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Estimulacion de cardenolidos en brotes de Digitalis purpurea L. cultivados in vitro mediante elicitores.

Stimulation of cardenolides production in Digitalis purpurea L. shoot cultures by elicitors addition

Introduccion

Las plantas son consideradas una fuente valiosa para la produccion de compuestos de interes farmaceutico (Fischer et al., 2007). Entre ellas se destacan las pertenecientes al genero Digitalis, siendo Digitalis purpurea L. una de las dos unicas especies de interes economico de dicho genero como fuente de cardenolidos (Sales et al., 2011). Estos compuestos muestran propiedades farmacodinamicas similares pero la digitoxina y la d!goxina son los mas relevantes para la industria farmaceutica (Hornberger et al., 2000). En medicina, estos compuestos son farmacos valiosos en el tratamiento de la insuficiencia cardiaca (Pinol et al., 2008), pero en los ultimos anos se han descrito tambien sus efectos en el control del cancer de rinon, de prostata y leucemia (Lewis, 2009).

El cultivo de plantas es hasta el momento la unica fuente comercial para la produccion de cardenolidos (Kuate et al., 2008), pues la sintesis quimica de estos compuestos no es economicamente viable.

La variacion de las condiciones ambientales que ocurre durante el crecimiento de las plantas en el campo, provoca la fluctuacion y heterogeneidad de las sustancias activas y su concentracion en los extractos obtenidos a partir de ellas (Roca-Perez et al., 2004). Por las razones anteriormente expuestas, es prioritario el desarrollo de estrategias biotecnologicas, especificamente el cultivo de tejidos, para la produccion de estos compuestos activos (Vanisree y Tsay, 2007).

En consecuencia, varios metodos de cultivo in vitro de Digitalis spp. han sido descritos en la literatura cientifica. Tal es el caso del cultivo de suspensiones celulares (Kreis et al., 1986), cultivos embriogenicos (Lindemann y Luckner, 1997), cultivo de raices (Yoshimatzu et al., 1990) y cultivo de brotes (Erdei et al., 1981; Hagimori et al., 1983). Ademas, el cultivo in vitro ha brindado una excelente oportunidad para el desarrollo de investigaciones bioquimicas encaminadas al conocimiento de las rutas que rigen la biosintesis de los cardenolidos (Gavidia et al., 2007).

No obstante, los bajos rendimientos de cardenolidos obtenidos en estas investigaciones han impedido su aplicacion a escala comercial. En este sentido han sido ensayadas diversas alternativas con el objetivo de incrementar la produccion de cardenolidos en el genero Digitalis, tales como cambios en la composicion nutricional de los medios de cultivo, la biotransformacion, la adicion de precursores y la modificacion genetica (Hagimori et al., 1983; Saito et al., 1990; Gurel et al., 2010).

En el caso especifico de D. purpurea, por su importancia en la industria farmaceutica, existe una demanda creciente de tecnologias de produccion alternativas al cultivo en condiciones naturales. El cultivo in vitro de celulas y tejidos permitiria contar con sistemas de produccion definidos, en condiciones controladas, asi como obtener rendimientos constantes del metabolito de interes (Paek et al., 2005; Vanisree y Tsay, 2007).

El empleo de elicitores bioticos y abioticos constituye una estrategia para estimular la sintesis de metabolites secundarios de plantas cultivadas in vitro (Zhang y Memelink, 2009). La elicitacion se ha descrito, mayormente, en el cultivo de suspensiones celulares, en cambio existen muy pocos ejemplos de su aplicacion en brotes cultivados in vitro (Liu et al., 2007; Orlita et al., 2008; Coste et al., 2011).

