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Evaluacion de la toxicidad vaginal de Croton lechleri en conejas.

Assessment of Croton lechleri vaginal toxicity in rabbits

INTRODUCCION

Las plantas medicinales, como el principal recurso en los sistemas medicos tradicionales, han sido utilizadas en la practica medica durante miles de anos y han hecho una gran contribucion al mantenimiento de la salud humana. La mayoria de la poblacion del mundo en los paises en desarrollo todavia se basa en las plantas medicinales para satisfacer sus necesidades de salud. La Organizacion Mundial de la Salud (OMS) es plenamente consciente de la importancia de las plantas medicinales para la salud de muchas personas en todo el mundo, como se indica en una serie de resoluciones adoptadas por la Asamblea Mundial de la Salud y el Comite Regional para el Pacifico Occidental. Asi pues, las plantas medicinales han sido reconocidas como un valioso recurso y de facil acceso para la atencion primaria de salud, y la OMS ha apoyado su uso seguro y eficaz (1).

Croton lechleri Muell. Arg. es un arbol perteneciente a la familia Euphorbiaceae, de cuya corteza se extrae el latex viscoso de color rojo denominado sangre de grado o de drago, que es usado en la amazonia peruana y etnias nativas y que se ha difundido a todas las regiones, donde se vende comercialmente.

En la medicina tradicional (2) se viene usando en forma indistinta la resina de Croton lechleri Muell. Arg. y Croton palanostigma Klotzsch en el Peru, el Croton draconoides en Bolivia, como cicatrizante de cortes, heridas y en hemorragias; como antiinflamatorio en afecciones bucales y de la garganta; tambien en gastritis y ulceras (3,4); es efectivo contra ulceras uterinas (5) y se le usa para lavados vaginales para flujos e inflamaciones de los organos genitales femeninos (2,6).

Existen varios estudios fitoquimicos (7,8) y farmacologicos realizados en el extranjero y nacionales, en los que nuestro equipo ha contribuido con investigaciones que reconocen su valor protector en la mucosa gastrica de ratas, tanto de la resina como de su fraccion alcaloidea denominada taspina (9-11); asimismo, se ha profundizado en cierto grado sobre su probable mecanismo de accion (12-14). Tambien, se ha realizado evaluaciones preclinicas que han validado sus propiedades cicatrizantes en la piel de animales de experimentacion (3,15,16) y se ha estudiado su potencial toxicologico (11,17-21).

No se encuentra en la literatura cientifica estudios en el area ginecologica, por lo que es necesario conocer esta potencialidad lo mas ampliamente posible, de acuerdo a las dosis usadas en animales de experimentacion, siguiendo las buenas practicas de laboratorio; por este motivo, realizamos el presente estudio, con la finalidad de evaluar el potencial efecto toxico irritante vaginal de Croton lechleri en conejas.

METODOS

Se realizo un estudio de tipo experimental, en el que se uso conejos hembras, virgenes, de raza Nueva Zelanda, blancos, obtenidos del bioterio de la Facultad de Medicina Veterinaria de la UNMSM, de 2 a 2,2 kg de peso corporal. Los animales fueron mantenidos en el bioterio de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos; se les alojo en jaulas individuales y su alimentacion fue con pellets de conejina obtenidos de Purina S.A., con agua ad libitum, en un ambiente con temperatura de 20[grados] a 23[grados]C, humedad relativa de 60 a 70%, con ciclo de luz/oscuridad de 12/12 horas.

La resina de Croton lechleri fue obtenida de Agroselva S.A., proveniente de la Colonizacion Von Humboldt, Pucallpa, Departamento de Ucayali, Peru, extraida tres meses antes del experimento. El latex fue desecado en estufa a la temperatura de 40[grados]C y el residuo obtenido se guardo en frasco oscuro a 4[grados]C hasta su uso.

La formulacion del gel vaginal se realizo en el laboratorio de Farmacotecnia de la Facultad de Farmacia y Bioquimica de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. El residuo desecado de Croton lechleri fue incorporado en polietilenglicol 400 en concentraciones de 1% y 5%.

