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Evaluacion de la actividad inmunogenica de una vacuna para profilaxis de la anaplasmosis bovina.

INTRODUCCION

La anaplasmosis bovina es una enfermedad infecciosa, aguda o cronica, caracterizada por presentar anemia, ictericia e hipertermia, entre otros sintomas. El agente causante es la rickettsia Anaplasma marginale, que invade los globulos rojos produciendo su destruccion. Es transmitida por diferentes mecanismos, entre otros por infeccion intrauterina, por picadura de insectos hematofagos, o iatrogenicamente (castracion, descorne o utilizacion de instrumental contaminado) (7).

Los metodos actuales de control de la enfermedad involucran, en primer lugar, al tratamiento farmacologico de los animales afectados, mediante oxitetraciclina o imidocarb. Luego de controlar la erradicacion de los vectores, como prevencion se recomienda la vacunacion con cepas de Anaplasma centrale, practica que garantiza un estado de fuerte proteccion inmunologica (9).

El metodo inmunoprofilactico constituye una herramienta importante utilizada en nuestro pais, de comprobada eficacia para controlar el impacto de anaplasmosis y babesiosis en los sistemas de produccion ganadera. Consiste en aplicar un inmunogeno a base de agentes parasitos atenuados de Babesia bigemina, Babesia bovis y Anaplasma centrale, desarrollado por el Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria (INTA). Existen disponibles dos presentaciones de esta vacuna, una fresca (con duracion de 7 dias) y otra criopreservada con una viabilidad de 2 anos desde la fecha de elaboracion.

En areas libres de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus, la babesiosis no representa un problema, al contrario de lo que sucede con la anaplasmosis, requiriendo la utilizacion de la vacuna ultracongelada conteniendo solo A. centrale (8, 10).

Por lo expuesto, en el presente trabajo se formulo una vacuna criopreservada para la prevencion de la anaplasmosis, evaluandose su actividad inmunogenica.

MATERIAL Y METODOS

Vacuna monovalente. La composicion cuali-cuantitativa de cada dosis de 0,5 ml fue de 2,5 x [10.sup.7] eritrocitos infectados con A. centrale M1, 125 UI de penicilina G sodica, 125 [micron]g de sulfato de estreptomicina y 0,5 ml de solucion salina balanceada con glicerol 1,5 M. Esta presentacion se formulo a traves de la suspension de eritrocitos con la adicion de glicerol como criopreservador. Esta mezcla se envaso en pajuelas y se expuso a una fase de vapor de nitrogeno liquido, congelando a una tasa de 20[grados]C por minuto en una unidad de congelacion programable. Cuando la temperatura llego a -196[grados]C as pajuelas se trasladaron rapidamente a un termo de nitrogeno liquido.

Animales. Se seleccionaron veinte bovinos, hembras, mestizos de Hereford, entre cuatro y seis meses de edad. El lote se dividio aleatoriamente en dos grupos de diez animales cada uno. El primer grupo fue inoculado con la vacuna y el segundo grupo oficio como testigo. Los animales fueron adecuadamente identificados con caravanas (Tabla 1), tras lo cual se procedio a la inoculacion de la vacuna monovalente conservada en termos de nitrogeno liquido a -196[grados]C. Posteriormente, se envio el lote completo (inoculados y controles) a un corral con comedero de autoconsumo. El ensayo experimental se llevo a cabo en un campo de la Provincia de Corrientes, a 37 km de Sauce, localidad ubicada por debajo del paralelo 30[grados]S.

Determinacion de la actividad inmunogenica e identificacion de Anaplasma sp. Se obtuvieron muestras de suero de todos los animales incluidos en la experiencia en los 0, 30 y 60 dias post-vacunacion. La presencia de anticuerpos contra la proteina mayor de superficie de Anaplasma sp (MSP-5) se determino mediante ensayo por inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA competitivo). Asimismo, a los dias 15, 30, 45 y 60 se tomaron muestras de sangre con anticoagulante de seis animales, tres de cada grupo, para la identificacion y diferenciacion de Anaplasma sp mediante reaccion en cadena de la polimerasa (PCR anidada). Estos ensayos se realizaron en el Servicio de Diagnostico Animal de la Estacion Experimental INTA (Rafaela, Santa Fe, Argentina), siguiendo el procedimiento descrito por especialistas en el tema (12).

Evaluacion clinica. Durante todo el ensayo, principalmente a partir de los 30 dias (periodo de patencia de Anaplasma sp), se observo el estado general de los animales y los posibles efectos adversos en respuesta a la inmunizacion.

RESULTADOS Y DISCUSION

Los resultados arrojados por el ensayo ELISA se midieron en porcentaje de positividad respecto de un suero de referencia positivo. El punto de corte fue de 28%. Se tomaron como sospechosos a los valores cercanos al 28%, entre 25 y 40%. El 100% de los animales muestreados al dia 0 resultaron negativos.

El analisis serologico obtenido a los 30 dias revelo que el 20% de los animales inoculados resultaron positivos y el 100% de los pertenecientes al grupo control fueron negativos.

