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Estudio de resistencia a la rifampicina y la dapsona en tres pacientes con recurrencia de lepra.

RESUMEN

Objetivo. Detectar la presencia de cepas de Mycobacterium leprae resistentes a la rifampicina y la dapsona en tres pacientes con recurrencia de lepra y sospecha clinica de resistencia antimicrobiana, mediante la aplicacion de tecnicas moleculares.

Metodos. Se realizo un estudio descriptivo retrospectivo en tres pacientes multibacilares del Sanatorio de Agua de Dios, Cundinamarca, Colombia, que habian presentado recidivas de lepra documentadas por su historia clinica, baciloscopia y biopsia. Se obtuvieron biopsias de lesiones cutaneas que se procesaron para la extraccion y purificacion del ADN bacilar. Se amplificaron regiones de los genes rpoB y folP1 asociadas con la resistencia antimicrobiana, mediante la reaccion en cadena de la polimerasa "touch-down" y se secuenciaron los productos amplificados mediante el metodo de Sanger.

Resultados. Se detecto una mutacion puntual en el nucleotido 1367 del gen rpoB en dos de las muestras estudiadas. No se encontro la mutacion estudiada en el gen folP1 en ninguno de los tres pacientes.

Conclusiones. La mutacion identificada demostro la presencia de bacilos de M. leprae resistentes a la rifampicina en dos de los tres pacientes estudiados con recurrencia de la enfermedad. No se detecto la mutacion indicadora de resistencia a la dapsona en ninguno de los tres pacientes.

Palabras clave

Mycobacterium leprae, lepra, resistencia microbiana a las drogas, rifampicina, dapsona, reaccion en cadena de la polimerasa, Colombia.

Study of refampin and dapsone resistance in three patients with recurring leprosy

ABSTRACT

Objective. To detect the presence of rifampin- and dapsone-resistant strains of Mycobacterium leprae in three patients with recurring leprosy and clinically-suspected antimicrobial resistance through molecular techniques.

Methods. A retrospective, descriptive study was conducted of three multibacillary patients at the "Agua de Dios" Sanitarium in Cundinamarca, Colombia, that presented leprosy relapses that were documented by medical history, bacilloscopy, and biopsy. Biopsies were taken of the skin lesions and the bacteria were subject to DNA extraction and purification. Regions of the rpoB and folP1 genes associated with antimicrobial resistance were amplified and subjected to touch-down polymerase chain reaction and the amplified products were sequenced using the Sanger method.

Results. A punctual mutation was identified in nucleotide 1367 of the rpoB gene in two of the samples studied. This mutation was not found in the folP1 gene of any of the three patients.

Conclusions. The mutation identified showed strains of rifampin-resistant M. leprae in two of the three patients with recurring leprosy. Mutations that indicate dapsoneresistance were not detected in any of the three patients.

Key words

Mycobacterium leprae, leprosy, drug resistance, rifampin, dapsone, polymerase chain reaction, Colombia.

**********

Hasta 1982, el tratamiento de la lepra se baso en la monoterapia con dapsona. La emergencia de cepas de Mycobacterium leprae resistentes a este antimicrobiano (1) hizo que la Organizacion Mundial de la Salud (OMS) recomendara el uso de la poliquimioterapia (PQT), que combina tres antibioticos: dapsona, clofazimina y rifampicina (2). La base de la PQT es la rifampicina, ya que es el componente con mayor actividad bactericida, incluso mayor que la de nuevos antimicrobianos empleados especificamente contra M. leprae (3, 4). La funcion principal de la dapsona y la clofazimina es garantizar la eliminacion de las poblaciones de M. leprae resistentes a la rifampicina (3). El uso de este esquema terapeutico ha permitido reducir eficazmente la prevalencia global de la enfermedad, aunque en los paises con mayor endemia, la incidencia ha permanecido estable (5) y se ha observado una mayor frecuencia de la recurrencia de la enfermedad. Esta recurrencia se ha constatado en pacientes con lepra multibacilar que presentaban un alto indice de infeccion al inicio del tratamiento y que se siguieron durante varios anos despues de terminada la PQT (6, 7).

Tambien se ha documentado la presencia de cepas de M. leprae resistentes a los antimicrobianos empleados en la PQT, entre ellos la rifampicina (8-11). Aunque esta modalidad terapeutica ha limitado la diseminacion de la resistencia a la dapsona, se siguen notificando casos resistentes a este medicamento, incluso en areas donde la PQT se ha aplicado exitosamente (8, 12, 13). Ademas, se ha informado de posibles cepas de M. leprae resistentes a multiples antimicrobianos, responsables de la recurrencia en casos tratados con monoterapia y PQT (9, 11).