Para la evaluacion de la toxicidad vaginal, despues de una semana de aclimatizacion en el bioterio de la Facultad de Medicina de la UNMSM, las conejas fueron distribuidas aleatoriamente en los siguientes grupos de 5 animales cada uno:

I. Control, formulacion del vehiculo

II. Formulacion de C. lechleri 1%.

III. Formulacion de C. lechleri 5%.

La administracion del vehiculo (grupo I) y de la formulacion de C. lechleri (grupos II y III), en volumen de 1 mL, se realizo intravaginalmente con sonda metalica esterilizada de 6 cm de longitud, durante 10 dias consecutivos, observandose y registrando para cada una de las conejas el estado clinico general, asi como la apariencia fisica de la vagina y el perineo por signos de flujo, eritema y edema.

Al dia siguiente de la ultima administracion se efectuo la eutanasia de todos los animales mediante inyeccion de pentobarbital sodico en la vena marginal de la oreja, y posteriormente se los desangro. Se realizo la exeresis quirurgica de la vagina de cada coneja y se efectuo un corte longitudinal al canal vaginal, sujetandolo con alfileres en tecnoport e inmediatamente se evaluo macroscopicamente, buscando signos de irritacion, sangrado o dano de la mucosa. Luego, se fijo en formol tamponado al 10% y posteriormente se tomo tres muestras representativas de cada region vaginal: cervico-vaginal (CV), media-vaginal (MV) y uro-vaginal (UV); los cortes del organo fueron incluidos en parafina y coloreados con hematoxilina-eosina.

De acuerdo a la severidad de la reaccion, basado en el tipo de alteracion histopatologica del tejido vaginal -ulceracion epitelial, infiltracion de leucocitos, edema y congestion vascular-, se asigno una puntuacion a cada parte del organo evaluada, segun el sistema de clasificacion de Eckstein y col (22,23) (ausente=0, minimo=1, leve=2, moderado=3, intenso=4), calculandose el promedio de puntajes en los grupos, que iba de 0 a 16. Este sistema de puntaje se correlaciona con el potencial de irritacion en humanos, como sigue: puntaje de 0 a 8 es aceptable, de 9 a 10 potencial de irritacion limite, y puntajes de 11 o mayores son indicativos de potencial irritativo significativo (24).

Se calculo el indice de irritabilidad vaginal asignando una puntuacion a cada parte del organo evaluado, calculando el promedio de puntos. Al valor obtenido con C. lechleri al 1% y 5% se le resto el valor obenido por el control. Se considero las categorias de respuestas en 0 ninguna, 1-4 minima, 5-8 media, 9-11 moderada y 12-16 severa (24).

Los valores de los puntajes de Eckstein fueron expresados como promedio [+ o -] desviacion estandar y las diferencias entre los grupos fueron determinadas mediante la prueba de Kruskal Wallis; se considero diferencias significativas valores p<0,05.

RESULTADOS

Los animales toleraron bien el procedimiento durante el periodo de administracion de diez dias. No se aprecio aspectos clinicos que mostraran signos de irritacion vaginal en los animales tratados, excepto un animal del grupo Croton lechleri al 1%, que presento perineo y vulva congestionadas, al cual no se le administro el 5 dia y despues cedio progresivamente.

El examen macroscopico de la vagina luego de su extraccion, el grupo control mostro aspecto congestivo leve en forma difusa en todos los casos; el aspecto fue similar en las muestras del grupo Croton lechleri al 1%, en algunos casos con predominio en el tercio externo (uro-vaginal). En el grupo de Croton lechleri al 5%, en dos casos se observo congestion petequial parcial.

En la figura 1A se puede observar el epitelio cervico-vaginal de coneja administrada solo con vehiculo, que hace un puntaje de 2, y en la figura 1B, de coneja que recibio Croton lechleri al 1%, ninguna ulceracion epitelial, e infiltracion leucocitaria, edema y congestion vascular leves, que hacen un puntaje de 3.

La figura 2 muestra el epitelio urovaginal de coneja del grupo Croton lechleri 1%, tambien con un puntaje de 3.

En cuanto al indice de irritabilidad vaginal calculado para la preparacion del gel de C. lechleri al 1%, alcanzo el valor maximo de 0,8 en las regiones media vaginal y urovaginal, mientras que para la preparacion al 5%, el valor maximo fue 3 en la region uro-vaginal (figura 3). Estos valores recaen en la categoria de respuesta minima.

[FIGURA 1A OMITIR]

[FIGURA 1B OMITIR]

DISCUSION

Los estudios de toxicidad son fundamentales dentro del desarrollo de un nuevo farmaco y se extienden practicamente a lo largo de todo el mismo. Se requiere las investigaciones toxicologicas para complementar la experiencia humana en la definicion de la posible toxicidad a corto plazo, pero son especialmente importantes en la deteccion de la toxicidad que pueden producirse despues de una exposicion prolongada o anos despues que la exposicion se ha interrumpido (1).