Hasta el momento, en la literatura consultada solo existen dos precedentes del empleo de elicitores, ambas en Digitalis lanata Erhn (Ghanem et al., 2010; Perez-Alonso et al., 2012). En su investigacion, Ghanem et al. (2010) compararon el efecto de la adicion de acido salicilico, extracto de levadura y cloruro de calcio en brotes de Digitalis Ianata Ehrh. propagados en medio de cultivo semisolido, obteniendo los mayores contenidos de cardenolidos con 200 mM de cloruro de calcio. Por su parte, en previas investigaciones, Perez-Alonso et al. (2012) describieron el efecto de la adicion de elicitores en brotes cultivados en SIT. El ChitoPlant[R] a la vez que favorecio la produccion de masa fresca y seca por SIT, provoco un incremento en 3,2 veces el contenido de lanatosido C, principal cardenolido de esta especie, respecto al control sin elicitar. Ademas, se establecio una correlacion (r = 0,893; p<0,01) entre marcadores de estres oxidativo y el contenido de cardenolidos.

Teniendo en cuenta estos antecedentes se estudio el efecto de la adicion de elicitores bioticos y abioticos sobre el contenido de cardenolidos y la respuesta morfologica en brotes de D. purpurea. Hasta el momento, no existen precedentes del efecto de los elicitores en estudio en D. purpurea.

Materiales y metodos

En esta investigacion se utilizo como material vegetal plantas in vitro obtenidas a partir de semillas de Digitalis purpurea L. var. Roter Berggold. Las semillas fueron adquiridas en la empresa Pharmasaat GmbH (Alemania). Estas fueron desinfectadas segun el protocolo propuesto por Erdei et al. (1981). Las mismas fueron colocadas para su germinacion en camara de crecimiento con un fotoperiodo de 16 h con lamparas fluorescentes de luz blanca, con una intensidad de flujo de fotones fotosinteticos de 40 [micron]mol.[m.sup.2].[s.sup.-1] a 27[+ o -]2 [grados]C de temperatura.

Se empleo el medio de cultivo compuesto por las sales MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementadas con 1,0 mg.[L.sup.-1] de tiamina y 30 g.[L.sup.-1] de sacarosa. Se utilizaron frascos de policarbamato de 500 mL de capacidad a los cuales se anadieron 50 mL de medio de cultivo. Las plantulas obtenidas crecieron hasta alcanzar una altura aproximada de 4,0 cm. Las hojas y raices de estas fueron cortadas. Los brotes con una altura aproximada de 2,0 cm y en segundo subcultivo fueron transferidos a un medio de cultivo propuesto por Erdei et al. (1981) modificado compuesto por sales MS (100%) suplementado con 1,0 mg.[L.sup.-1] de tiamina; 100 mg.[L.sup.-1] de mioinositol; 1,0 mg.[L.sup.-1] de 6-bencilaminopurina (6-BAP); 0,1 mg.[L.sup.-1] de acido indol-3-acetico (AIA) y 30 g.[L.sup.-1] de sacarosa. Se utilizaron 40 explantes por tratamiento.

Se ensayaron tres elicitores: jasmonato de metilo (MJ) (Duchefa NV, Holanda) (60, 80 y 100 pM); ChitoPlant[R] (ChP[R]) (Quitosana, Chipro GmbH, Bremen, Alemania) ((0,001; 0,01; 0,1 g.[L.sup.-1]) y SilioPlant[R] (SiP[R]) (dioxido de silicio al 35% (p/v), Chipro GmbH, Bremen, Alemania) (0,01; 0,1; 1,0 g.[L.sup.-1]).Los mismos fueron anadidos al medio de cultivo referido anteriormente. El ChP[R] y el SiP[R] fueron anadidos previo a la esterilizacion. Para el M) se preparo una solucion en etanol a 100 mM y se esterilizo por filtracion con una membrana de filtracion ANALIPORE[R] (OSI) de celulosa esteril, con una porosidad de 0,22 [micron]m.

