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Esterificacion quimioselectiva de fitosteroles de madera mediante lipasas.

Introduccion

Las lipasas (triacilglicerol acilhidrolasas, EC 3.1.1.3) son enzimas que catalizan la hidrolisis de acilgliceroles conformados por acidos grasos de cadena larga, que actuan preferentemente en interfaces agua-aceite y que, por lo general, disponen de una estructura peculiar en torno al sitio activo conocida como "tapadera" Qensen y Hamosh, 1996; Nardini et al., 2000). Esta definicion, mas bien fisiologica, no refleja el potencial catalitico de las lipasas que pueden tambien catalizar reacciones de remocion de acidos carboxilicos de una gran variedad de compuestos. Mas importante aun, las lipasas pueden catalizar en medios de baja actividad de agua reacciones reversas de esterificacion de acidos grasos y glicerol (y otros alcoholes) (Yadav y Devi, 2004), de interesterificacion entre esteres (Bloomer et al., 1990; Osorio et al., 2005) o entre acidos carboxilicos y alcoholes (Reyes et al., 1994), y transesterificacion entre esteres y alcoholes "oussam et al., 2004). Actualmente las lipasas son el grupo de enzimas mas estudiadas como catalizadores en reacciones de sintesis, y no menos de un tercio de los trabajos publicados sobre el tema se refieren a ellas. En efecto, las lipasas son enzimas particularmente bien dotadas para actuar en ambientes no convencionales (no acuosos) como los usualmente requeridos para llevar a cabo reacciones de sintesis (Klibanov, 1997; Hari Krishna y Karanth, 2002; Reetz, 2002).

Las lipasas estan ampliamente distribuidas en la naturaleza siendo sintetizadas por celulas animales (Houde et al., 2004), vegetales (Caro et al., 2002) y misrobianas (Rasan et al., 2006). Lipasas fungales de Candida rugosa, Candida antarctica, Thermomyces lanuginosus, Rhizomucor miehei, y lipasas bacterianas de Burkholderia cepcia, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas mendocina y Chromobacterium viscosum son las de mayor relevancia tecnologica y se encuentran comercialmente disponibles, tanto en forma libre como inmovilizada (Jaeger y Reetz, 1998; Christensen et al., 2003; Gupta et al., 2004). La ubicuidad de las lipasas hace que continuamente se reporten nuevos organismos potencialmente productores (Wang et al., 1995; Demirjian et al., 2001; Gupta et al., 2004; Hasan et al., 2006) y fuentes metagenomicas (Henne et al., 2000; Kourist et al., 2007; Bertram et al., 2008). De acuerdo con su origen, las lipasas poseen propiedades muy variadas en cuanto a especificidad, selectividad, tolerancia termica y dependencia del pH (Saxena et al., 2003). La naturaleza extracelular de muchas lipasas y las tecnicas de ingenieria genetica e ingenieria de proteinas hacen actualmente posible su produccion en gran escala mediante la sobreexpresion en hospederos adecuados (Misset et al., 1994; Schmidt-Dannert, 1999; Svedensen, 2000; Cos et al., 2005).

Las lipasas, a diferencia de las esterasas, son activadas en presencia de interfaces (activacion interfacial) (Brzozowski et al., 1991), y frecuentemente poseen una estructura peculiar en el sitio activo, ya que disponen de una cadena polipeptidica en su vecindad (tapadera o lid) que puede replegarse sobre el sitio activo, bloqueandolo. Esta caracteristica condiciona la funcionalidad de la enzima a la existencia de un microambiente hidrofobico que permita el desplegado de la tapadera dejando accesible el sitio activo (Petkar et al., 2006; Secundo et al., 2006). Puede considerarse que la enzima existe en un equilibrio configuracional entre una forma cerrada inactiva y una forma abierta (Thomas et al., 2005), como se esquematiza en la figura 1. Tal equilibrio puede ser desplazado hacia la forma activa por la presencia de un microambiente hidrofobico que puede ser una interfaz aceite-agua o una superficie hidrofobica activa (Fernandez-Lorente et al., 2001; Palomo et al., 2003-2005).

