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Evaluacion de la Patogenicidad Inhalatoria del Micoinsecticida Beauveria bassiana LF14 en Ratones.

ASSESSING THE INHALATION PATHOGENICITY OF THE MYCOINSECTICIDE Beauveria bassiana LF14 IN MICE

INTRODUCCION

La enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana es considerada como una de las mas importantes enfermedades metaxenicas de origen parasitario en Latinoamerica, estimandose que afecta alrededor de 8 millones de habitantes de 21 paises (Rassi et al, 20010; WHO, 2012). Tiene una mayor prevalencia en asentamientos rurales de bajos recursos socio-economicos, donde el contacto con los vectores triatominos es mas frecuente, siendo considerada como la enfermedad parasitaria que genera el mayor impacto socio-economico en Latinoamerica (WHO, 2012).

La aspersion en las casas con insecticidas de origen quimico ha representado una medida practica y efectiva de control a corto plazo contra los vectores triatominos; no obstante, su uso constante representa un peligro potencial para la salud del humano y los demas integrantes de la biosfera en general, induciendo, asimismo, mecanismos de resistencia en los vectores. Ademas, es una practica inviable contra las poblaciones triatominas de habitos peridomesticos o en zonas de selva (Luz et al, 2004; Forlani et al, 2011; WHO, 2012). Aunado a esto, se deben tener presentes los elevados costos de estos programas (Slinninger et al, 2003; WHO, 2012). Esto implica la necesidad de desarrollar estrategias de control con enfoques mas biorracionales, dentro de un programa de Manejo Integral de Plagas (MIP), en los que se incluyen microorganismos tales como los hongos entomopatogenos (Luz et al, 2004; Cazorla, 2011; Forlani et al, 2011).

Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales) es uno de los hongos entomopatogenos que ha mostrado una alta eficacia, tanto a nivel experimental como de campo, contra varias especies triatominas de importancia epidemiologica (Luz et al., 2004; Cazorla 2011; Forlani et al, 2011). Su efectividad depende de la capacidad de las conidias sobre los insectos muertos de esparcirse a traves de las colonias de insectos (autodiseminacion o transmision fungica horizontal) (Luz et al., 1999; Forlani et al., 2011). De aqui que, especialmente en ambientes cerrados como las habitaciones de las casas, la concentracion de conidias en el aire va a depender del numero de insectos infestados y de la humedad, entre otras condiciones (Luz et al, 1999; Ward et al, 2000).

Como consecuencia de las grandes cantidades de conidias y fragmentos fungicos que pueden llegar a estar aerolizados, es inevitable que sean parte del aire que respiran los seres vivos, incluyendo el humano. Aunque los hongos entomopatogenos se consideran inocuos para los mamiferos (Zimmermann, 2007), la exposicion a estos microorganismos biocontroladores se encuentra asociada a la aparicion de sintomas respiratorios, tanto alergicos como no alergicos y danos a la funcion pulmonar (Douwes et al., 2003). En el caso particular de B. bassiana, se le ha aislado en el liquido pleural de un paciente con adenocarcinoma pulmonar y en muestras de esputos (Madsen et al., 2007).

Desde hace mas de una decada, el equipo multidisciplinario de investigacion del presente estudio viene trabajando con hongos entomopatogenos de elevada virulencia contra especies triatominas de importancia epidemiologica y adaptados a las condiciones ecologicas de las zonas endemicas chagasicas de Venezuela (Cazorla, 2011). En este sentido, B. bassiana LF14 ha exhibido a nivel de laboratorio y especialmente en soluciones aceitosas, una elevada patogenicidad y virulencia hacia Rhodnius prolixus y Triatoma maculata (Cazorla, 2011), principales vectores de la enfermedad de Chagas en Venezuela (Feliciangeli, 2009).

Ante el eventual rociamiento de soluciones de conidias de B. bassiana LF14 en zonas pobladas, se hace necesario garantizar su inocuidad para los integrantes de la biosfera. En este sentido, se ha ensayado con exito su bioseguridad por las vias dermica (Acosta et al, 2011) y oral (Acosta et al, 2012) en el modelo raton. El presente trabajo es la continuidad de estos bioensayos, al evaluar los efectos patogenicos por via inhalatoria o respiratoria del aislamiento B. bassiana LF14 en ratones albinos (NMRI).