Los brotes se cultivaron en camara de crecimiento con un fotoperiodo de 16 h con lamparas fluorescentes de luz blanca, con una intensidad de flujo de fotones fotosinteticos de 40 [micron]mol.[m.sup.-2].[s.sup.-1] y ocho horas de oscuridad, a 27[+ o -]2 [grados]C de temperatura.

A los 28 dias de cultivo se realizaron las evaluaciones morfologicas referentes a la altura, numero de brotes por explante, masa fresca y masa seca por frasco utilizado. Se cuantificaron los contenidos de digoxina y d!gitoxina. Se calculo la produccion neta de cardenolidos (pg de cardenolidos por frasco de cultivo) teniendo en cuenta la masa seca obtenida por frasco de cultivo.

El protocolo de extraccion que se empleo para la determinacion de cardenolidos fue el propuesto por Wichtl et al. (1982) con las modificaciones descritas por Perez-Alonso et al. (2009). La deteccion de cardenolidos se realizo mediante cromatografia liquida de alta resolucion (IIPLC, Agilent 1100) equipado con un detector de arreglo de diodos y una columna Inertsil ODS-3 (150x4,6 mm, 5pm). Se inyectaron 10 pl de la solucion final. Como solvente fue utilizado una mezcla de acetonitrilo (ACN)/agua (25:75) con un flujo de 1.5 ml.miiT'. El gradiente vario de la siguiente forma: inicio (25% ACN), 4 min (25% ACN), 34 min (37% ACN), 45 min (50% ACN), a partir de 60 min (25% ACN) hasta 65 min que termina el analisis. Todas las determinaciones fueron realizadas a una temperatura de 40 [grados]C. Los cardenolidos fueron detectados a una longitud de onda de 220 nm. La digitoxina y la digoxina fueron identificados segun el tiempo de retencion y comparados con los estandares obtenidos de una fuente comercial (SIGMA).

Para el analisis estadistico se utilizo el programa SPSS ver. 18,0, para el sistema operativo Windows. Para la elaboracion de ficheros de datos y graficos se utilizo el programa EXCEL del paquete Microsoft Office 2007. Para comprobar los supuestos de normalidad se aplicaron las pruebas de Kolmogorov-Smirnov para muestras grandes, de Shapiro-Wilk para muestras pequenas y de Levene para determinar la homogeneidad de varianza. Se aplicaron analisis no parametricos en todos los datos puesto que no cumplieron los supuestos de normalidad y homogeneidad de la varianza. Se realizo la prueba de Kruskal-Wallis para p<0,05 de significacion y las diferencias estadisticas entre los tratamientos fueron determinadas mediante la prueba de Mann Whitney con la penalizacion de Bonferroni.

Resultados y discusion

A partir de los resultados obtenidos se determino que la elicitacion es una estrategia que influyo en la produccion de biomasa y en el contenido de cardenolidos. La adicion de elicitores al medio de cultivo de multiplicacion, en dependencia de la concentracion aplicada, provoco cambios en el crecimiento y el desarrollo de los brotes de D. purpurea. Por su parte, los analisis por HPLC del contenido de cardenolidos revelaron la presencia de compuestos bioactivos en brotes de D. purpurea cultivados en medio de cultivo sernisolido. Los elicitores indujeron cambios significativos en la sintesis de cardenolidos con respecto al cultivo sin elicitar, los cuales se describen a continuacion.

ChitoPlant[R]

La adicion de ChitoPlant[R] en las concentraciones evaluadas produjo una disminucion significativa en la altura de los brotes con respecto al tratamiento control sin elicitar (figura 1A). Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en el numero de brotes por explante ni en la masa fresca por frasco respecto al control ni entre las concentraciones ensayadas para cada elicitor. Contradictoriamente, se observo en la variable masa seca un incremento significativo al emplearse la mayor concentracion de ChP (0,1 g.[L.sup.-1]) (figura 1B). Esto pudo deberse al incremento de lignina y fenoles que provoca la quitosana segun Vasconsuelo y Boland (2007).