La OMS ha planteado la necesidad de vigilar la emergencia de la resistencia a los antimicrobianos, principalmente a la rifampicina, ya que esto puede reducir significativamente la eficacia del tratamiento y obstaculizar la erradicacion de la lepra (10, 14).

La prueba estandar para determinar la susceptibilidad antimicrobiana de M. leprae es la tecnica de la almohadilla plantar del raton, que ademas de costosa, demora entre 6 y 12 meses en dar resultados y esta disponible en pocos laboratorios (1). Debido a estas limitaciones, se han desarrollado diferentes tecnicas moleculares basadas en la deteccion de mutaciones puntuales en los genes rpoB y folP1 de M. leprae, las cuales se utilizan como marcadores de resistencia a la rifampicina y la dapsona, con una alta correlacion con la prueba estandar (8-11, 15, 16). Esto se basa en diversas investigaciones que han demostrado que esas mutaciones puntuales en los genes rpoB y folP1 son las responsables de la resistencia de M. leprae a la rifampicina y la dapsona, respectivamente (8, 15, 16). Se ha podido predecir la resistencia antimicrobiana de algunos aislamientos mediante diversa tecnicas de biologia molecular que detectan estas mutaciones (9-11).

En el municipio de Agua de Dios, departamento de Cundinamarca, Colombia, donde funciono un sanatorio de reclusion obligatoria para enfermos de lepra entre 1872 y 1961, se han presentado casos de recurrencia de la enfermedad en los que han concurrido factores de riesgo para la aparicion de cepas resistentes de M. leprae (17). El objetivo de este estudio fue detectar la presencia de cepas de M. leprae resistentes a la rifampicina y la dapsona en tres pacientes de ese municipio con recurrencia de lepra y sospecha clinica de resistencia antimicrobiana, mediante la aplicacion de tecnicas moleculares.

MATERIALES Y METODOS Pacientes

Se realizo un estudio descriptivo retrospectivo en tres pacientes del Sanatorio de Agua de Dios, de Cundinamarca, Colombia, que presentaron de uno a tres episodios de recurrencia de la enfermedad, por lo que se sospechaba que estaban infectados por una cepa resistente a antibioticos (17). Todos los pacientes habian recibido monoterapia con dapsona por mas de dos decadas, pero de forma irregular, con dosis variables y no supervisadas, y los pacientes 1 y 2 habian recibido ademas PQT administrada en iguales condiciones. En el cuadro 1 se muestran los datos principales de los tres pacientes.

Obtencion y procesamiento de las muestras De cada paciente con recurrencia --documentada por su historia clinica, baciloscopia y biopsia-- se tomo una muestra de las lesiones cutaneas que se conservo en etanol al 70% (18). Esta muestra se utilizo para el analisis molecular de la cepa infectante mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (RCP) en el Laboratorio del Grupo de Microbiologia Molecular de la Universidad de La Sabana, Chia, Colombia. La extraccion y la purificacion del ADN bacilar se realizaron por los metodos de choque termico (19) y digestion enzimatica con proteinasa K, respectivamente, con el estuche DNeasy[R] Tissue (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). Se estandarizo la tecnica de RCP denominada touch-down para amplificar regiones de los genes rpoB y folP1 asociadas con la resistencia a la rifampicina y la dapsona, respectivamente (8-11, 15, 16). Para el gen rpoB se utilizaron los cebadores descritos previamente (15), que amplifican un fragmento de 394 pares de bases (pb), y para el gen folP1 se utilizaron los iniciadores 5'CAGGACGTCGAGGCGATCAC-3' y 5'-TCCTCGTCAGCGGTCAAGTA-3', que amplifican un fragmento de 389 pb. Se emplearon las mismas concentraciones de reactivos y condiciones del termociclador para ambas reacciones.

La RCP se realizo en un volumen final de 25 [micron]L de solucion tampon de MgCl2 1,5 mM que contenia 1 pM de cada iniciador, 2 [micron]M de cada trifosfato de desoxinucleosido, 2,5 unidades (U) de polimerasa Taq (Promega, Madison, Wisconsin, Estados Unidos de America) y 5 [micron]L de muestra. Se empleo un termociclador iCycler (BioRad, Hercules, California, Estados Unidos) con el siguiente programa: 5 min de desnaturalizacion inicial a 95[grados]C; 11 ciclos de 1 min de desnaturalizacion a 95[grados]C, 1 min de anillamiento a 68[grados]C (con una disminucion de 1[grados]C por cada ciclo hasta llegar a 58[grados]C) y 2 min de extension a 72[grados]C; seguidos de 27 ciclos de 1 min de desnaturalizacion a 95[grados]C, 1 min de anillamiento a 57[grados]C y 2 min de extension a 72[grados]C; y un paso final de extension por 30 segundos a 72[grados]C. Como control positivo se empleo el ADN bacilar extraido de una biopsia de piel de un paciente con diagnostico confirmado de lepra lepromatosa por historia clinica, baciloscopia y biopsia. Como control negativo de la reaccion se uso agua ultrapura y ADN extraido de una biopsia de piel de un paciente con diagnostico de cicatriz hipertrofica, sin signos ni antecedentes de lepra. Los productos de la RCP se verificaron por electroforesis en gel de agarosa al 2% coloreado con 0,2 [micron]g/mL de bromuro de etidio y se visualizaron en un sistema foto-documentador con luz ultravioleta (GelDoc XR, Bio-Rad).

