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Evaluacion de dos medios de cultivo sobre la produccion in vitro de embriones bovines.

COMPARISON OF TWO CULTURE MEDIA OVER THE IVP OF BOVINE EMBRYOS

Introduccion

Dentro del sector agropecuario colombiano la ganaderia tiene una importancia relativa indiscutible, con una participacion del 27% del PIB agropecuario y del 64% del PIB pecuario (4). Alrededor del mundo, la produccion in vitro de embriones bovinos (PIV) experimenta un acelerado crecimiento. S egun los datos reportados por la International Embryo Transfer Society (IETS) en el mundo se transfieren anualmente mas de 600.000 embriones producidos in vitro (18). Ademas de la aplicacion comercial, la PIV bovinos es una importante herramienta para el estudio de fenomenos biologicos ocurridos durante la maduracion del ovocito, la fertilizacion y el desarrollo embrionario temprano (15).

El desarrollo embrionario temprano puede ser llevado a cabo en diferentes medios de cultivo cuya composicion consiste en una solucion simple de sales balanceadas y carbohidratos, por ejemplo, tenemos el caso de los medios Charles Rosenkrans 1 (CR1), fluido de oviducto sintetico (SOF) y el medio simple de potasio optimizado (KS OM). Tambien hay medios con una composicion de constituyentes mas compleja, como el TCM-199.

Para el desarrollo embrionario estos medios son s uplementados con s uero bovi no fetal (S BF) o albumina serica bovina (BSA) (8, 12, 16). Durante el desarrollo postfertilizacion hasta la formacion del blastocisto ocurren una serie de eventos biologicos de suma relevancia, como la formacion del zigoto, la primera division celular, la activacion del genoma embrionario, la compactacion de la morula y la formacion del blastocisto (10).

Con el proposito de aumentar las tasas de embriones producidos in vitro se ha buscado la optimizacion de los medios de cultivo, lo que ha conducido a la simplificacion de los mismos, al eliminar los componentes innecesarios o incluso perjudiciales. Los resultados obtenidos han sido evaluados de acuerdo a complejos estudios metabolicos y moleculares (5).

Los medios de cultivo estan formulados en base a la presencia de iones, azucares y aminoacidos (aa) en el ambiente uterino y oviductal, en el momento de la liberacion del ovocito, la fertilizacion y el desarrollo embrionario temprano (6, 5). Dos de los medios mas empleados en la actualidad son el KSOM aa y el CR-1 (tabla1). Por ende, el objetivo de este estudio fue evaluar dos protocolos para la produccion in vitro de embriones bovinos sobre la tasa de blastocistos producidos, para el protocolo I el medio de desarrollo utilizado fue el CR-1 preparado en nuestro laboratorio y en el protocolo II se utilizo un medio KSOMaa comercial.

Materiales y metodos

Recoleccion de ovarios

Los ovarios de bovino fueron obtenidos de hembras sacrificadas en la planta de sacrificio Envicarnicos, ubicada en el municipio de Envigado, Antioquia, se depositaron en solucion salina esteril a 35[grados]C y se transportaron durante 15-20 minutos al Laboratorio de Cultivos Tisulares de la Universidad CESEIA. Una vez en el laboratorio, bajo condiciones asepticas se lavaron los ovarios tres veces con solucion salina a 35[grados]C con el fin retirar el material contaminante, sangre y detritus.

Luego, con jeringa de 10 ml provista de aguja No 18 se procedio a la aspiracion de los foliculos que poseian un diametro entre 4 y 8 mm y su contenido fue recolectado en un tubo conico de 15 ml colocado en bano maria a 38[grados]C. Despues de dejar sedimentar el aspirado por un espacio de 15 min se procedio bajo estereomicroscopio a la seleccion de los complejos cumulos-ovocitos (CCO). Se clasificaron como buenos, los ovocitos que poseian un cumulos con capas multiples de celulas de la granulosa, compacto pero translucido, un ooplasma con granulacion fina, densa y uniforme.