La adicion de ChP en cualquiera de las tres concentraciones ensayadas incremento los contenidos de digoxina y de digitoxina con respecto al control sin elicitar (figura 2). Sin embargo, entre las concentraciones de ChP evaluadas no se observaron diferencias significativas para los contenidos de digoxina ni digitoxina.

El ChP contiene como ingrediente activo la quitosana, un derivado de la quitina, componente que se encuentra en la pared celular de hongos, en insectos y crustaceos (Mathew y Sankar, 2012). La quitosana activa mecanismos de defensa en las plantas estrechamente relacionados con la induccion de resistencia sistemica al ataque de microorganismos (Agrawal et al., 2002). Sin embargo, su efecto en la induccion de metabolites secundarios no ha sido ampliamente investigado, lo que dificulta la comparacion de resultados en otras especies. En el cultivo de organos, pocos resultados muestran el efecto del ChP en la produccion de biomasa y sintesis de metabolitos secundarios. En el genero Digitalis solo un estudio previo en D. Ianata (Perez-Alonso et al., 2012) muestra el efecto del ChP para la produccion de biomasa y cardenolidos y se obtuvo un incremento significativo en lanatosido C (316 [micron]g.g[MS.sup.1]).

[FIGURA 1 OMITIR]

Los oligosacaridos como el ChP, han sido descritos como potentes moleculas senales que regulan el crecimiento y desarrollo de las plantas (Sudha y Ravishankar, 2002). Ait Barka etal. (2004) describieron que una concentracion de 1,75% (v/v) en el medio de cultivo induce un incremento en el desarrollo de los explantes en Vitis vinifera L., pero una concentracion de 2,0% (v/v) tuvo un efecto negativo en el cultivo. De manera similar, Kim et al. (2005) observaron un incremento en la altura y la masa fresca de plantas de Ocimum basilicum L. (17 y 12% respectivamente) asi como en el contenido de fenoles y terpenos con concentraciones de quitosana hasta 1,0 g.[L.sup.1]. Estos resultados muestran que la quitosana provoco un incremento en la biosintesis de los isoprenoides, aspecto que aplicado a los resultados del presente trabajo, corrobora el aumento del contenido de los cardenolidos ante el ChP como respuesta de defensa de la planta.

SilioPlant[R]

El aumento de las concentraciones de SilioPlant[R] afecto el desarrollo de los brotes. El tratamiento donde se empleo la menor concentracion del SiP mostro un comportamiento similar al control en las variables evaluadas, excepto para la altura que disminuyo con el incremento de las concentraciones ensayadas (figura 3A). En cuanto al numero de brotes por explante, la mayor concentracion del SiP provoco una disminucion con respecto a los tratamientos evaluados y fue la unica que mostro diferencias significativas (figura 3B). Para las variables masa fresca (figura 3C) y masa seca por frasco (figura 3D) se observo un detrimento en las concentraciones de 0,1 y 1,0 g.[L.sup.-1].

[FIGURA 2 OMITIR]

El SiP indujo un incremento en el contenido de digoxina y digitoxina excepto en la mayor concentracion (1,0 g.[L.sup.-1]) que provoco una disminucion en el contenido de digoxina sin diferencias significativas respecto al control sin elicitor (figura 4).

Los mayores valores de digoxina (10,0 [micron]g.g[MS.sup.-1]) y digitoxina (187,8 [micron]g.g[MS.sup.-1]) se alcanzaron en el tratamiento con 0,01 g.[L.sup.-1] de SiP, lo que corresponde a incrementos de 3,6 y 6,9 veces en el contenido de digoxina y digitoxina respectivamente, en comparacion con el control. Resultados similares fueron observados por Perez-Alonso et al. (2012) quienes alcanzaron un incremento de 2,2 veces el contenido de lanatosido C respecto al control con 0,01 g.[L.sup.1] de SiP.

