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Estudio de la Microbiota del Proceso de Produccion de Almidon Agrio de Yuca.

INTRODUCCION

El almidon es un polisacarido de reserva energetica de los vegetales (Witczak et al., 2015), es extraido de la yuca y utilizado de forma nativa (sin modificaciones) y con modificaciones fisicas, quimicas, enzimaticas o combinadas en las industrias de textiles, papel, adhesivos, farmaceuticas y de alimentos. En Colombia, dicho almidon es extraido de las raices y se le llama almidon dulce; segun su uso final, en algunos casos sufre de un proceso de fermentacion natural dando como resultado el almidon agrio (Vargas Aguilar et al., 2012). Este ultimo se obtiene de forma artesanal en establecimientos rurales agroindustriales llamados rallanderias cuyo producto principal es el almidon hidrolizado, conocido como almidon agrio utilizado en la industria panadera (Velasco, 2008). En las rallanderias se toman las raices frescas, se lavan y con unas aspas giratorias por friccion entre ellas mismas, se remueven las cascaras. Posteriormente, se quitan las puntas y las raices se llevan al rallador, en el que se libera el almidon separandose los granulos de las fibras. De esta ultima etapa depende el rendimiento en la obtencion de almidon, porque un rallado muy fino provoca dano fisico en los granulos, una sedimentacion mas lenta y un rapido deterioro enzimatico. Finalmente, la extraccion termina en unos canales en los que el almidon se sedimenta y despues de retirar la fase acuosa, se seca y se obtiene el almidon nativo (Alarcon y Dufuor, 1998). Sin embargo, la etapa de extraccion de almidon puede verse afectada por varios factores artificiales que influyen en el rendimiento del almidon, incluyendo las condiciones de secado de las materias primas (Olomo y Ajibola, 2003), el tiempo de la cosecha y el almacenamiento de la raiz, debido a que este disminuye el contenido de almidon (Benesi et al., 2008; Benesi et al., 2004). Todos estos factores pueden ser controlados y con una cuidadosa seleccion de los parametros, puede maximizarse el rendimiento de la obtencion de almidon.

Este tipo de almidon es utilizado como aditivo en diferentes industrias o para su posterior fermentacion y obtencion de almidon agrio, el cual se lleva en tanques de fermentacion y se cubre por una capa del liquido sobrenadante de la sedimentacion en periodos que van 20 a 90 dias (Alarcon y Dufuor, 1998). Este almidon es usado en la fabricacion de productos de panaderia tradicionales y se obtiene en procesos cuyos parametros no estan bien definidos, por lo cual existe variacion en la calidad del producto final (Acosta, 2006), al darse de manera natural y bajo condiciones ambientales, no esta controlado, ni estandarizado, y no se aplican los principios de Buenas Practicas de Manufactura (BPM) (Cadena et al., 2006). Sin embargo, esta etapa depende de la presencia de microorganismos amiloliticos que degradan parcialmente el almidon, produciendose azucares simples que constituyen a su vez, el sustrato de microorganismos productores de acidos organicos, como lactico, propionico, acetico y butirico (Nunes y Cereda, 1994). Este ultimo paso implica la presencia de Bacterias Acido Lacticas (BAL) de los generos Streptococcus, Lactococcus y Lactobacillus, ademas, de levaduras del genero Saccharomyces (Cardenas y Buckle, 1980; Figueroa et al., 1995; George et al., 1995), siendo las BAL mas abundantes que las levaduras (Parada et al., 1996).

Cereda (1975) concluyo que este proceso fermentativo se desarrolla en tres fases; en la primera, se desarrolla una microbiota poco exigente, que consiste principalmente en los grupos coliformes y mesofilos aerobios. En la segunda, intervienen microorganismos mas exigentes identificados como productores de acidos organicos, muchos de los cuales pertenecen a las BAL, y se caracterizan por ser microaerofilos o anaerobios; en cambio, en la tercera fase predominan las levaduras saprofitas. De las anteriores etapas, la acidificacion lactica junto con la energia suficiente de los rayos UV, dan como resultado la depolimerizacion parcial de las moleculas del almidon, lo cual produce pequenos fragmentos lineales. Estos ultimos, junto con algunos radicales, ayudan a la reticulacion de las moleculas de almidon restantes, formando una red tridimensional que se traduce en las propiedades de expansion del almidon agrio durante la coccion (Alarcon y Dufuor, 1998).

Debido a las condiciones ambientales, a la falta de estandarizacion y a la diversidad microbiana en las que se dan los procesos de extraccion y fermentacion del almidon de yuca, se puede dar una mayor variabilidad en la obtencion de dicho almidon. Por lo tanto, el objetivo de esta investigacion fue identificar y seleccionar algunos microorganismos con actividad amilolitica que intervienen en cada una de las etapas de la produccion de almidon agrio.

MATERIALES Y METODOS

Se describe la obtencion de muestras microbianas, la siembra y aislamiento de microorganismos, la identificacion de los aislados y la determinacion de capacidad amilolitica en lo que sigue.

Obtencion de muestras microbianas

Se recolectaron muestras de varias etapas del proceso de extraccion y fermentacion de almidon, de una rallanderia localizada en el municipio de Sampues, departamento de Sucre, Colombia; figura 1. Se tomaron un total de 40 muestras al azar, sin repeticiones; 22 liquidas, cada una aproximadamente de 200 mL y 18 solidas cada una de 500 g peso humedo, posteriormente fueron llevadas a bolsas esteriles Nasco Whirlpak, divididas en muestras del proceso de extraccion y proceso de fermentacion; cinco muestras liquidas y una solida provenientes del primer proceso: desde los flujos de entrada de agua y entrada a la sedimentacion, flujos de salida del rallador y salida del colador y agua que queda como sobrenadante en la sedimentacion (agua de fermentacion). La muestra solida corresponde al almidon extraido. Ademas, del segundo proceso (fermentacion), se tomaron 17 muestras solidas y 17 liquidas procedentes de cuatro tipos de tanques. En el lugar, a cada una de las muestras liquidas se les midio pH y temperatura. Las muestras fueron transportadas en contenedores de plastico esteriles refrigerados al laboratorio de Microbiologia de Aguas y Alimentos de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellin y al laboratorio de microbiologia de la fundacion intal y almacenadas a 4 [+ o -] 2 [grados]C hasta el momento de los analisis.

