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Estudio in vitro de la deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena muy larga con afectacion muscular.

IN VITRO STUDY OF VERY LONG CHAIN ACYL-COA DEHYDROGENASE DEFICIENCY WITH MUSCULAR INVOLVEMENT

INTRODUCCION

El diagnostico de la deficiencia de VLCAD, ademas de la clinica, involucra otros hallazgos, como una baja actividad enzimatica de la misma. Los analisis bioquimicos en estos pacientes informan niveles elevados de C14n9 en el analisis de acidos grasos libres en plasma, por cromatografia de gases; niveles elevados de acidos dicarboxilicos desde C6 hasta C14 en el analisis de acidos organicos en orina, por cromatografia de gases acoplada a espectrometria de masas; y niveles altos de las acilcarnitinas C14:1, C14 y C16 en el analisis de sangre por espectrometria de masas en tandem (1). Las acilcarnitinas producidas luego de la oxidacion mitocondrial de acidos grasos, pueden salir de la mitocondria y acumularse en el medio de cultivo, mientras que los tioesteres acil-CoA formados, quedan confinados en la mitocondria debido a su incapacidad para atravesar la membrana mitocondrial (2). A partir de ese precepto, Nada et al. (3) disenaron un metodo para el diagnostico de las deficiencias de la [beta]-oxidacion mitocondrial de los acidos grasos, mediante la incubacion de fibroblastos utilizando acido [17,17,18,18-2H4]-9,12-octadecadienoico, (acido linoleico deuterado), en presencia de L-carnitina; utilizando espectrometrometria de masas en tandem, para medir las acilcarnitinas deuteradas en el medio de cultivo. Mediante ese procedimiento, se consigue establecer el diagnostico de varias deficiencias de la [beta]-oxidacion mitocondrial, pero a pesar de ser una tecnica altamente sensible y precisa, tiene el inconveniente de la accesibilidad para numerosos laboratorios en el mundo, dado los costos que implica, por lo que se han disenado otras tecnicas que determinan acilcarnitinas en medios de cultivo de fibroblastos por cromatografia de gases acoplada a espectrometria de masas con monitoreo selectivo de un ion (GC-CI-MS y GC-MS) (4). En este trabajo se presentan los resultados de la incubacion de fibroblastos con acido oleico deuterado, detectando metabolitos por cromatografia de gases acoplada a espectrometria de masas, en pacientes que sufren VLCAD caracterizada por afectacion muscular. El presente estudio analizo la produccion de intermediarios por incubacion de fibroblastos con acido oleico deuterado, como herramienta diagnostica en pacientes con deficiencia de VLCAD.

MATERIALES Y METODOS

El presente estudio es de tipo experimental. El material biologico empleado fue 10 cultivos diferentes de fibroblastos normales y de tres pacientes con deficiencia de VLCAD que presentaban episodios de miopatia con rabdomiolisis. Como sustrato fue empleado el acido oleico deuterado (Cambridge Isotope Laboratories). Fueron utilizados los siguientes compuestos deuterados para la preparacion de la curva de calibracion: [8,8,8-d3]octanoil-L-carnitina.HCl, [10,10,10-d3]decanoil-L-carnitina. HCl, [12,12,12-d3]dodecanoil-L-carnitina. HCl, [14,14,14-d3]tetradecanoil-L-carnitina. HCl, [16,16,16-d3]hexadecanoil-L-carnitina. HCl (Ten Brinx-Free University Amsterdam). Como estandar interno fue adicionado acido undecanodioico (Fluka), durante el proceso de extraccion de las muestras.

Cultivo de fibroblastos. Los fibroblastos (420 pasajes) fueron cultivados en medio de cultivo similar al medio basal Eagle's con bicarbonato y HEPES [4-(2-hidroxietil)-1-acido piperazinaetano sulfurico], (MEM: medio minimo esencial), suplementado con suero de bovino recien nacido 10% (v/v) y gentamicina 1% (v/v) a 37[grados]C, en estufa con 5% C[O.sub.2]/95% de aire. Despues de alcanzar el punto de confluencia (80-100%), las celulas fueron lavadas dos veces con PBS (buffer fosfato salino), la solucion se tripsinizo (1 ml de tripsina-EDTA a 37[grados]C), y posteriormente se neutralizo mediante la adicion de 3-5 ml de MEM. Las celulas fueron transferidas y centrifugadas a 337 X g (5 min, 20[grados]C) en tubos conicos de 10 ml (0,8-1,2 mg proteina), quedando listas para ser incubadas en presencia de sustratos deuterados. Se utilizo el metodo de Lowry et al. (5) para la determinacion de proteinas.