Es de destacar, que a pesar de que todos los tratamientos con SiP incrementaron el contenido de digitoxina en los brotes respecto al control, se observo una disminucion de su contenido con concentraciones mayores que 0,01 g.[L.sup.-1].

Existen pocos antecedentes sobre la utilizacion de este elicitor en el cultivo in vitro, aunque el efecto beneficioso del silicio en la nutricion en plantas ha sido estudiado en condiciones naturales (Epstein, 2001). El silicio es un elemento bioactivo con un efecto positivo en el crecimiento de las plantas, mejora las propiedades mecanicas de los tejidos, reduce la transpiracion y ademas incrementa la resistencia de las plantas frente a organismos patogenos (Fauteux et al., 2005; Hammerschmidt, 2011). Sin embargo, ninguna de las concentraciones ensayadas provoco una mayor produccion de biomasa que en el control sin elicitar.

En la actualidad se desconoce la naturaleza exacta de la interaccion del silicio con las rutas bioquimicas relacionadas con la resistencia en plantas y por consiguiente en la acumulacion de metabolitos secundarios asociados a esta. Al respecto, Fauteux et al. (2005) encontro que el silicio actua en mecanismos comunes para todas las especies de plantas asi como en aquellos relacionados con la expresion de genes. Bonilla (2008) refiere que el oxido de silicio se acumula en la pared celular e incrementa su impermeabilidad y resistencia al ataque de patogenos, no solo por constituir una barrera fisica, sino tambien por configurar compuestos silico-organicos que son muy estables frente a las enzimas de los patogenos.

El efecto positivo del SiP sugiere que este elicitor puede estar asociado con la acumulacion de metabolitos secundarios relacionados con los mecanismos de defensa en plantas como los cardenolidos. Sin embargo, no existen ejemplos alentadores que contribuyan a dilucidar su accion en el incremento de cardenolidos.

Jasmonato de metilo

El jasmonato de metilo provoco un efecto negativo en todas las variables evaluadas independientemente de las concentraciones estudiadas con diferencias significativas respecto al control (figura 5). Al respecto, Howe (2004) afirma que uno de los efectos mas notables de los jasmonatos exogenos es la inhibicion del crecimiento y Crozier et al. (2000) lo describen como un retardador del crecimiento en diversas especies.

Ademas, en los primeros dias de cultivo en los tratamientos con MJ los apices de los brotes tenian una coloracion violeta rojo palido y a los 28 dias las hojas mostraban una coloracion verde palido similar al color de plantas con clorosis. Siguiendo a Zacarias y Lafuente (2008), esto podria atribuirse a que la aplicacion del MJ provoca una disminucion en la expresion de los genes involucrados en la fotosintesis y una reduccion en el contenido de clorofila en las hojas de las plantas.

[FIGURA 3 OMITIR]

Los metabolismos primario y secundario comparten rutas y precursores, en los cuales la utilizacion de fuentes nutricionales disponibles como el carbono y el nitrogeno dependen en parte de la presencia de un grado de estres que afecten a las plantas (Tisserat y Vaughn, 2008). Este estres puede ser ocasionado por elicitores, los cuales pueden activar rutas metabolicas que dan origen a los metabolitos secundarios, por lo que la planta desvia parte del material del metabolismo primario para estos fines. Por esta razon, las plantas bajo tratamiento con elicitores pueden mostrar cambios morfologicos como disminucion o detencion del crecimiento. Este efecto supresor en el metabolismo primario ha sido descrito para el acido jasmonico por Coste et al. (2011) en brotes de Hypericum hirsutum L. e Hypericum maculatura Crantz. De igual manera, Hu et al. (2011) informaron de la reduccion de la biomasa por el efecto del MJ en el cultivo de suspensiones celulares de Fagopyrum esculentum L.