Siembra y aislamiento de microorganismos

Una vez recolectadas y transportadas las muestras, se procedio a inocularlas en diferentes medios de cultivo solidos: agar tripteina soya (TSA) para microorganismos viables a 37 [+ o -] 2[grados]C por 24 a 48 horas, dicloran rosa de bengala-cloranfenicol (DRBC) para hongos a 25 [+ o -] 2[grados]C de 3 a 5 dias, Man Rogosa y Sharpe (MRS) para bacterias acido lacticas a 37 [+ o -] 2[grados]C por 72 horas en camaras con anaerocult y agar nutritivo enriquecido con 0,1% p/v de almidon soluble para microorganismos con actividad amilolitica a 37 [+ o -] 2[grados]C por 24 a 48 horas; por el metodo de agotamiento en superficie. Posteriormente, a cada uno de los cultivos microbianos se les realizo el recuento de Unidades Formadoras de Colonia (UFC)/mL mediante la tecnica de recuento en placa en superficie. Para esto se inoculo 0.1 mL de las diluciones 102 y 104 en cajas Petri con los medios de cultivo esteriles. Los conteos se realizaron en cuenta colonias. Ademas, se realizo la prueba de actividad amilolitica y se seleccionaron las cajas con mejor actividad, para asi, aislarlas, purificarlas e identificarlas (Madigan et al. 2014).

El aislamiento de las colonias se realizo teniendo en cuenta las condiciones aerobias y aquellas que presentaron mejor actividad amilolitica. En el caso de los mohos y las levaduras se inocularon en agar extracto de levadura glucosa cloranfenicol (YGC) a 22 [+ o -] 2[grados]C durante 5 dias y las bacterias en agar Nutritivo enriquecido con almidon a 37 [+ o -] 2[grados]C por 24 a 48 horas. Se procedio a la purificacion de cada uno de los aislados, con base, a la caracterizacion macroscopica de la colonia con el uso del estereoscopio y microscopio y la morfologia del microorganismo como tal, mediante el microscopio por medio de la tincion de Gram (Rojas-Trivino 2011).

Identificacion de los aislados.

Al azar, dieciocho aislados fueron identificados por pruebas bioquimicas. Una vez caracterizados macroscopica y microscopicamente se llevaron a analisis al laboratorio de Tecnimicro, Medellin, donde se utilizo el equipo Vitek 2 Compact 60, version instalada Systems 06.01 de BioMerieux, que consta de una serie de tarjetas para levaduras (YST), bacilos formadores de esporas Gram positivos (BCL), bacilos Gram negativos (GN), cocos y bacilos no formadores de esporas Gram positivos (GP) impregnadas con reactivos colorimetricos, los cuales se inocularon con la suspension del cultivo puro. El perfil se interpreto de manera automatica. Cada una de las tarjetas cuenta con 64 pozos y se midieron las actividades enzimaticas como consecuencia de la produccion de metabolitos que cambian el pH hacia acido o alcalino y son detectados por los indicadores de pH presentes en cada sustrato. Finalmente, el equipo arrojo una probabilidad de identificacion del microorganismo segun la comparacion que realiza con su base de datos que da una precision de 93% para GP, 94% para GN, 87% para BCL y 84% para YST. (BioMerieux 2015).

Determinacion de capacidad amilolitica

A cada aislamiento puro, se le determino la actividad amilolitica, inoculando los microorganismos en cajas de Petri con Agar Nutritivo enriquecido con 0.1% p/v de almidon soluble, incubadas a 37[grados]C + 2[grados]C durante 24 a 48 horas y 25[grados]C +2[grados]C por 120 horas, bacterias y levaduras respectivamente. Posteriormente, se adiciono al cultivo microbiano una cantidad de solucion de yodo (KI-5,0% p/v y I 2-0,5% p/v). La presencia de un complejo helicoidal entre amilosa y yodo, da lugar al tipico azul profundo de dispersiones de almidon tenidos con yodo (McGrance, Cornell, y Rix 1998). La formacion de halos claros o transparentes mayores a 1 mm de radio alrededor del crecimiento demostraron la actividad amilolitica; a mayor halo mayor actividad, por lo que la distancia de la zona desde el borde de la colonia hasta el limite externo, demuestran la capacidad del microorganismo de hidrolizar dicho sustrato (Madigan et al. 2014).

RESULTADOS Y DISCUSION

Se presentan los resultados de la caracterizacion de las muestras recolectadas, de la caracterizacion microbiana y de la identificacion de los aislados y la actividad amilolitica de los aislados

Caracterizacion de las muestras recolectadas

Se tomaron muestras de todo el proceso en la rallanderia, desde la extraccion hasta la fermentacion del almidon, figuras 2 a 5, y datos de temperaturas y pH. Para el segundo proceso, tambien se tuvo en cuenta el tiempo que llevaba el almidon en el mismo.

La ralanderia en la cual se realizo la recoleccion se encuentra ubicada en la periferia del municipio de Sampues, Sucre; en esta region se cultiva yuca, por lo que esta no sufre de largas distancias de transporte que afecte su procesamiento, cuenta con una temperatura promedio de 32 [grados]C y una humedad relativa de 74%. Se registraron temperaturas desde 25 hasta 39.5 [grados]C en los procesos (extraccion y fermentacion), las cuales no presentaron un cambio drastico, y corresponden a la temperatura ambiental del lugar y la hora de la toma de muestra (cerca al mediodia), a excepcion de la temperatura del agua de entrada, la cual no se encuentra expuesta a las mismas condiciones ambientales. Estas temperaturas favorecen el crecimiento y metabolismo de microorganismos mesofilos.

Por el contrario, en el proceso de fermentacion, llevado a cabo en diferentes tipos de tanques; de cemento (TC), de plastico blanco cubico (TP), de plastico negro cilindrico de 1000 L (TR) y de plastico negro cilindrico de 2000 L (TRG) y en el liquido para la fermentacion (AS) se presento una disminucion de pH, que alcanzo valores de 3.3 que difieren del valor promedio de la extraccion (6.6 + 1.4) posiblemente por la produccion de acidos organicos de los microorganismos asociados al proceso (Marcon et al. 2006). El cambio que muestra el pH no presenta una relacion directa con el numero de dias de la fermentacion, esto puede explicarse por la degradacion de almidon que genera moleculas de glucosa precursoras de la sintesis de acidos. Como es un sistema expuesto al ambiente, la superficie es susceptible a contaminaciones que alteren los datos al interior de este. Estos valores de pH registrados corresponden a los reportados por Cadena (2006) que se encuentran en un intervalo de pH de 3 a 6, quienes tampoco observaron una tendencia de estos datos en comparacion con el numero de dias de fermentacion, ni con las caracteristicas tecnologicas que presentan las diferentes rallanderias que fueron evaluadas en ese trabajo.