[FIGURA 2 OMITIR]

Realizamos la investigacion de irritacion vaginal diferenciado en las zonas cervico-vaginal (CV), medio-vaginal (MV) y uro-vaginal (UV), debido a que histologicamente puede variar la sensibilidad de los irritantes, segun sea el area de la mucosa vaginal; asi, las zonas uro-vaginal y medio-vaginal estan tapizadas por epitelio poliestratificado plano, mientras que la zona cervico-vaginal, cercana al utero, esta formada por epitelio cilindrico (22).

Es conocida la alta sensibilidad de la vagina de las conejas a irritabilidad de la mucosa. Durante la administracion con canula metalica y exposicion a las sustancias durante 10 dias, los resultados no mostraron irritacion histopatologica significativa (figuras 1 y 2), ya que en el grupo Croton lechleri al 1% las puntaciones promedio por area de mucosa vaginal variaron de 0,4 a 2,6 y como promedios totales de 3,4 a 6, muy similares al grupo en el que se administro el vehiculo solo, en los cuales los promedios de irritacion vaginal variaron de 0 a 1,6 y en promedio total alcanzaron de 3,2 a 5,2.

Tambien, en el caso de una concentracion mayor de Croton lechleri al 5%, el promedio de puntuacion vario de 0 a 3 y el promedio total de irritacion vaginal de 3,6 a 8.

Si consideramos lo propuesto por Eckstein y col (22,23) sobre la irritacion vaginal histopatologica -con una puntuacion de 0 a 8 como aceptable, de 9 a 10 como irritacion potencial limite (borderline) y por encima de 11 como potencial irritativo significativo-, entonces el grupo de Croton lechleri al 1% -cuyo promedio fue 3,4 a 6-, esta dentro del rango aceptable. Aun en el caso de una concentracion alta de Croton lechleri al 5%, la irritacion llego de 3,6 a 8, indicando una mayor irritacion; en el caso de la region medio-vaginal existio diferencia significativa (p=0,04) con respecto al control, pero todavia en el rango aceptable, cercano al limite (tabla 1).

Teniendo en cuenta el indice de irritacion vaginal (figura 3), entonces, tambien los resultados de los valores recaen en la categoria de respuestas de indice minimo de irritacion.

Es pertinente mencionar que los resultados en las investigaciones iniciales con este modelo experimental mostraron variabilidad sustancial entre varios laboratorios (22); pero, con su adecuada estandarizacion, la Administracion de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (US Food and Drug Administration) recomienda el uso de este modelo para evaluar el impacto toxico local de antimicrobianos vaginales. El metodo de irritabilidad vaginal en conejas presenta varias ventajas sobre otros modelos animales, como permitir la administracion de volumenes relativamente grandes del compuesto (1,0 a 1,5 mL) sin presentar derrame. La presencia de epitelio columnar, en parte de la vagina de la coneja, provee una alta sensibilidad a la prueba, confiriendo un razonable margen de seguridad del compuesto a probar para el uso en humanos. Adicionalmente, ha sido validado con investigaciones clinicas de fase I y seguido de amplia evaluacion post-marketing (25).

Actualmente, los investigadores estan desarrollando pruebas mas refinadas para evaluar la potencial irritacion cervicovaginal con el uso de antimicrobianos, en infecciones vaginales o uterinas, espermaticidas, anti-VIH, como la prueba mucosa de irritacion vaginal (26), histopatologia e inmunofluorescencia con anticuerpos antineutrofilos (27) y marcadores de inflamacion solubles y celulares (25).

Desde que existe correlacion entre conejos y humanos respecto a la irritacion vaginal con el empleo de diversos productos (23), los resultados de este experimento apoyan el empleo del gel de Croton lechleri en una futura investigacion clinica en humanos.

En conclusion, en nuestras condiciones experimentales, las preparaciones de gel de Croton lechleri en vehiculo de polietilenglicol al 1% no fueron irritantes para la mucosa vaginal de conejas y resultaron aceptables.

Manuscrito recibido el 17 de febrero de 2010 y aceptado para publicacion el 28 de mayo de 2010.

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Salomon Ayala [1], Juan Rojas [2], David Diaz [3], Jose Juarez [4], Carlos Delgado [2]

[1] Centro de Investigacion de Bioquimica y Nutricion, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Peru.