Oxidacion de acido oleico deuterado en fibroblastos. Para la oxidacion de acido oleico deuterado en fibroblastos fue utilizada la tecnica disenada por Osorio (6); se preparo una solucion de medio de cultivo con una concentracion final de 0,15 mM de acido acido oleico deuterado, 1 mM BSA, y L-carnitina 0,2 mM. La incubacion por los fibroblastos se llevo a cabo de la siguiente manera: despues de la tripsinizacion, las celulas fueron resuspendidas en MEM enriquecido en frascos falcon de 2,5 ml (2 frascos por caso). Despues de 72 h de incubacion, el medio de cultivo fue recogido mediante centrifugacion y almacenado a -20[grados]C hasta su analisis. Las celulas se resuspendieron en 1 ml de PBS1 para proceder a la determinacion de proteinas. El analisis cuantitativo se baso en el metodo del estandar interno. Se prepararon curvas de calibracion para los acidos grasos C8, C10, C12 y C14, en un rango de 0 a 150 nM, y C16 en un rango de 0-1000 nM, utilizando acilcarnitinas deuteradas en el ultimo carbono, diluidas en MEM (p < 0,00001 para cada curva de calibracion). El analisis de los acidos grasos de los medios enriquecidos (curvas de calibracion y productos de la incubacion) fue realizado despues de la hidrolisis con KOH. Las curvas de calibracion se obtuvieron mediante el analisis de regresion lineal, representando la relacion de concentraciones de cada acido respecto al estandar interno frente a la relacion de areas.

Condiciones de la cromatografia gas-liquido.

Flujo de gas portador (He): 1 ml/min; division de flujo: 1:30; tiempo de inyeccion: 1 min 5 segundos; temperatura del inyector: 250[grados]C; temperatura del horno y programacion de temperaturas: T1 70[grados]C a 6[grados]C/min, T2 250[grados]C a 20[grados]C/ min hasta T3 300[grados]C; volumen de inyeccion: 1 ml; tiempo total: 38,5 min. Las condiciones de la espectrometria de masas fueron las siguientes: el analisis cualitativo se realizo por cromatografia de gases-espectrometria de masas, con impacto electronico y monitorizacion selectiva de iones. Para cada acido se monitorizo el ion M-15, ya que es el ion selectivo y uno de los mas abundantes; la ionizacion se realizo por impacto electronico a 70 eV y la fuente de iones se mantuvo a una temperatura de 200[grados]C. La temperatura del analizador fue de 100[grados]C; para la adquisicion de datos, el instrumento utilizo un scanning repetitivo en un rango de 40 a 600 unidades de masa atomica. Fue utilizado un cromatografo de gases 5890 Series II Plus (Espectrometro de masas Hewlett Packard serie 5972, Palo Alto, CA, ano 2000).

El manejo de datos se hizo utilizando Microsoft Excel y Minitab Statistical Software.

De acuerdo con el articulo 11 literal a. de la Resolucion No. 8430 de 1993 del Ministerio de Salud, de Normas Cientificas, Tecnicas y Administrativas para la Investigacion en Salud, el presente estudio es considerado sin riesgo. Los pacientes firmaron consentimiento informado y el trabajo fue aprobado por el respectivo Comite de Etica.

El autor declara no tener conflicto de intereses alguno.

RESULTADOS

En todas las curvas de calibracion se obtuvo un coeficiente de correlacion superior al 0,99. La Figura 1 muestra el cromatograma GC-MS-SIM de acidos grasos en fibroblastos incubados con acido 2-oleico deuterado. Los acidos grasos saturados no deuterados corresponden a la oxidacion del acido palmitico del medio de cultivo. Se observaron solamente los metabolitos deuterados de 12, 14 y 16 atomos de carbono (D2C12:1), (D2C14:1), (D2C16:1), respectivamente, producto de la degradacion del acido oleico deuterado. La Tabla 1 muestra las concentraciones observadas para los diferentes acidos grasos deuterados. Con el analisis estadistico mediante la prueba t de Student se encontro diferencia significativa (p < 0,05) entre los datos de los pacientes y los de los controles, para los acidos grasos deuterados de 14 y 16 atomos de carbono.