Caracterizacion microbiana

Durante el proceso de extraccion, los recuentos de mohos y levaduras oscilaron entre 2 x[10.sup.5] 2 y 1.5x[10.sup.5] 4 UFC/mL, y las BAL entre 55 y 21x[10.sup.5] 5 UFC/mL. Por otra parte, en el proceso de fermentacion para la obtencion de almidon agrio, los mohos y levaduras se cuantificaron en un intervalo de >10 hasta 28 x[10.sup.5] 4 UFC/mL y las BAL de 14 x[10.sup.5] 2 hasta 15 x 108 UFC/mL. No todas las muestras dieron positivo a la prueba de hidrolisis realizada con lugol Tabla 1. Figueroa (Figueroa, Davila, y Pourquie 1995) y Ampe (Ampe, Sirvent, y Zakhia 2001) observaron en la fermentacion natural de yuca, que los grupos microbianos predominantes son BAL ([10.sup.8] a [10.sup.9] UFC log/g) y levaduras (101 a 104 log UFC/g).

Aunque, el recuento microbiano no arrojo una tendencia clara de la presencia o cantidad de los mismos en las etapas del proceso extraccion y fermentacion, ni en los diferentes dias de fermentacion, es posible observar una menor cantidad de mohos, en algunos casos <10 y un aumento de BAL que alcanza 1.5 x 109 UFC/mL en la etapa fermentativa, lo cual concuerda con la disminucion del pH en la misma. Asimismo, los aislados de mejor actividad amilolitica provenian de las muestras que correspondian a 3 dias diferentes de fermentacion, 2 de salidas del proceso y el agua que queda luego de la sedimentacion.

Se purificaron y aislaron un total de 29 colonias de levaduras diferentes y 47 colonias bacterianas diferentes (datos no mostrados), la mayoria bacilos esporulados y como era de esperarse muchas de estas presentaban caracteristicas muy semejantes entre ellas. Aunque, la caracterizacion macro y microscopica es util para diferenciar, no garantiza que no se trata del mismo microorganismo, por lo tanto, es necesario hacerle un perfil bioquimico amplio o una caracterizacion molecular. Dadas las condiciones de pH, un numero significativo de cepas bacterianas es encontrado en el agua inicial de la fermentacion

Identificacion de los aislados

Mediante identificacion bioquimica y posterior comparacion en las bases de datos se encontraron 12 microorganismos diferentes.

Saccharomyces cerevisiae. Encontrada en el agua de fermentacion. El crecimiento obtenido presento caracteristicas macroscopicas de colonias de textura cremosa, forma circular, borde entero y superficie lisa y caracteristicas microscopicas de levadura. Este microorganismo es una levadura facultativa, cuando crece en medios anerobios ricos en glucosa, maltosa, fructosa o sacarosa, produce etanol y CO2. Se utilizo la tarjeta YGC para su identificacion que obtuvo un 95% de probabilidad. Detalles bioquimicos: LysA (-), IMLTa (-), LeuA (+), ARG (-), ERYa (-), GLYLa(-), TyrA (-), BNAG (-), ARBa (-), AMYa (-), dGALa (+), GENa (-), dGLUa (+), LACa (-), MadGa (-), dCELa (-), GGT (-), dMALa (-), dRAFa (+), NAGA1 (-), dMNEa (+), dMELa (-), dMLZa (-), ISBEa (-), IRHAa (-), XLTa (-), dSORa (-), SACa (+), URE (-), AGLU (-), dTURa (-), dTREa (+), NO3a (-), IARA (-), dGATa (+), ESC (-), IGLTa (-), dXYLa (-), LATa (-), ACEa (+), CITa (-), GRTas (-), IPROa (-), 2KGa (-), NAGa (-), dGNTa (-).

Leuconostoc mesenteroides ssp. Destranicum. Encontrada en el agua de fermentacion. Estas colonias presentaron unas caracteristicas de crecimiento macroscopicas de textura cremosa, forma circular y borde entero, y microscopica de bacilos Gram positivos. Estas bacterias producen dextranos a partir de glucosa, es anaerobia facultativa y se encuentra presente en vegetales. Se obtuvo un 88% de probabilidad utilizando la tarjeta GP. Detalles bioquimicos: AMY (+), PIPLC (-), dXYL (-), ADH1 (-), BGAL (+), AGLU (+), APPA (-), CDEX (-), AspA (-), BGAR (-), AMAN (-), PHOS (-), LeuA (-), ProA (-), BGURr (-), AGAL (+), PyrA (-), BGUR (-), AlaA (-), TyrA (-), dSOR (-), URE (-), POLYB (+), dGAL (-), dRIB (-), ILATk (-), LAC (+), NAG (-), dMAL (+), BACI (+), NOVO (+), NC6.5 (-), dMAN (-), dMNE (+), MBdG (+), PUL (-), dRAF (-), O129R (+), SAL (+), SAC (+), dTRE (+), ADH2s (-), OPTO (+).

En uno de los tanques de fermentacion de cemento (1) y en el agua de fermentacion se encontro Bacillus amyloliquefaciens. Presento caracteristicas macroscopicas (borde irregular, planas y consistencia mucosa) y microscopicas de bacilos Gram positivos esporulados. Este bacilo es aerobio, productor de a-amilasa y se encuentra facilmente en el suelo. En los dos casos fue usada la tarjeta BCL y se logro un 88% de probabilidad de la muestra provenente del tanque de fermentacion y un 94% de probabilidad del agua de fermentacion. Detalles bioquimicos de la muestra del tanque de fermentacion: BXYL (+), LysA (-), AspA (-), LeuA (+), PheA (+), ProA (-), BGAL (+), PyrA (+), AGAL (+),AlaA (-), TyrA (+), BNAG (-), APPA (+), CDEX (+), dGAL (-), GLYG (-), INO (+), MdG (+), ELLM (-), MdX (-), AMAN (-), MTE (+), GlyA (+), dMAN (+), dMNE (-), dMLZ (-), NAG (-), PLE (-), IRHA (-), BGLU (+), BMAN (-), PHC (-), PVATE (-), AGLU (+), dTAG (-), dTRE (+), INU (-), dGLU (+), dRIB (-), PSCNa (-), NaCl 6.5% (+), KAN (-), OLD (-), ESC (+), TTZ (-), POLYB_R (-). Detalles bioquimicos en que difiere la muestra del agua de fermentacion de la del tanque de fermentacion: TyrA (-),GLYG (+),GlyA (-), dMNE (+), PLE (+), PVATE (+), INU (+), dGLU (+), dRIB (+),TTZ (+), POLYB_R (+).

