual (Vagnozzi et al, 2012). Las aves de los grupos A y B del presente estudio fueron vacunadas en el dia 1 (grupo A) y el dia 14 (grupo B) con la vacuna recombinante DVA/ LTI. Estudios similares indican que esta vacuna genera adecuada proteccion en aves reproductoras ligeras, cuando se administra a la semana 10 de edad y el reto ocurre entre la semana 20 y 45 de la vacunacion, pudiendose deducir que la vacuna induce adecuada proteccion cuando se aplica luego que los anticuerpos maternales contra el virus de viruela desaparecen y que el vector de la vacuna recombinante alcanza adecuada proteccion al cabo de varias semanas antes que ocurra el desafio (Higuera et al., 2011).

CONCLUSIONES

* Se obtuvo una mayor proteccion inmune en pollos de engorde contra la laringotraqueitis infecciosa (LTI) frente a un desafio con una cepa patogena (107 [DIE.sub.50]), a traves de la vacuna recombinante HVT/LTI aplicada al primer dia de edad.

* La respuesta productiva fue estadisticamente similar en aves vacunadas contra LTI con una vacuna recombinante en vector DVA o con una vacuna recombinante en vector HVT. Asimismo, estas respuestas fueron similares al grupo de aves control (no vacunadas contra LTI).

* La vacuna recombinante DVA/LTI indujo una respuesta de anticuerpos detectable por la prueba de ELISA, no asi la vacuna recombinante en vector HVT.

http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v26i4.11204

LITERAURA CITADA

1. Bagust TJ, Johnson MA. 1995. Avian infectious laryngotracheitis: virus-host interactions in relation to prospects for eradication. Avian Pathol 24: 373-391. doi: 10.1080/03079459508419079

2. Devlin JM, Browning GF, Hartley CA, Kirkpatrick NC, Mahmoudian A, Noormohammadi AH, Gilkerson JR. 2006. Glycoprotein G is a virulence factor in infectious laryngotracheitis virus. J Gen Virol 87: 2839-2847. doi: 10.1099/ vir.0.82194-0

3. Devlin JM, Browning GF, Hartley CA, Gilkerson JR. 2007. Glycoprotein G deficient infectious laryngotracheitis virus is a candidate attenuated vaccine. Vaccine 25: 3561-3566. doi: 10.1016/ j.vaccine.2007.01.080

4. Devlin JM, Browning GF, Gilkerson JR, Fenton SP, Hartley CA. 2008. Comparison of the safety and protective efficacy of vaccination with glycoprotein G-deficient infectious laryngotracheitis virus delivered via eye-drop, drinking water or aerosol. Avian Pathol 37: 83-88. doi: 10.1080/03079450701802214

5. El Peruano, Diario Oficial. 2008. Ano XXV- No. 10440. Normas legales. Plan para la prevencion, control y erradicacion de la laringotraqueitis infecciosa aviar en el Peru. Articulo 4 de la Resolucion Jefatural 386-2008. [Internet]. Disponible en: http://spij .minjus .gob.pe/ Normas/textos/031208T.pdf

6. Guy JS, Barnes HJ, Morgan LM. 1990. Virulence of infectious laryngotracheitis viruses: comparison of modified-live vaccine viruses and North Carolina field isolates. Avian Dis 34: 106113.

7. Higuera S, Lechuga M, Mercado G. 2011. Estudio para la valoracion de la proteccion generada a diferentes edades con una vacuna vectorizada contra el virus de la laringotraqueitis infecciosa en gallinas criadas en granja y desafiadas en laboratorio. [Internet], [4 setiembre 2013]. Disponible en: http:// www.engormix.com/MA-avicultura/sanidad/articulos/vacuna-vectorizada-t3544/165-p0.htm

8. Kirkpatrick NC, Mahmoudian A, Colson CA, Devlin JM, Noormohammadi AH. 2006. Relationship between mortality, clinical signs and tracheal pathology in infectious laryngotracheitis. Avian Pathol 35: 449453. doi: 10.1080/03079450601028803

9. [OIE] World Organisation for Animal Health. 2008. Avian infectious laryngotracheitis, Peru. [Internet] Available in: http://www.oie.int/wahis_2/ public/wahid. php/Reviewreport/ Review?reportid=7382

10. [OIE] World Organisation for Animal Health. 2009. Avian infectious laryngotracheitis,Peru. [Internet]. Available in: http://www.oie.int/wahis_2/ public/wahid. php/Reviewreport/ Review?page_refer= MapFullEventReport&reportid=8046

11. Ou SC, Giambrone JJ. 2012. Infectious laryngotracheitis virus in chickens. World J Virol 1: 142-149. doi: 10.5501/wjv.v1.i5.142

12. Parra SHS, Nunez LFN, AstolfiFerreira CS, Ferreira JP. 2015. Occurrence of infectious laryngotracheitis virus (ILTV) in 2009-2013 in the State of Sao Paulo-Brazil. Rev Bras Cienc Avicola 17: 117-120. doi: 10.1590/ 1516-635x1701117-120

13. Reese S, Dalamani G, Kaspers B. 2006. The avian lung-associated immune system: a review. Vet Res 37: 311-324. doi: 10.1051/vetres:2006003