[FIGURA 4 OMITIR]

[FIGURA 5 OMITIR]

La adicion de MJ en las concentraciones ensayadas indujo variaciones en el contenido de digoxina y d!gitoxina (figura 6). La mayor concentracion (100[micron]M) provoco un incremento en el contenido de ambos cardenolidos con diferencias significativas respecto al control. El incremento de la digitoxina fue mas notable (37 [micro]g.g[MS.sup.-1]) y difirio significativamente con el resto de las concentraciones evaluadas. Mientras, el mayor valor de digoxina se alcanzo en el tratamiento con 80pM (9,4 [micron]g.g[MS.sup.-1]) con diferencias significativas respecto al resto de los tratamientos, que equivale a un aumento de 3,3 veces con respecto al control. Estos resultados indican que el MJ podria influir diferencialmente en las enzimas asociadas a la produccion de cardenolidos.

El efecto de los jasmonatos en el incremento de un metabolite y en el detrimento de otro, ha sido observado por Coste et al. (2011) en brotes de H. hirsutum. La induccion de metabolites secundarios es uno de los efectos del MJ comunmente observado (Kim et a/., 2007; Hu et al., 2011; Mathew y Sankar, 2012). Autores como Gundlach et al. (1992) demostraron que la induccion por el jasmonato no es especifica para un tipo de metabolite, sino que influye de manera general en un amplio espectro de sustancias de bajo peso molecular tales como flavonoides, antraquinonas y varias clases de alcaloides.

Por su parte, Kim et al. (2009) indujeron cambios en el contenido de ginsenosidos en el cultivo de raices de Panax ginseng C.A. Meyer, mediante la elicitacion con el MJ.

Haciendo un analisis del efecto de los elicitores en la produccion neta por frasco de cultivo (tabla 1), los mejores resultados se alcanzaron en el tratamiento con 0,01 g.[L.sup.-1] de SiP (4,72 [micron]g de digoxina y 88,27 [micron]g de digitoxina). El segundo mejor resultado se obtuvo en el tratamiento con 0,1 g.[L.sup.-1] de ChP, que alcanzo una produccion neta por frasco de cultivo de 4,95 [micron]g de digoxina y 36,88 pg de digitoxina. Esta variable ha sido utilizada con el objetivo de evaluar las potencialidades del metodo desarrollado para la produccion a nivel comercial. A su vez, ratifica la importancia de la produccion de biomasa para obtener una mayor produccion de cardenolidos en D. purpurea.

Estos resultados muestran que el tipo y el contenido de los cardenolidos dependen de la concentracion y del elicitor utilizado en el cultivo de brotes de D. purpurea. Este aspecto ha sido senalado por autores como Ruiz-May etal. (2009) quienes describieron que el tipo de alcaloides y su acumulacion en el cultivo de raices de Catharanthus roseus L. estuvieron relacionados con ambos factores.

La acumulacion de metabolitos secundarios en plantas es considerada como una respuesta de defensa al ataque de patogenos, la cual es activada por elicitores que actuan como compuestos de senalizacion de las respuestas de defensa en plantas (Namdeo, 2007; Pawar et al., 2011). En Digitalis se conoce que la sintesis de cardenolidos ocurre como un mecanismo de defensa de la planta ante el ataque de insectos (Wink, 2010).

[FIGURA 6 OMITIR]

Teniendo en cuenta las valoraciones realizadas por Perez-Bermudez et al. (2010) sobre los genes relacionados con la ruta biosintetica de los cardenolidos, especificamente el P50R2 cuya expresion fue independiente del MJ, es posible que el incremento de estos con el MJ se deba a la interaccion sinergica entre el etileno y el jasmonato y no al efecto aislado del MJ. Para ambos se ha descrito su contribucion significativa a la resistencia contra herbivoros (Onkokesung et al., 2010). Los mecanismos de defensa en plantas estan interconectados por una compleja red de rutas de senalizacion de hormonas (Pieterse et al., 2009; Mejia-Teniente et al., 2010). Estas rutas responden a condiciones de estres o a elicitores, que modulan la biosintesis de compuestos de defensa como un resultado combinado de las acciones multiples de senalizacion (Zhao et al., 2005).