Transcurridos 60 dias, se pudo determinar que el 80% de los animales vacunados obtuvieron titulos de anticuerpos contra Anaplasma sp y 2 animales resultaron sospechosos en el grupo control, como indica la Tabla 1.

Los resultados obtenidos a partir de la PCR de los dias 15, 30, 45 y 60 se muestran en la Tabla 2. Mediante la PCR se pudo confirmar que los animales que resultaron positivos en los ensayos de ELISA, fueron a consecuencia de la respuesta de la cepa vacunal en el sistema inmunologico de los animales.

Con estos resultados de PCR tambien se logro identificar la presencia de ADN de A. centrale en el grupo control, explicando los valores cercanos al punto de corte, considerados sospechosos en los ELISA. Asimismo, se puede inferir la transmision mecanica por vectores, ya que las maniobras realizadas con los animales experimentales durante el presente trabajo no incluyeron posibles acciones iatrogenicas.

En los animales incluidos en la experiencia no se observaron efectos adversos a la vacuna conteniendo cepas vivas de A. centrale M1. La transmision de A. marginale es indirecta, con excepcion de la que se produce directamente de la vaca al ternero por via transplacentaria. La transmision indirecta se lleva a cabo por medio de artropodos hematofagos o por instrumentos u objetos accionados por el hombre (2).

Los transmisores de A. marginale en nuestro pais no son conocidos con exactitud. Experimentalmente se logro la transmision transestadial de A. marginale con adultos de Rhipicephalus (Boophilus) microplus (unico vector que se encuentra en Argentina) y de Amblyomma neumanni (garrapata de tres huespedes), que provenian de ninfas alimentadas sobre bovinos con infeccion patente (1,4).

Sin embargo, un estudio realizado en dos establecimiento ubicados en la Provincia de Salta (Argentina), uno con R. microplus durante todo el ano y el otro con presencia esporadica del mismo, mostro que las primoinfecciones con A. marginale eran independientes de la presencia del supuesto vector, resultando en tasas de infeccion del ganado similares al cabo de un ano (2).

Los dipteros hematofagos como Stomoxys calcitrans, ocho especies de Tabanus sp, tres especies de Culicidae (11) y Haematobia irritans (3) actuan como transmisores de A. marginale y A. centrale de forma mecanica. Se puede inferir la transmision mecanica de la cepa vacunal por estos dipteros, principalmente tabanos y mosquitos.

La transmision iatrogenica a traves de agujas, descornadores, mochetas, pinzas para tatuar, bisturies, caravaneadores y otros instrumentos, actuan como transmisores mecanicos de sangre infectada con A. centrale y A. marginale, constituyendo esta una importante via de transmision intra-rodeo pero no entre rodeos (6). En el presente trabajo, se podria descartar esta via de transmision debido a los recaudos tomados durante el experimento.

Investigadores brasilenos demostraron en 2013 la transmision transplacentaria en un area de inestabilidad enzootica a partir de vacas con infeccion cronica (100% seropositivas por inmunofluorescencia indirecta y 63,3% positivas a PCR) y resultando los terneros recien nacidos positivos en un 6,7% por PCR (5). Si bien en este caso no se trato de un rodeo de inestabilidad enzootica, fue necesario realizar el perfil de anticuerpos el dia 0 a traves de ELISA para tener la certeza de que los animales utilizados en el ensayo resultasen negativos a titulos de anticuerpos contra anaplasmosis. Asimismo, a los 15 dias post-inoculacion de pudo identificar A. centrale por PCR. Cabe resaltar la utilidad de esta herramienta de diagnostico, ya que a partir de los 15 dias es posible evidenciar la presencia del agente etiologico.

En conclusion, surge que la vacuna ultracongelada de Anaplasma centrale presento una adecuada actividad inmunogenica y no se observaron efectos adversos o reacciones post-vacunales, en la categoria de animales incluidos en el ensayo.

Esta vacuna monovalente resultaria interesante para su utilizacion en zonas donde la babesiosis no es endemica y redundaria en beneficios economicos para el productor, ya que resultaria menos costosa al prescindir de la tecnologia que implica la produccion de eritrocitos parasitados con Babesia sp, que actualmente incluye la vacuna trivalente criopreservada.

Asimismo, cabe resaltar la importancia de implementar medidas de control de los dipteros hematofagos cuando se utilizan estos metodos inmuno-profilacticos, ya que esta demostrada la transmision mecanica de la cepa vacunal.

La combinacion de las tecnicas de diagnostico disponibles en nuestro pais, representan una herramienta invaluable para controlar y tratar adecuadamente esta patologia, que provoca grandes perdidas en nuestros rodeos.

Agradecimientos. Al MV Sebastian Estigarribia por sus aportes en el presente trabajo. A la Secretaria de Ciencia y Tecnica-UNNE y al Laboratorio Litoral Biologicos SRL por el apoyo economico.

REFERENCIAS

(1.) Aguirre DH et al. 1994. Transmission of Anaplasma marginale with adult Boophilus microplus ticks fed as nymphs on calves with different levels of rickettsemia. Parasite 1: 405-407.