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15. Tong GZ, Zhang SJ, Wang L, Qiu HJ, Wang YF, Wang M. 2001. Protection of chickens from infectious laryngotracheitis with a recombinant fowlpox virus expressing glycoprotein B of infectious laryngotracheitis virus. Avian Pathol 30: 143-148. doi: 10.1080/ 03079450120044542

16. Vagnozzi A, Zavala G, Riblet SM, Mundt A, Garcia M. 2012. Protection induced by commercially available live-attenuated and recombinant viral vector vaccines against infectious laryngotracheitis virus in broiler chickens. Avian Pathol 41: 21-31. doi: 10.1080/ 03079457.2011.631983

Silvia Charca P. (1,3), Eliana Icochea D'A. (1,4), Rosa Gonzalez V. (1), Rosa Perales C. (2), Viviana San Martin D. (1), Nelly Cribillero C. (1), Pablo Reyna S. (1)

(1) Laboratorio de Patologia Aviar, (2) Laboratorio de Histologia, Embriologia y Patologia Veterinaria, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima

(3) E-mail: silvia.charca.padilla@gmail.com

(4) E-mail: eliana.icochea@gmail.com

Recibido: 12 de octubre de 2014

Aceptado para publicacion: 11 de junio de 2015
Cuadro 1. Promedio del grado (0-3) de signos respiratorios en pollos
de engorde vacunados contra laringotraqueitis infecciosa (LTI) y
desafiados experimentalmente a los 35 dias de edad

                          Dias posdesafio

Grupos     2      4       6      8      10     12     14
(1)

A         0.44   1.45   0.51a   0.25   0.02   0.00   0.00
B         0.46   1.60   0.73a   0.45   0.16   0.04   0.00
C         0.36   1.57   0.52a   0.51   0.31   0.07   0.00
D         0.68   1.65   1.32b   0.68   0.25   0.00   0.00

(1) A: Vacuna recombinante del virus de viruela aviar (DVA) por via
subcutanea; B: Vacuna inactivada por via subcutanea y la vacuna DVA
del grupo A aplicada por puncion alar; C: Vacuna recombinante de
herpesvirus de pavo (HVT) por via subcutanea; D: control

(a,b,c) Superindices dferentes dentro de la columna indican dferencias
estadistica (p<0.05). En el dia 2 posdesafio se determino
diferencia estadistica (p<0.05) por la prueba de Chi cuadrado

Cuadro 2. Promedio del grado (0-2) de conjuntivitis en pollos de
engorde vacunados contra laringotraqueitis infecciosa (LTI) y
desafiados experimentalmente a los 35 dias de edad

                             Dias posdesafio

Grupos (1)     2      4      6      8      10     12     14

A             0.06   1.14   0.21   0.21   0.00   0.00   0.00
B             0.11   1.19   0.35   0.23   0.00   0.02   0.00
C             0.06   1.18   0.15   0.04   0.00   0.00   0.00
D             0.15   1.17   0.61   0.35   0.00   0.00   0.00

En el dia 2 posdesafio se determino diferencia estadistica (p<0.05)
por la prueba de Chi cuadrado

(1) A: Vacuna recombinante del virus
de viruela aviar (DVA) por via subcutanea; B: Vacuna inactivada por
via subcutanea y la vacuna DVA del grupo A aplicada por puncion
alar; C: Vacuna recombinante de herpesvirus de pavo (HVT) por via
subcutanea; D: control

Cuadro 3. Promedio del grado de lesiones histopatologicas (0-5) en
traquea en pollos de engorde vacunados contra laringotraqueitis
infecciosa y desafiados a los 35 dias de edad

                    Dias posdesafio

Grupos (1)     5     7     9    11    13

A             3.0   3.0   2.0   3.0   2.6
B             3.0   3.0   3.0   3.0   2.0
C             3.0   3.0   2.2   2.0   2.0
D             3.0   3.0   3.0   2.4   2.4

En los dias 9 y 11 posdesafio se determinaron diferencias
estadisticas (p<0.05) por la prueba de Chi cuadrado

(1) A: Vacuna
recombinante del virus de viruela aviar (DVA); por via subcutanea;
B: Vacuna inactivada por via subcutanea y la vacuna DVA del grupo A
aplicada por puncion alar; C: Vacuna recombinante de herpesvirus de
pavo (HVT) por via subcutanea; D: control

Cuadro 4. Respuesta serologica antes del desafio (35 dias de edad) y
15 dias posteriores al desafio (50 dias de edad) de pollos de engorde
vacunados contra laringotraqueitis infecciosa

                35 dias          50 dias (15
             (predesafio)          dias
                                 posdesafio)

Grupos (1)   PAT (2)   PGT (3)   PAT    PGT

A              60         6      2910   2800
B              762       17      1960   600
C               0         0      217     10
D              58         2      490    124

(1) A: Vacuna recombinante del virus de viruela aviar (DVA); B:
Vacuna inactivada y la vacuna DVA del grupo A; C: Vacuna
recombinante de herpesvirus de pavo (HVT); D: control

(2) Promedio aritmetico y (3) promedio geometrico del titulo de
anticuerpos contra el VLTI
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Author:Charca P., Silvia; Icochea D'A., Eliana; Gonzalez V., Rosa; Perales C., Rosa; San Martin D., Viviana
Publication:Revista de Investigaciones Veterinarias del Peru (RIVEP)
Date:Oct 1, 2015
Words:4068
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