Secuenciacion del ADN

Se secuencio el producto de la amplificacion mediante el metodo de Sanger (20) con un secuenciador automatico ABI Prism (Applied Biosystems, Foster City, California, Estados Unidos). Los cromatogramas se editaron con el programa Chromas v. 1.45 (Technelysium, Queensland, Australia) y el analisis bioinformatico se realizo mediante el alineamiento local con el modulo Water del programa Emboss (21), usando como patron de comparacion las secuencias de una cepa sensible a la dapsona y de otra sensible a la rifampicina (codigos de acceso Z14314 y AB028656, respectivamente, en la base de datos GenBank). Se identifico la posicion de los nucleotidos sustituidos mediante los tres sistemas de referencia descritos (15, 22, 23) y se compararon con las mutaciones publicadas (8-11, 15, 16).

RESULTADOS

Genotipificacion de los genes rpoB y folP1 de M. leprae

En las muestras de los pacientes 1 y 2 se detecto una mutacion puntual en el gen rpoB, localizada en el nucleotido 1367 (TCG [flecha diestra] TTG), que produce un cambio de serina por leucina en la posicion 456 de la secuencia aminoacidica, segun el sistema de numeracion empleado en la base de datos Leproma (23) (cuadro 2). No se observaron cambios en la secuencia del gen rpoB de M. leprae en el paciente 3, ni en la secuencia del gen folP1 en ninguna de las tres muestras estudiadas. El control positivo empleado mostro ADN de M. leprae sin mutaciones en las regiones estudiadas de los genes rpoB y folP1. Los controles negativos no evidenciaron la presencia del ADN bacilar.

DISCUSION

En este estudio se demostro por primera vez la presencia de cepas de M. leprae resistentes a la rifampicina en Colombia. Ademas. A pesar de haberse documentado en las historias clinicas de los tres pacientes estudiados el tratamiento inadecuado con dapsona, no se encontro la mutacion estudiada de resistencia a este medicamento.

La tecnica empleada, basada en la RCP con secuenciacion del ADN bacilar amplificado (24), es la mas confiable para identificar mutaciones y en esta investigacion permitio detectar una mutacion en el gen rpoB en las cepas de M. leprae que portaban los pacientes 1 y 2. Esta modificacion, descrita inicialmente por Honore y Cole (15), es especifica de las cepas que poseen resistencia a la rifampicina y, como lo han confirmado otros autores mediante la tecnica de la almohadilla plantar del raton, esta es la mutacion que se presenta con mayor frecuencia (24). Los resultados de los estudios moleculares concuerdan con los antecedentes y la evolucion clinica de los pacientes: un tratamiento irregular y la recurrencia de la enfermedad, condiciones asociadas con el desarrollo de la resistencia a antimicrobianos y con la resistencia secundaria a la rifampicina (2, 9, 11, 24). El paciente 3 no habia recibido rifampicina, lo que es consecuente con el hecho de que en las muestras de su biopsia no se detecto la mutacion en el gen rpoB, propia de cepas con resistencia a ese antibiotico.

La deteccion de mutaciones puntuales en el gen folP1 ha sido identificada con una alta frecuencia en las cepas de M. leprae que presentan resistencia alta o intermedia a la dapsona (8, 12, 25, 26). A pesar de que estos tres pacientes recibieron tratamiento con dapsona de manera prolongada e irregular, en sus muestras no se detectaron mutaciones en la region secuenciada del gen folP1, lo cual podria indicar que aun son sensibles a la dapsona. No obstante, la evolucion clinica de estos pacientes indica que presentan resistencia secundaria a la dapsona. Varias hipotesis podrian explicar este resultado: la presencia de bacilos con una baja resistencia, no detectable mediante las tecnicas moleculares, que no se correlaciona con las manifestaciones clinicas (8, 13, 25, 26); la presencia de porinas y mecanismos de eflujo que permiten el transporte del medicamento al exterior de la bacteria, como se ha descrito en otras micobacterias (27, 28); o que las muestras tuvieran una mezcla de bacilos sensibles y resistentes en diferentes proporciones y que la amplificacion y secuenciacion del genotipo dominante correspondiera al de los bacilos sensibles a la dapsona, como han sugerido otros autores (16, 25).