(2.) Fiel C, Nari A. 2013. Enfermedades parasitarias de importancia clinica y productiva en rumiantes. Fundamentos epidemiologicos para su prevencion y control, Editorial Hemisferio Sur, Montevideo (Uruguay), 752 p.

(3.) Foil LD, Gorham JR. 2004. Mechanical transmission of disease agents by arthropods. In: Medical Entomology (Eldridge BF & Edman JD, edit.), Ed. Springer, New York, p. 461-514.

(4.) Gaido AB. 1995. Transmission of Anaplasma marginale by the three-host tick Amblyomma neumanni under laboratory conditions. Folia Parasitol 42: 72.

(5.) Gonzalez HE, Cunha NA, Pappen FG, Farias NA. 2013. Transplacental transmission of Anaplasma marginale in beef cattle chronically infected in southern Brazil. Rev Bras Parasitol Vet 22: 189-193.

(6.) Kocan KM, Blouin EF, Barbet AF. 2000. Anaplasmosis control: past, present and future. Ann. NY Acad. Sci 916: 501-509.

(7.) Luciani C. 2003. Babesiosis y anaplasmosis, la "tristeza bovina". Public. de la Estacion Experimental Agropecuaria INTA, Colonia Benitez, Chaco, Argentina, p. 5-8.

(8.) Mangold AJ, Aguirre DH, Guglielmone AA. 1990. Post-thawing viability of vaccines for Bovine babesiosis and anaplasmosis cryopreserved with glycerol. Vet Parasitol 37: 301-306.

(9.) Mangold, AJ. 2005. Prevencion de la babesiosis y anaplasmosis. Anales de la Reunion Anual de la Asociacion Argentina de Criadores de Braford (Rafaela, Santa Fe, Argentina), p. 3-4.

(10.) OIE-World Organisation for Animal Health. 2015. Manual terrestre de la OIE, Capitulo 2.4.1: Anaplasmosis bovina. www.oie.int/es/normas/manual-terrestre/

(11.) Scoles GA, Broce AB, Lysyk TJ, Palmer GH. 2005. Relative efficiency of biological transmission of Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) by Dermacentor andersoni (Acari: Ixodidae) compared with mechanical transmission by Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae). J Med Entomol 42: 668-675.

(12.) Torioni S et al. 1998. Detection of cattle naturally infected whit Anaplasma marginale in a region of endemicity by nested PCR and competitive enzyme linked immuno sorbent assay using recombinant major surface protein-5. J Clin Microbiol 36: 777-782.

Lozina, L. (1); Torioni, E.S. (2); Barbieri, F. (1); Del Rio, F. (1); Rios, E.E. (1)

(1) Dpto. Clinicas, Fac. Cs. Vet., Univ. Nac. Nordeste (UNNE), Cabral 2139, Corrientes 3400, Argentina.

(2) Instit. Nac. Tecnol. Agropec. (INTA), Rafaela, Santa Fe, Argentina.

E-mail: llozina@vet.unne.edu.ar

Recibido: 5 junio 2018 / Aceptado: 28 agosto 2018
Tabla 1. Resultados del test ELISA a los 30 y 60 dias en grupos
inoculado y control.

grupo        N   ELISA 30 dpv  ELISA 60 dpv

            151     2%   N       89%  POS
            152     2%   N        4%   N
            153     3%   N       84%  POS
            154     1%   N       97%  POS
inoculados  155    79%  POS      91%  POS
            156    36%  POS      84%  POS
            157    12%   N      106%  POS
            158     2%   N        2%   N
            159    13%   N      103%  POS
            160     3%   N       77%  POS
            171     6%   N        5%   N
            172     2%   N        3%   N
            173     1%   N        3%   N
            174    12%   N        4%   N
controles   175     4%   N       27%  Sosp
            176     6%   N       28%  Sosp
            177     1%   N        5%   N
            178     2%   N        2%   N
            179    10%   N        7%   N
            180     2%   N        3%   N

N: numero de caravana; ELISA: ensayo por inmunoabsorcion ligado a
enzimas; dpv: dias post-vacunacion; N: negativo; POS: positivo; Sosp;
sospechoso.

Tabla 2. Resultados de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) a
los 15, 30, 45 y 60 dias en grupos tratado y control (dpv).

caravana  PCR 15 dpv  PCR 30 dpv  PCR 45 dpv  PCR 60 dpv
          A.m.  A.c.  A.m.  A.c.  A.m.  A.c.  A.m.  A.c.

  151      N     N     N    POS    N    POS    N    POS
  155      N    POS    N    POS    N    POS    N    POS
  157      N     N     N    POS    N    POS    N    POS
  171      N     N     N     N     N    POS    N    POS
  173      N     N     N     N     N    POS    N    POS
  175      N     N     N    POS    N    POS    N    POS

A.m.: Anaplasma marginale. A.c.: Anaplasma centrale. N: negativo. POS:
positivo.
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Author:Lozina, L.; Torioni, E.S.; Barbieri, F.; Del Rio, F.; Rios, E.E.
Publication:Revista Veterinaria
Date:Jun 28, 2019
Words:2330
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