En la muestra del agua de salida del colador, se encontro Streptococcus mutans. El crecimiento obtenido presento caracteristicas macroscopicas (colonias de forma circular, textura cremosa y planas) y microscopica de bacilos Gram positivos cortos. Es un microorganismo anaerobio facultativo, acidofilo, metaboliza sacarosa para producir polisacaridos, frecuente en la cavidad bucal humana.Se obtuvo un 99% de probabilidad utilizando la tarjeta GP. Detalles bioquimicos: AMY (+), PIPLC (-), dXYL (-), ADH1 (-), BGAL (-), AGLU (-), APPA (-), CDEX (-), AspA (-), BGAR (-), AMAN (-), PHOS (-), LeuA (+), ProA (-), BGURr (-), AGAL (-), PyrA (-), BGUR (-), AlaA (+), TyrA (-), dSOR (+), URE (-), POLYB (-), dGAL (-), dRIB (-), ILATk (-), LAC (-), NAG (+), dMAL (+), BACI (+), NOVO (+), NC6.5 (-), dMAN (+), dMNE (+), MBdG (+), PUL (-), dRAF (-), O129R (-), SAL (+), SAC (+), dTRE (+), ADH2s (-), OPTO (+).

En el agua de salida del colador, el agua de fermentacion y uno de los tanques de fermentacion de cemento (1) se encontro Bacillus vallismortis. Se presentaron caracteristicas macroscopicas (colonias de textura mucosa, planas, borde irregular y opacas) y microscopicas de bacilos Gram positivos esporulados. Estas son bacterias aerobias, que hidrolizan almidon, y estan presentes en suelo. Utilizando en los tres casos la tarjeta BCL se obtuvo un 85% de probabilidad en el agua de salida del colador y un 93% de probabilidad en el agua de fermentacion y uno de los tanques de fermentacion. Detalles bioquimicos: BXYL (+), LysA (+), AspA (-), LeuA (+), PheA (-), ProA (-), BGAL (+), PyrA (+), AGAL (+),AlaA (-), TyrA (-), BNAG (-), APPA (+), CDEX (+), dGAL (-), GLYG (+), INO (-), MdG (+), ELLM (+), MdX (-), AMAN (-), MTE (+), GlyA (-), dMAN (+), dMNE (+), dMLZ (-), NAG (-), PLE (+), IRHA (-), BGLU (+), BMAN (-), PHC (-), PVATE (-), AGLU (+), dTAG (-), dTRE (-), INU (-), dGLU (-), dRIB (-), PSCNa (-), NaCl 6.5% (+), KAN (-), OLD (-), ESC (+), TTZ (-), POLYB_R (+). Detalles bioquimicos en que se diferencia la muestra del agua de fermentacion de la muestra del sagua a la salida del colador: INO (+),PVATE (+), AGLU (-), dTRE (+), INU (+), dGLU (+), dRIB (+). Detalles bioquimicos en que es diferente la muestra del tanque de fermentacion de la muestra del agua de la salida del colador: LeuA (-), INO (+), PVATE (+), AGLU (-), dTRE (+), INU (+), dGLU (+), dRIB (+),

En uno de los tanques de fermentacion de plastico negro cilindrico de 1000 L (1) se encontro Candida famata. El crecimiento de estas colonias presento caracteristicas macroscopicas (colonias de textura cremosa, consistencia blanda y superficie lisa) y microscopicas de levaduras. Estas pueden fermentar glucosa, galactosa y sacarosa, es variable a almidon, asociada a la cavidad bucal humana. 85% de probabilidad utilizando la tarjeta YST. Detalles bioquimicos: LysA (-), IMLTa (+), LeuA (+), ARG (+), ERYa (- ), GLYLa(+), TyrA (-), BNAG (-), ARBa (+), AMYa (-), dGALa (+), GENa (-), dGLUa (+), LACa (+), MadGa (+), dCELa (+), GGT (+), dMALa (+), dRAFa (+), NAGA1 (-), dMNEa (+), dMELa (+), dMLZa (+), ISBEa (-), IRHAa (-), XLTa (-), dSORa (+), SACa (+), URE (-), AGLU (+), dTURa (+), dTREa (+), NO3a (-), IARA (+), dGATa (+), ESC (+), IGLTa (+), dXYLa (+), LATa (+), ACEa (+), CITa (+), GRTas (+), IPROa (+), 2KGa (+), NAGa (+), dGNTa (+).

En uno de los tanques de fermentacion de cemento (2) se encontro Aeromonas salmonicida. Estas colonias presentaron caracteristicas macroscopicas (colonias de borde entero, opacas y superficie lisa) y microscopicas de bacilos Gram negativos. Esta bacteria es anaerobia facultativa, presente en un medio acuoso y suelo. Patogena en peces. Usando la tarjeta GN se obtuvo un 92% probabilidad. Detalles bioquimicos: APPA (-), ADO (-), PyrA (+), IARL (-), dCEL (-), BGAL (-), H2S (-), BNAG (-), AGLTp (-), dGLU (-), GGT (-), OFF (-), BGLU (-), dMAL (-), dMNE (-), BXYL (-), BAlap (-), ProA (+), LIP (-), PLE (-), TyrA (-), URE (-), dSOR (-), SAC (-), dTAG (-), dTRE (-), CIT (-), MNT (-), 5KG (-), ILATk (+), AGLU (-), SUCT (-), NAGA (-), AGAL (-), PHOS (-), GlyA (-), ODC (-), LDC (-), IHISa (-), CMT (-), BGUR (-), O129R (-), GGAA (- ), IMLTa (-), ELLM (+), ILATa (-).