MATERIALES Y METODOS

Los ensayos se llevaron a cabo en el Laboratorio de Entomologia, Parasitologia y Medicina Tropical (LEPAMET) y en el bioterio de la Unidad de Parasitologia y Medicina Tropical (UNIMETROPA) del Centro de Investigaciones Biomedicas (CIB), Campus Borregales, de la Universidad Nacional Experimental <<Francisco de Miranda>> (UNEFM), Coro, estado Falcon, Venezuela.

Se utilizo parte del diseno experimental previsto en el nivel I de evaluacion toxicologica de los agentes microbianos para el control de plagas de la Agencia de Proteccion Ambiental (Environmental Protection Agency (EPA) de los Estados Unidos de America (US-EPA, 1996). Asimismo, se cumplieron las normas internacionales y nacionales de bioetica y bioseguridad de las buenas practicas de laboratorio, y en el cuidado y uso de animales de laboratorio (FONACIT, 2008) El presente protocolo de investigacion fue aprobado por el Comite de Bioetica de la UNEFM el 31 de enero de 2008 (Acosta et al, 2011).

Animales de Experimentacion

S e usaron 48 ratones albinos heterocigotos NMRI (Mus musculus), de 6 a 7 semanas de edad, cuyos pesos no excedieron del 20% del peso promedio para cada sexo. Se trabajo con 12 ratones por sexo y grupo experimental (controles e inoculados). Los animales y su cuidado eran de calidad higienico sanitarias conforme las normas de cuidado y uso de animales de laboratorio (FONACIT, 2008). Se colocaron tres animales por jaula de uso habitual en el bioterio. El alimento (ratarina: Protinal[R], Valencia, Venezuela) y el agua se esterilizaron por vapor humedo en autoclave y fue suministrado ad libitum. Los animales se mantuvieron en ciclo de luz-oscuridad de 12-12 horas (Acosta et al, 2011).

Cultivo Fungico y Suspension de Conidias

Las suspensiones de conidias se realizaron con el aislamiento LF14 de Beauveria bassiana, de la micoteca del Laboratorio de Fitopatologia, Nucleo Universitario <<Rafael Rangel>> (NURR), Universidad de Los Andes (ULA), Trujillo, estado Trujillo, Venezuela (Fig. 1). Este fue aislado en 1992 a partir de un cadaver esporulado de insecto coleoptero no identificado recolectado en la poblacion de Monay, estado Trujillo, region andino-venezolana. Las conidias se obtuvieron raspando, mediante asa de platino, la superficie de cultivos esporulados de 15 dias crecidos sobre medio solido Lactrimel-agar (25 g glucosa, 10 g peptona, 20 g agar y 1000 ml agua destilada) (Borelli, 1962) y mantenidos en camara de ambientacion (Biotronette[R] Mark II, modelo 845, Lab Line Instruments, Illinois, EEUU), bajo condiciones de saturacion de humedad relativa (>90%) y a 26 [grados]C (Cazorla et al, 2007; Acosta et al, 2011).

[FIGURA 1 OMITIR]

El material fungico cosechado se suspendio en agua destilada esteril y se filtro a traves de gasa para separar el micelio de las conidias. Luego fue ajustado mediante camara de Neubauer (hemocitometro) (Neubauer-improved, Marienfeld, Alemania), a la concentracion de 1x[10.sup.9] conidias/ml (Goettel e Inglis, 1997; Cazorla et al, 2007) y utilizado de inmediato.

Procedimiento de Infeccion

Los animales se expusieron por instilacion intranasal a una sola dosis de 0.3 ml/kg de una suspension de 1x[10.sup.9] conidias/ml del aislamiento LF14 de B. bassiana, utilizando un gotero nasal comercial (Fisiolin[R]), donde se sustituyo el contenido comercial por la suspension de conidias. Ademas, fue necesario colocar una aguja de inyectadora de insulina para facilitar la aplicacion en las fosas nasales. Al grupo control se le aplico el mismo volumen de gotas con agua destilada esteril.