[FIGURA 1 OMITIR]

DISCUSION

La enzima acil-CoA deshidrogenasa de cadena muy larga (VLCAD) es un homodimero de 154-Kda (7) y su cADN consta de una region de 2.177 bp codificando un peptido lider de 40 aminoacidos y un polipeptido maduro de 615 aminoacidos, para un total de 655 aminoacidos en la proteina entera (8). Esta enzima es especifica para acil-CoAs de 14-24 atomos de carbono y cataliza mas del 90% de la deshidrogenacion del palmitoil-CoA (C16) (9, 10). El gen se encuentra localizado en el cromosoma 17p13 (11) y esta enzima es considerada un paso limitante en la oxidacion de acidos grasos de cadena larga (12). Con base en la clinica presentada en esta deficiencia se han informado 3 fenotipos: una forma infantil severa (10), una forma de presentacion mas benigna que se presentan tambien en la ninez (13) y una forma muscular, la cual se manifiesta despues de la ninez (14). Mas recientemente estas variantes han sido descritas respectivamente como VLCAD-C por presentar cardiomiopatia dilatada, VLCAD-H caracterizada por episodios de hipoglicemia, y VLCAD-M en la cual se presentan episodios de miopatia con rabdomiolisis (15). La deteccion de metabolitos intermediarios de la [beta]-oxidacion mitocondrial de los acidos grasos, ha sido ampliamente estudiada (16-18). La espectrometria de masas en tandem sigue siendo el metodo mas efectivo para detectar alteraciones en esta via metabolica (19). Sin embargo, es una tecnica que no esta disponible para muchos laboratorios, por lo cual se deben buscar otras alternativas. El uso de fibroblastos para el analisis del funcionamiento de la [beta]-oxidacion mitocondrial de los acidos grasos, mediante la incubacion con diferentes sustratos ha sido plenamente documentada (20-22). La tecnica de analisis de acidos grasos mediante GC/MS ha probado ser efectiva para este tipo de analisis; en trabajos anteriores, trabajando con acido palmitico deuterado, han sido encontrados elevados los niveles de diferentes acidos grasos, despues de hidrolizar las acilcarnitinas presentes en el medio de cultivo de los fibroblastos de los pacientes que presentaban deficiencias de la [beta]-oxidacion mitocondrial de los acidos grasos (6). En el presente estudio ha sido encontrado un perfil que muestra incremento en los niveles de varios acidos grasos deuterados luego de realizar incubacion de fibroblastos de pacientes con deficiencia de VLCAD-M con acido oleico deuterado, principalmente, metabolitos de 14 (D2C14:1) y 16 (D2C16:1) atomos de carbono. Estos resultados refuerzan el diagnostico, toda vez que en otros estudios in vitro de esta deficiencia, al ser incubados con acido palmitico deuterado, tambien se ha encontrado alterado el perfil metabolico (23). La principal ventaja de este metodo, es la posibilidad de obviar el uso de espectrometria de masas en tandem, dada la dificultad para implementar esta tecnica por costos, en algunos laboratorios. La metodologia es similar a la utilizada para realizar incubaciones con acido palmitico deuterado, sin embargo, el uso del acido oleico deuterado facilita la discriminacion entre los diferentes tipos de deficiencia de VLCAD, mostrando los acidos grasos insaturados que se acumulan en cada tipo de deficiencia, caso que no es posible cuando se incuban los fibroblastos con un acido graso saturado deuterado como el palmitico.

DOI: 10.17151/biosa.2015.14.1.5

REFERENCIAS

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Jose Henry Osorio [1]

[1] pH D, Departamento de Ciencias Basicas de la Salud, Universidad de Caldas. Manizales, Colombia. Correo electronico: jose.osorio_o@ucaldas.edu.co

Recibido: mayo 7 de 2014 - Aceptado: enero 23 de 2015.
Tabla 1. Produccion de acidos grasos deuterados en fibroblastos
incubados con acido oleico deuterado.

ACIDOS GRASOS     PROMEDIO    INTERVALO   PROMEDIO     p
INTERMEDIARIOS    CONTROLES   CONTROLES   VLCAD-M
(nmol/mg
proteina/72 h)

D2C12:1              3,6       2,8-4,2      2,9        --
D2C14:1              2,9       1,9-5,1      20,1     0,0234
D2C16:1              3,2       2,5-3,8      10,9     0,0148

Abreviaturas: Acidos grasos deuterados de 12 atomos de carbono
(D2C12:1) dodecenoico deuterado; de 14 atomos de carbono
(D2C14:1) tetradecenoico duterado; de 16 atomos de carbono (D2C16:1)
hexadecenoico deuterado, producto de la degradacion
del acido oleico deuterado.
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Title Annotation:acilcarnitinas C14:1, C14 y C16
Author:Osorio, Jose Henry
Publication:Biosalud
Date:Jan 1, 2015
Words:2859
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