En la salida del colador y un tanque de fermentacion de cemento (3) se encontro Sphingomonas paucimobilis. El crecimiento obtenido presento caracteristicas macroscopicas (colonias de consistencia blanda, planas y superficie lisa) y microscopicas de cocobacilos Gram negativos. Este microorganismo es aerobio, patogeno, se encuentra facilmente en un medio acuoso y suelo. En los dos casos se utilizo la tarjeta GN, para la muestra de la salida del colador se obtuvo un 93% de probabilidad y para el tanque de fermentacion un 88% de probabilidad. Detalles bioquimicos de la muestra de la salida del colador: APPA (+), ADO (-), PyrA (-), IARL (-), dCEL (-), BGAL (-), H2S (-), BNAG (-), AGLTp (+), dGLU (+), GGT (-), OFF (- ), BGLU (-), dMAL (-), dMNE (-), BXYL (-), BAlap (-), ProA (-), LIP (+), PLE (-), TyrA (+), URE (-), dSOR (-), SAC (-), dTAG (-), dTRE (-), CIT (-), MNT (-), 5KG (-), ILATk (+), AGLU (+), SUCT (+), NAGA (-), AGAL (-), PHOS (+), GlyA (+), ODC (-), LDC (-), IHISa (-), CMT (+), BGUR (-), O129R (-), GGAA (+), IMLTa (-), ELLM (+), ILATa (-). Detalles bioquimicos en que difiere la muestra del tanque de fermentacion: APPA (-), dCEL (+), BGAL (+), AGLTp (-), GGT (+), BGLU (+), dMAN (+), dMNE (+), BXYL (+), LIP (-), SAC (+), dTAG (+), dTRE (+), ILATk (-), AGLU (-), SUCT (-), PHOS (-), GlyA (-), CMT (-), GGAA (-), ELLM (-).

En uno de los tanques de fermentacion de plastico negro cilindrico de 2000 L se encontro Acinetobacter Iwolfii: El crecimiento obtenido presento caracteristicas macroscopicas (colonias de borde entero, opacas, consistencia blanda y superficie lisa) y microscopicas de bacilos largos Gram negativos. Es aerobio, patogeno, frecuente en el suelo. 92% de probabilidad utilizando la tarjeta GN. Detalles bioquimicos: APPA (-), ADO (-), PyrA (-), IARL (-), dCEL (-), BGAL (-), H2S (-), BNAG (-), AGLTp (-), dGLU (-), GGT (-), OFF (-), BGLU (-), dMAL (-), dMAN (-), dMNE (-), BXYL (-), BAlap (-), ProA (-), LIP (-), PLE (-), TyrA (+), URE (-), dSOR (-), SAC (-), dTAG (-), dTRE (-), CIT (+), MNT (-), 5KG (-), ILATk (+), AGLU (-), SUCT (+), NAGA (-), AGAL (-), PHOS (-), GlyA (+), ODC (-), LDC (-), IHISa (-), CMT (+), BGUR (-), O129R (-), GGAA (-), IMLTa (- ), ELLM (+), ILATa (-).

En uno de los tanques de fermentacion de plastico negro cilindrico de 1000 L (2) se encontro Cryptococcus laurentii. El crecimiento obtenido presento caracteristicas macroscopicas (colonias de borde entero, opacas, superficie lisa) y microcopicas de levaduras. Es un hongo patogeno, saprofito, no fermenta glucosa, sacarosa ni lactosa y asociado al suelo. Con la tarjeta YST arrojo un 87% de probabilidad. Detalles bioquimicos: LysA (+), IMLTa (+), LeuA (+), ARG (+), ERYa (-), GLYLa(+), TyrA (+), BNAG (-), ARBa (+), AMYa (-), dGALa (+), GENa (-), dGLUa (+), LACa (+), MadGa (-), dCELa (-), GGT (+), dMALa (+), dRAFa (+), NAGA1 (-), dMNEa (+), dMELa (+), dMLZa (-), ISBEa (+), IRHAa (-), XLTa (-), dSORa (-), SACa (+), URE (+), AGLU (+), dTURa (-), dTREa (+), NO3a (-), IARA (+), dGATa (+), ESC (+), IGLTa (+), dXYLa (+), LATa (+), ACEa (+), CITa (+), GRTas (+), IPROa (+), 2KGa (+), NAGa (+), dGNTa (+).

En el agua de salida del colador, el agua de fermentacion y uno de los tanques de fermentacion de plastico se encontro Bacillus cereus. El crecimiento obtenido presento caracteristicas macroscopicas (crecimiento de colonias de consistencia mucosa, planas y opacas) y microscopicas de Bacilos Gram positivos esporulados. Es aerobio, causa intoxicacion alimentaria y es frecuente en el suelo. En los tres casos se utilizo la tarjeta BCL, se obtuvo un 93% de probabilidad para la muestra del agua a la salida del colador, un 95% de probabilidad para la muestra del agua de fermentacion y un 89% de probabilidad para la muetsra del tanque de fermentacion. Detalles bioquimicos de la muestra de la salida del colador: BXYL (-), LysA (-), AspA (-), LeuA (-), PheA (+), ProA (-), BGAL (-), PyrA (-), AGAL (-),AlaA (-), TyrA (-), BNAG (+), APPA (-), CDEX (-), dGAL (-), GLYG (-), INO (-), MdG (-), ELLM (+), MdX (-), AMAN (-), MTE (+), GlyA (-), dMAN (-), dMNE (-), dMLZ (-), NAG (-), PLE (-), IRHA (-), BGLU (-), BMAN (-), PHC (-), PVATE (+), AGLU (-), dTAG (-), dTRE (+), INU (-), dGLU (+), dRIB (+), PSCNa (-), NaCl 6.5% (+), KAN (+), OLD (-), ESC (+), TTZ (-), POLYB_R (+). Detalles bioquimicos de la muestra del agua de fermentacion: PyrA (+), APPA (+), ELLM (-). Detalles bioquimicos de la muestra del tanque de fermentacion: LeuA (+), PyrA (+), TyrA (+), APPA (+), MTE (-).