[2] Instituto de Investigaciones Clinicas, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Peru.

[3] Instituto de Patologia, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Peru.

[4] Facultad de Farmacia y Bioquimica, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Peru.

Correspondencia:

Salomon Ayala Pio

Facultad de Medicina, UNMSM.

Av. Grau 755.

Lima 1, Peru.

Correo-e: sayalap1@hotmail.com
Tabla 1. Puntaje promedio de irritacion vaginal para conejas blancas
Nueva Zelanda tratadas con gel de C. lechleri por via intravaginal
durante 10 dias consecutivos.

Componente vaginal                      Control         C. lechleri 1%
(Rango de puntaje)                      (n = 5)            (n = 5)

Cervico-vaginal
  Ulceracion epitelial (0-4)        0,0 [+ o -] 0,0   0,4 [+ o -] 0,9
  Infiltracion leucocitaria (0-4)   1,4 [+ o -] 0,5   1,0 [+ o -] 0,0
  Edema (0-4)                       0,8 [+ o -] 0,4   1,0 [+ o -] 0,0
  Congestion vascular (0-4)         1,0 [+ o -] 0,0   1,0 [+ o -] 0,0
  Puntaje total (0-16)                    3,2                3,4
Medio-vaginal
  Ulceracion epitelial (0-4)        1,2 [+ o -] 0,4   2,0 [+ o -] 1,0
  Infiltracion leucocitaria (0-4)   1,0 [+ o -] 0,0   1,0 [+ o -] 0,0
  Edema (0-4)                       1,2 [+ o -] 0,8   1,2 [+ o -] 0,4
  Congestion vascular (0-4)         1,0 [+ o -] 0,0   1,0 [+ o -] 0,0
  Puntaje total (0-16)                    4,4                5,2
Uro-vaginal
  Ulceracion epitelial (0-4)        1,6 [+ o -] 1,3   2,6 [+ o -] 0,5
  Infiltracion leucocitaria (0-4)   1,2 [+ o -] 0,4   1,2 [+ o -] 0,4
  Edema (0-4)                       1,4 [+ o -] 0,5   1,2 [+ o -] 0,4
  Congestion vascular (0-4)         1,0 [+ o -] 0,0   1,0 [+ o -] 0,0
  Puntaje total (0-16)                    5,2                 6

Componente vaginal                   C. lechleri 5%
(Rango de puntaje)                      (n = 5)

Cervico-vaginal
  Ulceracion epitelial (0-4)        0,0 [+ o -] 0,0
  Infiltracion leucocitaria (0-4)   1,4 [+ o -] 0,5
  Edema (0-4)                       1,0 [+ o -] 0,0
  Congestion vascular (0-4)         1,2 [+ o -] 0,4
  Puntaje total (0-16)                    3,6
Medio-vaginal
  Ulceracion epitelial (0-4)        2,0 [+ o -] 1,0
  Infiltracion leucocitaria (0-4)   1,6 [+ o -] 0,5
  Edema (0-4)                       1,6 [+ o -] 0,5
  Congestion vascular (0-4)         2,2 [+ o -] 1,3
  Puntaje total (0-16)                   7,4 *
Uro-vaginal
  Ulceracion epitelial (0-4)        3,0 [+ o -] 0,7
  Infiltracion leucocitaria (0-4)   1,2 [+ o -] 0,4
  Edema (0-4)                       1,8 [+ o -] 0,8
  Congestion vascular (0-4)         2,0 [+ o -] 1,2
  Puntaje total (0-16)                     8

Valores expresados como promedio [+ o -] Desviacion estandar.
* p < 0,05 vs. Control, calculado con la prueba de Kruskal Wallis.

Figura 3. Indice de irritabilidad vaginal en
conejas Nueva Zelanda tratadas con C. lechleri
durante 10 dias.

Indice de irritabilidad vaginal

                  CV     MV     UV

lechleri 1%      0,2    0,8    0,8
lechleri 5%      0,4      3    2,8

CV: cervico-vaginal, MV: media-vaginal, UV: uro-vaginal

Nota: Tabla derivada de grafico barra.
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Author:Ayala, Salomon; Rojas, Juan; Diaz, David; Juarez, Jose; Delgado, Carlos
Publication:Anales de la facultad de medicina
Article Type:Report
Date:Jun 22, 2010
Words:3580
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