Aunque se han considerado muchas hipotesis sobre los mecanismos de accion de los elicitores, aun es necesario el estudio de los mismos. Los elicitores, a una concentracion apropiada, pueden actuar como moleculas de senalizacion, las cuales son percibidas por un receptor presente en la membrana plasmatica y que inicia la senal de transduccion (Vasconsuelo y Boland, 2007). De esta manera, involucra la expresion de genes y la activacion de rutas metabolicas implicadas en la biosintesis del compuesto deseado. Al respecto, Orlita et at. (2008) consideraron que debido al escaso conocimiento de las rutas de biosintesis de los metabolitos secundarios, el efecto de un elicitor en el cultivo de celulas o de tejidos no es predecible. Al respecto, Bhagwath y Hjortso (2000) utilizaron un diseno factorial donde incluyeron varios factores para la produccion de metabolitos secundarios en el cultivo de raices de Ambrosia artemissifolia L. y notaron que la mayoria de los metodos de elicitacion son empiricos.

En el caso especifico de las especies de Digitalis, hay limitada informacion acerca de la acumulacion de cardenolidos mediante el uso de elicitores en el cultivo in vitro. En la literatura cientifica consultada solo existe una investigacion desarrollada en D. Ianata (Ghanem et al., 2010), quienes describen el estudio de elicitores como el acido salicilico, el extracto de levadura y el cloruro de calcio. Este ultimo elicitor incremento el contenido total de cardenolidos 2,9 veces comparado con las plantas no elicitadas.

Los cardenolidos estan constituidos por una genina o aglicona que contiene el nucleo esteroidal y una secuencia de moleculas de azucares generalmente raros que se producen durante el ciclo de las pentosas como las digitoxosas (Pinol et al., 2008). En Digitalis la serie mas comun es la A pero la de mayor importancia es la C, la diferencia entre sus geninas esta en el grupo OH que tiene la digoxina en el carbono 12 mientras que la digitoxina tiene un grupo hidrogeno, puede ser que fenomenos como la hidroxilacion se vean afectados por elicitores. Se desconoce cuales variaciones encontradas en las series A y C son determinadas geneticamente o cuales pueden ser causadas por factores ambientales o externos (Yiicesan, 2011).

Teniendo en cuenta los procesos relacionados con la sintesis de metabolitos secundarios podemos especular sobre su efecto en algunos aspectos basicos aunque no existen evidencias que confirmen los posibles mecanismos en los que influyen directamente los elicitores. Estas pueden estar relacionadas con afectaciones en el metabolismo primario que modulan la expresion de moleculas del metabolismo primario involucrado en el transporte a vacuolas donde se almacenan dichos metabolitos, limiten o favorezcan precursores de la ruta del acido mevalonico descrita como ruta de biosintesis de cardenolidos (Kreis y Muller-Uri, 2013). Por otra parte pueden alterar la localizacion o la solubilidad de las enzimas, activar aquellas especificas que regulan la sintesis de digitoxina, en detrimento de las enzimas que rigen la sintesis de digoxina. Las acetiltransferasas y glucosiltransferasas (Kreis et al., 1986; Kandzia et al., 1998) juegan importantes roles en la ruta biosintetica de los cardenolidos y podria especularse que el ChP y en mayor medida el SiP, promovieran la glucosilacion y la acetilacion provocando un incremento en el contenido de los cardenolidos, aunque se requiere de nuevos experimentos para probar esta hipotesis. Como estrategia para estimular la sintesis de metabolitos secundarios, la elicitacion ha tenido una marcada aplicacion comercial en los ultimos anos (Savitha et al., 2006). A esto se le adiciona, que podrian permitir el estudio de genes relacionados con la biosintesis de cardenolidos mediante la evaluacion de la expresion de los mismos ante el efecto del elicitor.