Como regulares, los ovocitos con un cumulos ligeramente expandidos, con menor numero de capas de celulas de la granulosa, que pueden cubrir la mitad de la zona pelucida y granulaciones ligeramente mas gruesas; y como malos, a los ovocitos desnudos, pequenos, cumulos muy oscuros, ooplasma de color muy negro. En la PIVE bovina, solo los ovocitos clasificados como buenos producen buenas tasas de modulas y blastocistos y fueron los que se seleccionaron para este estudio. S in embargo, en algunos experimentos los ovocitos clasificados como regular son tambien incluidos dentro de los procesos in vitro (7, 14).

Maduracion in vitro

Todos los reactivos utilizados en el presente trabajo fueron S igma (San Luis, USA) excepto el medio evolve (Zenith Biotech). Una vez obtenidos los CCOs se lavaron tres veces en medio TL-Hepes suplementado con 0.3% (W/V) de Albumina Serica Bovina (BSA) y 0.2 mM de acido piruvico. Para el proceso de maduracion se colocaron 10 CCOs en gotas de 50 [micron]l de medio TCM-199 suplementado con 10% de SBF, 0.5 [micron]/ml de FSH, 0.5 g/ml de LH, 1 [micron]/ml de 17-P estradiol, 0.25 mM de acido piruvico. Las gotas fueron cubiertas con aceite mineral y preincubadas bajo condiciones de cultivo por un tiempo minimo de 2 horas en una incubadora a 38.5[grados]C de temperatura, una atmosfera de 5% de C[O.sub.2] y una humedad relativa del 99%. La maduracion se realizo por un periodo de 24 horas (9).

Fertilizacion in vitro

Los CCOs previamente madurados fueron lavados tres veces con medio TL-Hepes suplementado con 0.3% (W/V) de BSA y 0.2 mM de acido piruvico; posteriormente fueron colocados en gotas de 44 [micron]l de medio de fertilizacion basado en una solucion Tyrodes lactato-piruvato suplementado con 0. 6% de BSA (libre de acidos grasos), 0.2 mM de acido piruvico, 100 IU/ml de penicilina y 50 [micron]/ml de estreptomicina. Despues de la transferencia de los CCOs se adicionaron a cada gota 2 [micron]l de heparina (concentracion final 2 [micron]/ml) y 2 [micron]l de PHE (2 mM de penicilamina, 1 mM de hipotaurina y 250 mM de epinefrina). Una pajilla de semen fue descongelada en bano maria a 35[grados]C por 1 min y los espermatozoides moviles fueron obtenidos por centrifugacion a 700 x g por 1 0 min a temperatura ambiente.

El pelet fue removido y resuspendido en TL-Hepes y centrifugado a 250 x g por 5 min a temperatura ambiente. Despues de remover el sobrenadante los espermatozoides fueron resuspendidos en medio de fertilizacion. La concentracion espermatica fue determinada usando camara de Neubauer (Boeco, Germany) y se le adiciononaron 2 [micron]l de suspension espermatica a cada gota de fertilizacion a una concentracion final de 1 x [10.sup.6] espermatozoides/ml. Despues de 1 8 horas de fertilizacion los presuntos cigotos fueron llevados a medio de desarrollo.

Cultivo in-vitro de embriones

Pasadas las 1 8 horas de fertilizacion, los presuntos cigotos obtenidos por los dos metodos de fertilizacion previamente descritos, fueron lavados tres veces en medio TL-Hepes suplementado con 0.3 % (W/V) de BSA (libre de acidos grasos) y 0.2 mM de acido piruvico. Durante los lavados los cigotos fueron desnudados de sus celulas del cumulos mediante repetidos flushing usando una pipeta de punta fina para luego ser llevados al medio de cultivo. El cultivo de los embriones fue llevado a cabo en dos tipos de medios. Para el tratamiento I se utilizo el medio de desarrollo CR1-aa producido en nuestro laboratorio y para el tratamiento II se utilizo un medio KSOM comercial evolve[R] (Zenith Biotech ZEHG-050).