Posteriormente, y por 14 dias, se realizaron examenes clinicos y de comportamiento, control diario de peso, mortalidad y estudio micologico (aclaramiento) por aspiracion intranasal de secrecion mucosa con pera de aspiracion nasal. En los examenes clinicos se evaluo la presencia de signos de irritacion en piel y pelo, ojos y mucosas, evaluacion general de sistemas y patrones de conducta o comportamiento calificado como normalactivo, sensible, pasivo, agresivo (Tapias y Dussan, 2000); observandose, ademas, posibles efectos como convulsiones, diarrea, letargo, salivacion, somnolencia y coma (Acosta et al, 2011).

[FIGURA 2 OMITIR]

Para el estudio micologico, las muestras de secrecion se colocaron sobre laminas portaobjetos, se colorearon con azul de algodon, cubriendose con laminilla cubreobjeto para observarse bajo microscopio fotonico (Axiostar Plus, Carl Zeiss, Alemania) (Cazorla et al, 2007). El cultivo de la muestra nasal se hizo en medio solido (Sabouraud) por rastrilleo y las placas se incubaron por 7-14 dias a 26 [grados]C y mas de 90% de humedad relativa en camara de ambientacion (Cazorla et al., 2007). A las 24, 48 y 72 horas, se estimo el numero de conidias germinadas (%) (Cazorla et al, 2007). Una vez concluida la incubacion, se cuantifico la esporulacion (conidias/ml) mediante hemocitometro (Goettel e Inglis 1997; Cazorla et al., 2007).

Estudio Histopatologico

Se practico una inspeccion anatomo-patologica con una necropsia completa, observandose las caracteristicas de organos y sistemas en todos los ratones (Acosta et al., 2011). El sacrificio se hizo mediante anestesia con eter dietilico y dislocacion cervical, en 6 a 9 animales por grupo experimental y sexo a los 3, 7 y 14 dias despues de la inoculacion fungica. Se tomaron muestras de piel, rinones, higado, bazo, pulmones, traquea, estomago, intestinos, corazon (Acosta et al., 2011), para estudio histopatologico y micologico directo y en cultivo en medio solido, como ha sido previamente descrito.

[FIGURA 3 OMITIR]

En el estudio histopatologico, las muestras se fijaron en formaldehido al 10% y se incluyeron en parafina. Se hicieron cortes de 5-7 [micron]m con microtomo de rotacion manual (Reichert Jung HN-40, Mannheim, Alemania), se colorearon con hematoxilina-eosina (H-E) o azul de toluidina, y se evaluaron y fotografiaron (Olympus, Fe-120, Olympus Imaging Corp., Japon) bajo un microscopio fotonico (Axiostar Plus, Carl Zeiss, Alemania) (Acosta et al., 2011).

Analisis Estadistico

La significancia estadistica de las diferencias entre las medias de los pesos y esporulacion (conidias/ml) se determino mediante analisis de varianza de una via y de comparacion multiple Student-NewmanKeusl (SNK). Los datos se analizaron mediante paquete estadistico MINITAB v. 13.20 (Minitab Inc. 2000).

[FIGURA 4 OMITIR]

RESULTADOS Y DISCUSION

No hubo registros de mortalidad ni alteraciones discernibles en los signos clinicos evaluados, observandose habitos y comportamiento de tipo activo-normal, tipicos para la especie (Tapias y Dussan, 2000).

En el analisis de la dinamica del peso promedio corporal, esta variable se incremento en forma significativa en todos los grupos (machos y hembras inoculados y en los controles). Los machos presentaron mayores pesos que las hembras, tanto al inicio como al final del periodo de observacion (F=46,9; p<0.0000); sin embargo, no hubo diferencia estadistica por sexo entre los animales inoculados y aquellos no expuestos a las conidias fungicas (Fig. 2).

El analisis micologico de las muestras nasales durante los 14 dias del ensayo, tanto por examen microscopico directo o cultivo en medio solido, no revelo la presencia de la conidias de LF14 B. bassiana. Sin embargo, el estudio histopatologico revelo la presencia de conidias no germinadas en muestras del tracto respiratorio.