En uno de los tanques de fermentacion de cemento (4) se encontro Geotrichum capitatum. Las colonias presentaron caracteristicas macroscopicas (textura cremosa, elevacion convexa y borde entero) y microscopicas de levaduras. Hongo levaduriforme patogeno, ambiental cosmopolita. 93% de probabilidad utilizando la tarjeta YST. Detalles bioquimicos: LysA (+), IMLTa (-), LeuA (+), ARG (+), ERYa (-), GLYLa(+), TyrA (+), BNAG (-), ARBa (-), AMYa (-), dGALa (-), GENa (-), dGLUa (+), LACa (-), MadGa (-), dCELa (-), GGT (-), dMALa (-), dRAFa (-), NAGA1 (-), dMNEa (+), dMELa (-), dMLZa (-), ISBEa (+), IRHAa (-), XLTa (-), dSORa (-), SACa (-), URE (+), AGLU (-), dTURa (-), dTREa (-), NO3a (-), IARA (-), dGATa (+), ESC (-), IGLTa (+), dXYLa (-), LATa (+), ACEa (+), CITa (-), GRTas (+), IPROa (+), 2KGa (+), NAGa (-), dGNTa (+).

En Colombia, la fermentacion de almidon de yuca se utiliza para la produccion de almidon agrio, llevado a cabo principalmente, en condiciones de anaerobiosis y la cual requiere de una etapa posterior de secado. Sin embargo, hay pocos estudios relacionados con el aislamiento e identificacion de microorganimos aerobios procedentes de estos procesos. Sanchez (Sanchez H. et al. 2005), encontraron en muestras de almidon de yuca: 8 colonias del genero Bacillus, una de Kurtia y otra de Clostridium, identificadas bioquimicamente; por otro lado, Ampe (2001) reporto Lactobacillus plantarum, Lactobacillus cellobiosus, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextranicum, Weisella paramesenteroides, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis, Lactobacillus manihotivorans, Streptococcus salivarius y Lactobacillus casei, identificados molecularmente. Asimismo, Omar (Omar et al. 2000) en otros estudios, encontro las mismas especies de Lactobacillus y adicionalmente, reporta Lactobacillus hilgardii, Lb. buchneri y Lb. fermentum.

En este estudio, tambien se aislaron microorganismos patogenos como Aeromonas salmonicida, Sphingomonas paucimobilis, Acinetobacter lwolfii, Crypctococcus laurentii, Geotricum capitatum causando infecciones hospitalarias entre otros; y en particular Bacillus cereus por su constante presencia en las muestras, a pesar de su capacidad amilolitica, genera riesgo de intoxicacion diarreica y emetica por consumo en alimentos. Los cuales deben ser descartados para futuros procesos de fermentacion industrial o extraccion de enzimas. Actualmente, los productos de estas modificaciones artesanales son utilizados para la industria de la panaderia, por lo que sufren un proceso termico que es suficiente para evitar efectos negativos que pueden provocar estos patogenos. Sin embargo, esto depende del buen procesamiento en la coccion o de la concentracion de estos en el producto final

Por el contrario, Bacillus amiloliquefaciens y Bacillus vallismortis serian buenos candidatos para procesos de almidones modificados, debido a su capacidad de hidrolizar almidon, caracteristica principal en la cual se baso esta investigacion y que difiere de otros estudios. Kimaryo (2000) sugiere la inoculacion con una o varias especies o cepas de BAL seleccionadas para proporcionar un mejor control y calidad de productos fermentados de almidon de yuca, como el kivunde en Tanzania. Sin embargo, Quintero (2012) sugiere el uso de Aspergillus niger.

Por su alta actividad amilolitica, varias cepas proporcionan azucares tales como glucosa o maltosa que puede ser utilizado como una fuente de energia por otros microorganismos, Ampe (2001) sugiere que bacterias como Lb. manihotivorans esta presente solo durante el primer periodo de fermentacion, al degradar el almidon, mientras que Lb. plantarum se encuentra en todo el proceso y contribuye a la acidificacion del producto. Otras investigaciones en la fermentacion de la yuca de Brasil, Lacerda (2005) documento la presencia de los hongos Geotrichum, Galactomyces y Issatchenkia spp.

La presencia de aislamientos patogenos en la produccion natural de almidon agrio muestra la importancia de la implementacion de BPM (Torres et al. 2010). Ademas, estos plantean la necesidad de una produccion estandarizada en la que se garantice que estos cultivos bacterianos se encuentran libres de los mismos. Por otro lado, la identificacion de bacterias amiloliticas se presenta como antecedente para futuros procesos en que se quiera estudiar el uso de una unica cepa o cepas especificas como modificadoras de almidones.

Presencia de hidrolisis de almidon o actividad amilolitica

De los microorganismos aislados y purificados, se descartaron las levaduras y 11 aislamientos de bacterias tras encontrar poca o nula actividad amilolitica (menor a 1 mmm de radio). A un total de 36 aislamientos bacterianos diferentes con actividad amilolitica se les midio el radio del halo de hidrolisis de almidon y se reporta la distancia promedio de los halos y el error estandar, ademas se realizo una comparacion multiple utilizando el procedimiento de diferencia minima significativa (LSD) DE Fischer con un nivel del 95% de confianza (Tabla 2) como metodo de clasificacion de un mayor potencial de produccion de amilasas. Algunos de estos microorganismos provenian de mas de una fuente, por lo que fueron renombradas como FD (fermentacion y salida del rallador), FA (fermentacion y salida del colador), las otras son nombradas solo por la fuente de la que provenian; AD (liquido inicial de fermentacion), DS (salida del rallo), FC (Fermentacion en tanque de cemento).

Los microorganismos con mayores halos de hidrolisis de almidon coinciden con algunos de los identificados como Bacillus amyloliquefaciens (FD1, AD4), Bacillus vallismortis (AD2, FD3, FC5) y Leuconostoc mesenteroides (FC8) son bacterias prometedoras para procesos industriales como la produccion de amilasas o la degradacion de almidon y produccion de dextrinas y etanol, entre otros. Tambien sugiere su uso como bacterias nativas en fermentaciones naturales como la produccion de almidon agrio, de la cual se recolectarion las muestras. Ademas, estas podrian ser parte de procesos de modificacion combinado en el que se requiera una etapa de hidrolisis de almidon, debido a la produccion de azucares como glucosa o maltosa que ademas son fuente energetica de otros tipos de microorganismos.