Los presuntos cigotos fueron transferidos en grupos de 10 a gotas de 50 micron]l de medio de desarrollo cubiertas con aceite mineral y preincubadas por un tiempo minimo de 2 horas bajo las condiciones de cultivo. La division fue evaluada al dia 3 y la tasa de morulas y blastocistos fue evaluada al dia 7 de cultivo.

Analisis estadistico

La comparacion entre el porcentaje de ovocitos clivados y de embriones obtenidos con los medios de desarrollo CR1aa y KSOM (evolve[R]) se realizo mediante un analisis de varianza y una prueba de Fisher. El analisis estadistico fue realizado usando el paquete estadistico Statgraphics Centurion XV.

Resultados

Para el presente estudio, un total de 48 8 y 63 1 ovocitos fueron usados para conformar los grupos de estudio del medio KSOMaa (evolve[R]) y el CR1 aa, respectivamente (ver tabla 2). Las tasas de clivaje en el grupo donde se utilizo KS OMaa (evolve[R]) fue del 83% mientras que las tasas de clivaje obtenidas en el medio CR1 aa fueron del 44%, encontrandose una diferencia significativa (P<0.05). De igual forma, se encontro diferencia entre los blastocistos producidos (0% vs 1 5%) con el medio KSOMaa (evolve[R]) y el CR1 aa, respectivamente (ver figura 1).

Valores en la misma columna con diferente letra (a, b,) indican diferencia significativa (p<0.05).

[FIGURA 1 OMITIR]

Discusion

Diferentes estrategias han sido utilizadas para formular medios exclusivos para la produccion in vitro de embriones (2, 17). El exito para cultivar embriones de mamifero ha sido logrado gracias a un mejor entendimiento de los requerimientos nutricionales obtenidos por alteraciones en las condiciones de cultivo Sin embargo, a pesar de las recientes mejoras en los medios y sistemas de PIV, la produccion de embriones sigue siendo limitada. El principal inconveniente en la PIV es el cultivo in vitro de los presuntos cigotos hasta el estado de blastocisto, lo cual sugiere que el cultivo de los embriones postfertilizacion es un periodo de importancia critica en el proceso que va a afectar la produccion de blastocistos (10).

En el presente estudio, la tasa de clivaje y de blastocistos fue significativamente mas alta con el medio KSOMaa (evolve[R]) que con el CR1aa (p<0. 05). Sin embargo, la composicion de los medios es muy similar y solo se encuentran una ligeras diferencias. Estos medios de cultivo junto con el SOF son los medios mas comunes utilizados para el desarrollo embrionario en condiciones in vitro en la especie bovina. Por lo tanto, se puede inferir que algo diferente a la composicion de sales, de carbohidratos, de lipidos y de proteinas afecto el desempeno del medio CR1aa preparado en nuestro laboratorio.

Todos los reactivos con los que se prepararon los diferentes medios fueron adquiridos en S igma (S an Luis, USA) y recomendados por la casa comercial para ser utilizados en el cultivo de embriones. A los diferentes medios, tambien se les realizo control de calidad a nivel de pH, osmolaridad, tiempo de gasificacion. La incubadora tambien fue sometida a controles de temperatura, C[O.sub.2] y humedad relativa.

El agua es uno de los componentes fundamentales en el trabajo del laboratorio, ya que es la base de los medios de cultivo, congelacion y transferencia. Los medios de cultivo se producen con agua ultrapura, libre de pirogenos (13). En el presente estudio, el agua utilizada para realizar el medio de FIV y el medio de cultivo de embriones CR1aa fue suministrada por un equipo Milli Q (tipo Organex, Nihon Millipore Ltda; Tokyo Japaon).

Varios estudios han indicado que los embriones bovinos, son extremadamente sensibles a la calidad del agua con la cual se prepara el medio, ademas, el desarrollo embrionario temprano en los bovinos es seriamente afectado por el metodo de purificacion y el periodo de almacenamiento del agua (3, 11, 19). Se ha encontrado que cuando se utiliza en los medios de cultivo agua altamente purificada Milli-Q y recien obtenida la tasa de blastocistos bovina es significativamente mas alta con respecto a otros tipos de agua como la clorhidratada, desionizada y la doblemente destilada (11).