Recibido: octubre 24 de 2013

Aprobado: abril 15 de 2014

Conclusiones

Se demostro que la elicitacion es una estrategia viable para el incremento de cardenolidos en brotes de D. purpurea en medio de cultivo semisolido. El SilioPlant[R] a razon de 0,01 g.[L.sup.-1] permitio incrementar en 3,6 y 6,9 veces el contenido de digoxina y digitoxina respectivamente.
Abreviaturas

6-BAP   6-Bencilaminopurina
ACN     Acetonilrilo
AIA     Acido indol-3-acetico
ChP     ChitoPlant[R]
gMF     Gramos de masa fresca
gMS     Gramos de masa seca
HPLC    Cromatografia Liquida
          Alta Resolucion (del
          ingles High-Performance
          Liquid Chromatography)
MJ      Jasmonato de metilo
MS      Sales inorganicas propuestas
          por Murashige y Skoog (1962)
SiP     SilioPlant[R]


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Naivy Lisbet Perez-Alonso * (1), Franklyn Arana Labrada ** (2), Alina Capote Perez ** (1), Anabel Perez Perez (1) ***, Rafael Sosa (3) **, Angel Mollineda (4) ***, Elio Jimenez Gonzalez (5) *

* Doctor en Ciencias Agricolas.

** Master en Biotecnologia vegetal.

*** Tecnico especialista

(1) Instituto de Biotecnologia de las Plantas, Universidad Central "Marta Abreu" de Las Villas, Carretera a Camajuani km 5,5, 54830 Santa Clara, Villa Clara, Cuba. E-mail: naivy@ibp.co.cu; alina@ibp.co.cu; anabel@ibp.co.cu

(2) Universidad de las Tunas "Vladimir llich Lenin", Ave. Carlos J. Finlay s/n, Reparto Buenavista 75200 Israel Santos, Las Tunas, Cuba. E-mail: franklynal@ult.edu.cu

(3) Centro de Bioactivos Quimicos, Universidad Central "Marta Abreu" de Las Villas, Carretera a Camajuani km 5,5, 54830 Santa Clara, Villa Clara, Cuba

(4) Centro de Investigaciones Agropecuarias, Universidad Central "Marta Abreu" de Las Villas, Carretera a Camajuani km 5,5, 54830 Santa Clara, Villa Clara, Cuba.

(5) Doctor en Ciencias Agricolas. University of Florida, Tropical Research & Education Center Institute of Food & Agricultural Sciences. 18905 SW 280th Street Homestead, FL 33031. E-mail: eliojimenez@ufl.edu
Tabla 1. Efecto de elicitores en la produccion neta por frasco
de cultivo de digoxina y digitoxina en brotes de Digitalis
purpurea L. cultivados en medios de cultivo semisolidos
durante 28 dias.

Tratamientos                           Digoxina    Digitoxina
                                     ([micron]g)   ([micron]g)

Control sin elicitar                     1,12        10,84
ChitoPlant[R] 0,001 g x [L.sup.-1]       2,92        18,55
ChiloPlant[R] 0,01 g x [L.sup.-1]        2,46        28,55
ChitoPlant[R] 0,1 g x [L.sup.-1]         4,95        36,88
SilioPlant[R] 0,01 g x [L.sup.-1]        4,72        88,27
SilioPlant[R] 0,1 g x [L.sup.-1]         2,86        29,20
SilioPlant[R] 1,0 g x [L.sup.-1]         1,14        24,70
Jamonato de metilo 60 [micron]M          1,12         5,38
Jamonato de metilo 80 [micron]M          2,92         5,94
Jamonato de metilo 100 [micron]M         2,12        11,83
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Author:Perez-Alonso, Naivy Lisbet; Arana Labrada, Franklyn; Capote Perez, Alina; Perez Perez, Anabel; Sosa,
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Jul 1, 2014
Words:6780
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