En el analisis de recuperacion de conidias de animales (infectividad) con el cultivo de los organos solo se obtuvieron resultados positivos (promedio de conidias/ml [+ o -] desviacion estandar) en la necropsia realizada al tercer dia de la exposicion en pulmon (n = 3 por sexo; machos = 7.5x[10.sup.5] [+ o -] 1.1x[10.sup.4]; hembras = 7.8x[10.sup.5] [+ o -] 2.1x[10.sup.4]) y traquea (n=3 por sexo; machos = 2.7x[10.sup.5] [+ o -] 3.3x[10.sup.4]; hembras = 3.1x[10.sup.5] [+ o -] 1.5 x[10.sup.4]); sin embargo, no hubo diferencia estadistica entre sexos.

En el examen macroscopico externo, durante la necropsia, no se evidenciaron hallazgos patologicos ni diferencias entre los grupos de ratones expuestos a las conidias fungicas y los grupos controles. Similarmente, tampoco se detectaron alteraciones patologicas macroscopicas en las cavidades toracica y abdominal y sus organos.

En el estudio histopatologico, no se evidenciaron alteraciones estructurales de consideracion en los tejidos en organos de los ratones inoculados. De una manera global, no se observaron infiltrados de macrofagos, neutrofilos y eosinofilos como parte de un proceso inflamatorio agudo, asi como tampoco conidias germinadas ni evidencias fungicas o histopatologicas de la multiplicacion del aislamiento LF14 (Figs. 3 y 4). Sin embargo, se observaron leves cambios inflamatorios caracterizados por la presencia de un minimo infiltrado perivascular y peribronquial en los cortes de pulmones (Fig. 4).

Uno de los requisitos indispensables para registrar y comercializar un bioplaguicida ante los entes gubernamentales reguladores es la demostracion de que no infecta al humano ni a los animales domesticos, y que debe ser seguro para los seres vivos integrantes del ecosistema (Toriello, 2003). La exposicion inhalatoria es una de las pruebas toxicologicas del nivel I que se requieren para probar la seguridad de un producto fungico sin formular (Jaronski et al, 2003; Toriello, 2003).

En el presente trabajo quedo demostrado la inocuidad en ratones NMRI del aislamiento B. bassiana LF14 administrado intranasalmente con 1x[10.sup.9] conidias/ml. Este resultado coincide con los hallazgos de varios autores que trabajaron con ratones y otras especies de vertebrados empleando otras cepas de B. bassiana y otras especies de ascomicetos (El-Kadi et al, 1983; Tapias y Dussan, 2000; Mancebo et al, 2005, 2009; US-EPA, 2006; Zimmermann, 2007).

En forma similar a otros ensayos de evaluacion del aislamiento B. bassiana LF14 por via dermica (Acosta et al, 2011) y oral (Acosta et al, 2012), el incremento de peso estuvo dentro de los rangos aceptados para individuos adultos de M. musculus (Quesada-Dominguez, 1997). No obstante, Mancebo et al. (2005) detectaron una disminucion del peso en ratas cuando se les administro Paecilomyces lilacinus por via intravenosa, lo que atribuyeron como parte del proceso patogenico del hongo. En lo que respecta a las diferencias entre sexos, se espera en M. musculus un mayor peso corporal en el macho (Quesada-Dominguez, 1997; Tapias y Dussan, 2000; Acosta et al, 2011, 2012).

En el estudio de aclaramiento no se detectaron cultivos positivos en tracto respiratorio, aunque en la evaluacion anatomopatologica se pudo observar conidias viables en pulmon y traquea en el tercer dia pos-exposicion, asi como leves procesos inflamatorios con infiltrado perivascular y peribronquial, lo que pareciera sugerir que B. bassiana LF14 posee algun grado de inmunogenicidad. Sin embargo, no se encontro evidencia micologica ni histopatologica sobre la germinacion y multiplicacion del hongo, aun a las elevadas dosis inoculadas.

Se observaron algunos contrastes al comparar estos resultados con otras cepas de B. bassiana y hongos entomopatogenos. Asi, Tapias y Dussan (2000), trabajando con tres cepas de B. bassiana inoculadas intratraquealmente en ratones BALB/c y Mancebo et al. (2005, 2009) inoculando intranasalmente conidias del hongo entomopatogeno P. lilacinus y la cepa B. bassiana 9205 en ratas, no llegaron a observar alteraciones a nivel del arbol respiratorio ni recuperaron las conidias; mientras que Ward et al. (1998, 2000) encontraron respuestas inmunologicas, inflamatorias, histopatologicas y fisiologicas en ratones BALB/c expuestos a antigenos crudos de Metarrhizium anisopliae en sus vias respiratorias. Asimismo, Song (1989) encontro neumonia intersticial cronica, con neumonitis descamativa, fibrosis y edema pulmonar en el 79% de ratas y ratones expuestas por 18 meses a conidias de B. bassiana.