Se ha demostrado, que tanto el agua ultrapura Milli-Q como el agua comercialmente disponible (sigma W3500) pueden generar tasas de blastocistos comparables en presencia de BSA; sin embargo, los blastocistos obtenidos en el medio preparado con agua Milli-Q son de mejor calidad en terminos de ICM/total de celulas embrionarias (3).

Contrario a los resultados obtenidos por otros autores, en este trabajo se encontro que los medios preparados con agua Milli-Q afecta negativamente la tasa de clivaje y la tasa de blastocistos. Por tal motivo, se puede inferir que las tasas de clivaje y blastocistos en el medio CR1 aa fueron bajas quiza por la contaminacion con electrolitos y compuestos organicos que disminuyen la capacidad de desarrollo embrionario al actuar como agentes embriotoxicos. Lo cual tambien sugiere que al no hacer el debido control de calidad con el equipo de agua Miili-Q, los filtros perdieron la capacidad de desionizar y eliminar eficazmente todas las posibles impurezas y toxicos (por ejemplo metales pesados) antes de las osmosis reversa.

Conclusion

Los resultados obtenidos en el presente estudio, nos permiten concluir que las diferencias en las tasas de clivaje y de desarrollo embrionario no se deben tanto a la composicion de los medios CR1aa y KSOM (evolve[R]) sino a la calidad del agua utilizada en la preparacion del medio CR1 aa. Ademas, este estudio muestra como el desarrollo embrionario bovino es un buen sistema para evaluar la calidad del agua utilizada en sistemas biologicos y la necesidad de uno adecuados controles de calidad que permitan monitorear la totalidad de las actividades realizadas en un laboratorio de produccion in vitro de embriones bovinos.

Recibido El 22 de julio de 2009 y aceptado El 20 de noviembre de 2009

BIBLIOGRAFIA

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Vicente Mejia Isaza [1], Santiago Arango Duque [1], Andres Pareja Lopez [2], Omar Camargo Rodriguez [3], Rodrigo Urrego Alvarez [4]

[1] Est MVZ Grupo de Investigacion INCA-CES, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad CES

[2] Zoot MSc. Grupo de Investigacion xxx. Programa de Biologia CES-EIA

[3] MVZ MSc Grupo Biogenesis, Universidad de Antioquia

[4] Zoot MSc Grupo de Investigacion INCA-CES, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad CES. rurrego@ces.edu.co
Tabla 1. Composicion del medio CR1aa y el KSOMaa
en cultivo de embriones bovinos.

Componentes (mM)            CR1    KSOM

NaCI                       114.7   95.0
KCI                          3.1    2.5
K[H.sub.2]P[O.sub.4]               0.35
MgCL
MgS[O.sub.4]                        0.2
NaHC[O.sub.3]               26.2   25.0
Ca[Cl.sub.2]                        1.7
[Na.sub.2]HP[O.sub.4] 24            2.0
Na piruvato                  0.4    0.2
Na lactato                         10.0
Ca lactato                   5.0
Glucosa                             0.2
Glutamina                    1.0    1.0
EAA ([micron]l/ml)            10     10
NEAA ([micron]l/ml)           20     20

Tabla 2. Desarrollo embrionario bovino en
dos medios de cultivo diferentes

Metodo de       Ovocitos   Clivados   Clivaje
fertilizacion     (n)        (n)        (%)

CRIaa             631        275       44 (a)
KSOMaa            488        404       83 (b)

Metodo de       Blastocistos   Blastocistos
fertilizacion       (n)            (%)

CRIaa               0.0            0.0 (a)
KSOMaa               60             15 (b)

Valores en la misma columna con diferente letra (a, b,)
indican diferencia significativa (p<0.05).
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Author:Mejia Isaza, Vicente; Arango Duque, Santiago; Pareja Lopez, Andres; Camargo Rodriguez, Omar; Urrego
Publication:Revista CES Medicina Veterinaria y Zootecnia
Date:Jul 1, 2009
Words:3125
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