CONCLUSIONES

En el proceso de produccion artesanal de almidon agrio se caracterizaron macro y microscopicamente un total de 76 aislamientos microbianos aerobios. El almidon nativo en este proceso esta expuesto a diferentes condiciones ambientales, lo que hace que la obtencion de almidon agrio no sea un proceso controlado ni estandarizado. Las condiciones ambientales, asi como el tipo de tanque que se utiliza en la fermentacion, influyen en la variabilidad de la carga microbiana de cada uno de los tanques y mas aun cuando no se presentan condiciones especificas para favorecer o inhibir el crecimiento de ciertos microorganismos de interes.

La identificacion de microorganismos demuestra la variedad de microorganismos presentes en las fermentaciones, entre los que se encontraron Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus vallismortis, Bacillus cereus, Leuconostoc mesenteroides y Saccharomyces cereviseae. Con base en los microorganismos patogenos encontrados, es clara la necesidad de controlar el proceso, usando microorganismos beneficos o no patogenos que posean actividad amilolitica. Los microorganismos patogenos encontrados como Aeromonas salmonicida, Geotrichum capitatum, Sphingomonas paucimobilis, Acinetobacter lwolfii, Crytococcus laurentii y Bacillus cereus evidencian la necesidad de la implementacion de Buenas Practicas de Manufactura en la produccion de almidones agrios.

Este estudio puede ser utilizado como antecedente para investigaciones de mejoramiento de produccion de almidon fermentado, por ejemplo, en los procesos de hidrolisis de almidon, en los que una gran variedad de microorganismos se ven involucrados. Es importante medir la actividad amilolitica de los microorganismos debido a que estas pueden actuar en conjunto en diferentes etapas fermentativas. Ademas, medir la actividad amilolitica en aislamientos, que podrian utilizarse para la extraccion de amilasas en la hidrolisis del almidon.

NOTACION

2KGa: Asimilacion Ceto-D-Gluconato

5KG: 5-Ceto-D-Gluconato

ACEa: Asimilacion Acetato

ADH1: Arginina Dihidrolasa 1

ADH2s: Arginina Dihidrolasa 2

ADO: Adonitol

AGAL: Alfa-Galactosidasa

AGLU: Alfa-Glucosidasa

AGLTp: Glutamil Arilamidasa Pna

AlaA: Alanina-Arilamidasa

AMAN: Alfa-Manosidasa

AMY: D-Amigdalina

AMYa: Asimilacion Amigdalina

APPA: Alanina-Fenilalanina-Prolina-Arilamidasa

ARBa: Asimilacion Arbutina

ARG: Arginina GP

AspA: L-Aspartato Arilamidasa

BACI: Resistencia a Bacitrina

BAlap: Beta-Alanina-Amilamidasa-pNA

BGAL: Beta-Galactosidasa

BGAR: Beta-Galatopiranosidasa

BGLU: Beta-Glucosidasa

BGUR: Beta-Glucoronidasa

BMAN: Beta-Manosidasa

BNAG: Beta-N-Acetil-Glucosaminidasa

BXYL:Beta-Xilosidasa

CDEX: Ciclodextrina

CIT: Citrato (sodio)

CITa: Asimilacion Citrato (sodio)