Es conocido que las variaciones de temperatura ocasionan una amplia variedad de danos irreversibles en las celulas fungicas (Ulusu y Tezcan, 2001; Rangel et al. 2005). Temperaturas mayores de 35 [grados]C en los vertebrados homeotermos, como la de los ratones (37 [grados]C) (Quesada-Dominguez, 1997), es uno de los factores que interviene en la falta de patogenicidad de los hongos entomopatogenos, ya que estos microorganismos son termosensibles (Hallsworth y Magan, 1999; Rijo et al, 2002). El aislamiento B. bassiana LF14 no logra germinar ni desarrollarse in vitro entre 35 y 38 [grados]C (Cazorla et al, 2007); sin embargo, se han reportado casos humanos, mayormente en inmucomprometidos con procesos infecciosos debidos a Beauveria (Henke et al., 2002) y por otros hongos entomopatogenos, como M. anisopliae (Revankar et al., 1999) y P lilacinus (Prado y Borelli, 1993). Lo llamativo de estos hallazgos es que estos hongos no proliferan en cultivos in vitro a 37 [grados]C, donde similar comportamiento se ha observado en otros hongos oportunistas (Alternaria sp, Ulocladium sp, Fusarium sp, Sporothrix sp y Engyodontium sp) (Shimazu, 2004). Por lo tanto, la termotolerancia in vivo para estos taxones fungicos puede ser diferente a la detectada in vitro.

Aunque los hongos entomopatogenos, incluyendo B. bassiana, no suelen ocasionar danos considerables a nivel respiratorio en el humano; no obstante, poseen sustancias que son potenciales alergenos; ademas, se les encuentra presentes en el aire y otros sustratos, por lo que podrian ocasionar problemas patologicos en las vias respiratorias, especialmente en individuos inmucomprometidos (Ward et al., 2000; Lackner et al., 2004), en uno de los cuales se ha reportado signos de alveolitis muy parecidos a las manifestaciones clinicas de hipersensibilidad tipo III y IV detectadas en ratones y ratas expuestas experimentalmente a conidias de B. bassiana (Song, 1989; Henke et al, 2002).

En este mismo sentido, estudios hechos con pruebas alergicas han demostrado que existen indices de alergenicidad hacia extractos de B. bassiana (Beaumont et al., 1984, 1985; Westwood et al., 2005). Ademas, se han detectado alergias de tipo ocupacional debida a la exposicion con hongos entomopatogenos (Green et al., 2009). Por otra parte, B. bassiana posee epitopes que son homologos a otras especies fungicas de mucha relevancia clinica (Alternaria sp, Penicillium sp, Candida sp, Aspergillus sp), especialmente en el desarrollo de reacciones alergicas mediadas por IgE en individuos atopicos, de alli que existe la posibilidad que un individuo desarrolle una reaccion alergica a Beauveria, si previamente presento sensibilidad hacia otra especie de hongo (Westwood et al., 2005).

CONCLUSIONES

El aislamiento B. bassiana LF14 se presenta inocuo por via inhalatoria en Mus musculus (NMRI).

http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v26i4.11213

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Dalmiro Cazorla Perfetti (1,2), Maria Acosta Quintero (1), Pedro Morales Moreno (1)

(1) Laboratorio de Entomologia, Parasitologia y Medicina Tropical (L.E.P.A.M.E.T.), Centro de Investigaciones Biomedicas (C.I.B.), Universidad Nacional Experimental <<Francisco de Miranda>> (UNEFM), Estado Falcon, Venezuela

(2) E-mail: lutzomyia@hotmail.com

Recibido: 4 de marzo de 2015

Aceptado para publicacion: 10 de junio de 2015
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Author:Cazorla Perfetti, Dalmiro; Acosta Quintero, Maria; Morales Moreno, Pedro
Publication:Revista de Investigaciones Veterinarias del Peru (RIVEP)
Article Type:Report
Date:Oct 1, 2015
Words:4491
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