A pesar del reducido numero de casos estudiados, los presentes resultados permiten afirmar que la metodologia molecular empleada puede ayudar a detectar tempranamente una posible recidiva. Esta metodologia permitio estudiar sendas regiones de los genes rpoB y folP1 que contienen mutaciones asociadas con la resistencia antimicrobiana. Sin embargo, existen otras regiones genicas que podrian presentar mutaciones relacionadas con la resistencia a antibioticos y que deben ser objeto de estudio.

Debido a la frecuencia con que se ha observado la recidiva de lepra en pacientes tratados con monoterapia de dapsona durante anos (17) es recomendable realizar un seguimiento clinico y baciloscopico anual a fin de detectar tempranamente las posibles recidivas.

Agradecimientos. El presente estudio recibio financiamiento del Fondo Patrimonial Especial de La Universidad de La Sabana, Chia, Colombia, y del Instituto Colombiano de Medicina Tropical del Instituto de Ciencias de la Salud (ICMT-CES) y el convenio CSUI-CMTNIH/NIAID RO1-AI5-37720. Los autores agradecen al personal de salud del Sanatorio de Agua de Dios y a Tiberio Rodriguez, auxiliar tecnico del Programa de Lepra, por su apoyo en la busqueda de las historias clinicas.

Manuscrito recibido el 29 de enero de 2007. Aceptado para publicacion, tras revision, el 23 de noviembre de 2007.

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Elkin Hernandez,(1) Nora Cardona-Castro, (2) Gerzain Rodriguez, (1) Sonia Villegas, (1) Camilo Beltran, (2) Miyako Kimura, (3) Varalakshmi D. Vissa (3) y Yenny Gomez (1)

(1) Universidad de La Sabana, Facultad de Medicina, Chia, Colombia. La correspondencia se debe dirigir a Yenny Milena Gomez, Universidad de La Sabana, Campus Universitario Puente del Comun, Autopista Norte km 21, Chia, Colombia. Correo electronico: yenny.gomez1@unisabana.edu.co

(2) Instituto Colombiano de Medicina Tropical-CES, Sabaneta, Colombia.

(3) Colorado State University, Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Fort Collins, Colorado, Estados Unidos de America.
CUADRO 1. Caracteristicas clinicas de los pacientes con
recurrencia de lepra estudiados, Colombia

                      Diagnostico      Tipo y periodo de
Caso   Edad   Sexo    inicial, ano   tratamiento previo (a)

 1      57    M (c)   LL (d), 1958     DDS (e) 1960-1982
                                       PQT (f) 1983-1997
 2      69    M       LL, 1954         DDS 1954-1982
                                       PQT 1982-1984
 3      62    M       LL, 1961         DDS 1961-1984
                                       PQT: desconocido

       No. de recurrencias
            y anos de           Diagnostico de
Caso      su diagnostico      la recurrencia (b)

 1     3 (1999, 2002, 2005)           LL

 2           1 (2005)                 LL

 3           1 (2004)                 LL

(a) Tratamiento irregular, con dosis variables y no supervisado.

(b) Diagnostico por historia clinica, baciloscopia y biopsia.

(c) Masculino.

(d) Lepra lepromatosa.

(e) Dapsona.

(f) Poliquimioterapia.

CUADRO 2. Mutacion detectada (elementos subrayados) en el gen rpoB
de Mycobacterium leprae en las muestras de los pacientes 1 y 2,
Colombia

                        Secuencia del gen rpoB de M. leprae
                             y sus aminoacidos deducidos

                     Cepas sensibles a
Tipo de secuencia    la rifampicina         Muestras estudiadas

Nucleotidica         CGG CTG TCG GCG CTG    CGG CTG TTG GCG CTG
Aminoacidica         Arg Leu Ser Ala Leu    Arg Leu Leu Ala Leu

                        Posicion de la mutacion, segun
                         diversos sistemas numeracion

                      Telenti        Honore     Leproma (c)
                     y col. (a)    y Cole (b)

Nucleotidica            1592          1274         1367
Aminoacidica            531           425          456

(a) Referencia 22.

(b) Referencia 15.

(c) Referencia 23.
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Title Annotation:Investigacion original
Author:Hernandez, Elkin; Cardona-Castro, Nora; Rodriguez, Gerzain; Villegas, Sonia; Beltran, Camilo; Kimura
Publication:Revista Panamericana de Salud Publica
Date:Feb 1, 2008
Words:3699
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