CMT: Coumarato

dCEL: D-Celobiosa

dCELa: Asimilacion D-Celobiosa

dGAL: D-Galactosa

dGATa: Asimilacion D-Galacturonato

dGALa: Asimilacion D-Galactosa

dGLU: D-Glucosa

dGLUa: Asimilacion D-Glucosa

dGNTa: Asimilacion D-Gluconato

dMAL: D-Maltosa

dMALa: Asimilacion D-Maltosa

dMAN: D-Manitol

dMELa: Asimilacion D-Melibiosa

dMLZ: D-Melesitosa

dMLZa: Asimilacion D-Melesitosa

dMNE: D-Manosa

dMNEa: Asimilacion D-Manosa

dRAF: D-Rafinosa

dRAFa: Asiilacion D- Rafinosa

dRIB: D-Ribosa

dSOR: D-Sorbitol

dSORa: Asimilacion D-Sorbitol

dTAG: D-Tagatosa

dTRE: D-Trealosa

dTREa: Asimilacion D-Trealosa

dTURa: Asimilacion D-Turanosa

dXYL: D-Xilosa

dXYLa: Asimilacion D-Xilosa

ELLM: Ellman

ERYa: Asimilacion Eritritol

ESC: Hidrolisis Esculina

GENa: Asimilacion Gentiobiosa

GGAA: Glutamina-Glicina-Arginina Arilamidasa

GGT: Gamma-Glutamil-Transferasa

GlyA: Glicina-ArIlamidasa

gLyG: Glicogeno

GLYLa: Asimilacion Glicerol

GRTas: Asimilacion Glucuronato

H2S: Produccion de H2S

INO: myo-Inositol

INU: Inulina

LAC: Lactosa

LACa: Asimilacion Lactosa

lARAa: Asimilacion L-Arabinosa

lARL: L-Arabitol

LATa: Asimilacion D-Lactato

LDC: Lisina Decarboxilasa

LeuA: Leucina-Arilamidasa

lGLTa: Asimilacion L-Glutamato

lHiSa: Asimilacion L- Histidina

LIP: Lipasa

lLATa: Asimilacion L-Lactato

lLATk: L- Lactato-Alcanilizacion

lMLTa: Asimilacion L-Malato

lPROa: Asimilacion L-Prolina

lRHAa: Asimilacion Ramnosa

lSBEa: Asimilacion L-Sorbosa

KAN: Resistencia Kanamicina

LysA: L-Lisina-Arilamidasa

MagGa: Asimilacion Metil-D-Glucopiranosido

MBdG: Metil-B-D-Glucopiranosido

MdX: Metil-D-Xilosida

MTE: Maltotriosa

MNT: Malonato

NAG: N-Acetil-D-Glucosamina

NAGa: Asimilacion N-Acetil-Glucosamina

NAGA: Beta-N-Acetil-Galactosamidasa

NAGA1: PNP-N-Acetil-BD- Galactosaminidasa 1

NC 6.5/NaCl 6.5%: Crecimiento en 6.5% NaCl

NO3a: Asimilacion Nitrato

NOVO: Resistencia a Novobiocina

O129R: O/Resistencia 129

ODC: Ornitina Decarboxilasa

ODEC: Base Decarboxilasa

OFF: Fermentacion/Glucosa

OLD: Resistencia Oleandomicina

OPTO: Resistencia a Optochina

PheA: Fenilalanina Arilamidasa

PHC: Fosforil Colina

PHOS: Fosfatasa

PIPLC: Fosfatidilinositol Fosfolipasa C

PLE: Palatinosa

POLYB/ POLYB_R: Resistencia Polimixina B

ProA: L-Prolina-Arylamidasa

PUL: Pululan

PVATE: Piruvato

PSCNa: Asimilacion Putrecina

PyrA: L-Pirrolidonil-Arilamidasa

SAC: Sacarosa/Sucrosa

SACa: Asimilacion Sacarosa/Sucrosa

SAL: Salicina

SUCT: Succinato-Alcalinizacion

TyrA: Tirosina-Arilamidasa

TTZ: Tetrazolium Red

URE: Ureasa

XLTa: Asimilacion Xilitol

doi: 10.4067/S0718-07642016000500002

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a Colciencias, Luz Marina Gomez (Laboratorio de Microbiologia de la Fundacion Intal) Sebastian Ochoa, Rosalba Alzate y Angela Mora del Laboratorio de Microbiologia de Aguas y Alimentos y al Laboratorio de Bioconversiones de la Universidad Nacional de Colombia.

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Laura N. Chiquiza-Montano(1)*, Olga I. Montoya(1), Claudia Restrepo(2) y Fernando Orozco-Sanchez(1)

(1) Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellin, Calle 59A 63-20, Medellin- Colombia. (e-mail: lnchiqui@unal.edu.co)

(2) Fundacion Intal, Carrera 50G # 12S - 91, Itagui, Colombia.

* Autor a quien debe ser dirigida la correspondencia.

Recibido Dic. 21, 2015; Aceptado Feb. 22, 2016; Version final Abr. 22, 2016, Publicado Oct. 2016_

Leyenda: Fig. 1. Proceso de obtencion de almidon agrio a partir de raices de yuca.

Leyenda: Fig. 2. Lavado de yuca.

Leyenda: Fig. 3. Canales de sedimentacion y tanques de fermentacion

Leyenda: Fig. 4. Tanques de fermentacion Rotoplast

Leyenda: Fig. 5. Tanques de fermentacion de plastico
Tabla 1. Carga microbiana muestras proceso produccion
almidon dulce y agrio

Codigo                         Act.           Mohos
                               Amilolitica    (UFC/mL)

Agua de entrada                +              960
Agua salida del rallador       +              3700
Agua salida del colador        +              230
Agua salida al sedimentador    -              650
Agua de fermentacion           +              820
TC 5                           +              10
TC 7                           +              10
TC 8                           +              100
TC 12                          +              20
TC 13                          +              <10
TC 16                          +              <10
TC 17                          +              <10
TC 22                          +              30
TR 4                           +              7500
TR 9                           -              20
TR 15                          -              <10
TRG 1                          -              100
TRG 9                          +              <10
TRG 12                         -              <10
TRG 15                         +              <10
TP 2                           +              940
TP 8                           -              200

Codigo                         Levaduras    BAL (UFC/ mL)
                               (UFC/mL)     x [10.sup.3]

Agua de entrada                1600         0,55
Agua salida del rallador       15000        2100
Agua salida del colador        200          190
Agua salida al sedimentador    4100         5
Agua de fermentacion           4000         420000
TC 5                           100          500
TC 7                           200          1300
TC 8                           56000        3,5
TC 12                          300          5,4
TC 13                          25000        24
TC 16                          55000        15
TC 17                          280000       1400
TC 22                          60           350
TR 4                           8100         500
TR 9                           4600         51
TR 15                          <10          320
TRG 1                          80           1300
TRG 9                          <10          3400
TRG 12                         <10          600
TRG 15                         <10          1,4
TP 2                           150          520
TP 8                           84000        1500000

Tabla 2. Actividad amilolitica en microorganismos aislados
del almidon de yuca en una rallanderia artesanal.

Cod.    D. prom [+ o -] EE (mm)

FD1     7.3 [+ o -] 0.3 (a)
FC5     6.7 [+ o -] 0.6 (abc)
DS9     6.3 [+ o -] 0.3 (abcd)
AD13    6.0 [+ o -] 0.6 (abcde)
AD17    5.7 [+ o -] 0.3 (bcdef)
DS21    5.3 [+ o -] 0.7 (cdef)
AD25    5.3 [+ o -] 0.3 (cdef)
AD29    5.3 [+ o -] 0.9 (cdef)
AD33    4.3 [+ o -] 0.3 (fg)
AD2     7.0 [+ o -] 0.0 (ab)
AD6     6.7 [+ o -] 0.3 (abc)
AD10    6.3 [+ o -] 0.3 (abcd)
AD14    6.0 [+ o -] 0.0 (abcde)
DS18    5.7 [+ o -] 0.9 (bcdef)
FC22    5.3 [+ o -] 0.3 (cdef)
AD26    5.3 [+ o -] 0.9 (cdef)
AD30    5.0 [+ o -] 0.0 (defg)
FC34    4.3 [+ o -] 0.3 (fg)
FD3     6.7 [+ o -] 1.2 (abc)
AD7     6.7 [+ o -] 0.3 (abc)
AD11    6.3 [+ o -] 0.9 (abcd)
AD15    6.0 [+ o -] 0.6 (abcde)
FA19    5.7 [+ o -] 0.9 (bcdef)
AD23    5.3 [+ o -] 0.7 (cdef)
AD27    5.3 [+ o -] 0.3 (cdef)
AD31    5.0 [+ o -] 0.6 (defg)
FC35    4.3 [+ o -] 0.3 (fg)
AD4     6.7 [+ o -] 0.3 (abc)
FC8     6.3 [+ o -] 0.3 (abcd)
AD12    6.3 [+ o -] 0.9 (abcd)
FC16    5.7 [+ o -] 0.3 (bcdef)
FA20    5.7 [+ o -] 0.3 (bcdef)
AD24    5.3 [+ o -] 0.3 (cdef)
DS28    5.3 [+ o -] 0.7 (cdef)
FC32    4.7 [+ o -] 0.3 (efg)
AD36    3.7 [+ o -] 0.7 (g)
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Author:Chiquiza-Montano, Laura N.; Montoya, Olga I.; Restrepo, Claudia; Orozco-Sanchez, Fernando
Publication:Informacion Tecnologica
Date:Oct 1, 2016
Words:7379
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