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Como consecuencia de su estructura, las lipasas estan especialmente condicionadas para actuar en medios no convencionales, tales como sistemas bifasicos y monofasicos en presencia de solventes organicos (Cui et al., 1997; Matsumoto et al., 2001; Plou et al., 2002; Alcantara et al., 2005; Li et al., 2007), liquidos ionicos (Wassercheid y Keim, 2000; Madeira Lau et al., 2000; Kamal y Chouhan, 2004; Ha et al., 2007), en medios supercriticos (Laudani et al., 2007) y gaseosos (Cameron et al., 2002) donde el contenido de agua puede ser muy es-caso exacerbandose de este modo su potencial de sintesis por sobre el de hidrolisis. La actividad del agua es una variable clave en estos medios de reaccion siendo deseable su control durante la reaccion de sintesis (Berglund 2001). La actividad de agua no solo afecta la actividad y estabilidad de las lipasas, sino que tambien su enantioselectividad (Matsumoto et al., 2001; Wehtje and Adlercreutz, 1997; Bornscheuer 2002). A fin de poder actuar eficientemente en tales medios, se requiere de lipasas activas y estables que se desempenen con alta selectividad, lo que puede lograrse mediante diferentes estrategias que contemplan desde tecnicas de ingenieria de proteinas: mutagenesis sitio dirigida (Magnusson et al., 2001; Rotticci et al., 2001) y evolucion acelerada (Petrounia y Arnold, 2000; Jaeger et al., 2001; Fujii et al., 2005; Nakagawa et al., 2007), hasta tecnicas de ingenieria del biocatalizador: inmovilizacion a soportes mediante adsorcion (Manjon et al., 1991; Balcao et al., 1996; Villeneuve et al., 2000; Hiol et al., 2000) y enlace covalente (Hung et al., 2003; Salis et al., 2003; Hsu et al., 2004; Palomo et al., 2002, 2003, 2005; de Lathouder et al., 2005; Petkar et al., 2006), y auto-inmovilizacion mediante entrecruzamiento y agregacion por cristalizacion (CLEC) (Lalonde et al., 1995; Rajan y Abraham, 2008) o precipitacion (CLEAs) (Lopez-Serrano et al., 2002; Schoevaart et al., 2004; Wilson et al., 2006; Yu et al., 2006), que permiten incrementar la estabilidad del biocatalizador y su eficiencia de uso (Sharma et al., 2001). La inmovilizacion de lipasas mediante enlace covalente presenta la ventaja de evitar la desorcion de la enzima e incrementar su estabilidad termica; sin embargo, la desorcion no es significativa cuando se trabaja a bajas actividades de agua, en cuyo caso la inmovilizacion por adsorcion es una alternativa interesante. CLEA de lipasas han mostrado ser biocatalizadores de excelentes propiedades, con la ventaja sobre los CLEC de su menor costo por no requerirse de una enzima de alta pureza. Han sido empleados con exito en la produccion de biodiesel (Kumari et al., 2007) y de ibuprofeno en cuyo caso la enantioselectividad de la enzima se vio incrementada debido a la inmovilizacion (Yu et al., 2004).

Las lipasas son enzimas robustas que pueden catalizar una amplia gama de reacciones quimicas, muchas de las cuales son de alto impacto o potencial tecnologico (Straathof et al., 2002). Aun teniendo en la actualidad un mercado de menor tamano que las proteasas y las amilasas (Rasan et al., 2006), las lipasas representan las enzimas de mayor potencial comercial, vinculado a sus aplicaciones en sintesis organica (Saxena et al., 1999). Las lipasas han sido empleadas en su potencial hidrolitico en forma convencional en diversas aplicaciones en el area alimentaria (Seitz 1974; Tombs 1995; Jaeger y Reetz, 1998) y mas recientemente en la formulacion de detergentes y productos de limpieza (Sharma et al., 2001), y en el proceso de pulpaje de madera Qaeger y Reetz, 1998). Su mayor potencial sin embargo radica en sus aplicaciones a la industria de sintesis organica donde existe un gran numero de reacciones de interes factibles de ser catalizadas por lipasas (Faber 1997; Kazlauskas y Bornscheuer, 1998), aprovechando sus excelentes cualidades de selectividad y especificidad en la produccion de compuestos quirales enantiomericamente puros (tales como productos farmaceuticos y agroquimicos), y en la resolucion cinetica de mezclas racemicas respectivamente (Archelas y Furstoss 1997; Roberts y Williamson 1997; Rubin y Dennis 1997; Jaeger y Reetz 1998; Roberts 1998; Ghanem y Aboul-Enein 2004-2005). Articulos de revision muy completos sobre este aspecto han sido publicados recientemente (Houde et al., 2004; Hasan et al., 2006). Particularmente relevante es la aplicacion de lipasas en la produccion de biodiesel mediante transesterificacion de aceites naturales, lo que permite reducir el consumo de combustibles fosiles y la emision de COz (Knothe et al., 2005; Li et al., 2007). El estado tecnologico actual de la produccion enzimatica de biodiesel ha sido recientemente analizado (Salis et al., 2007).

El gran desarrollo de los aspectos relativos a la produccion y utilizacion de lipasas experimentado en los ultimos anos permite pronosticar que nuevas aplicaciones seran vigorosamente desarrolladas en los proximos anos en el campo de la sintesis organica. El presente trabajo se refiere precisamente a una de aquellas aplicaciones novedosas, cual es la transesterificacion selectiva de fitosteroles de madera mediante lipasas.

La industria de celulosa es de gran relevancia para la economia chilena. El proceso Kraft de produccion de pulpa de celulosa produce diversos residuos, entre ellos el licor negro, que debe necesariamente ser tratado o valorizado para reducir su impacto ambiental (Johansson, 1982). Se ha desarrollado en Chile una plataforma tecnologica para el fraccionamiento y aprovechamiento integral de este residuo, como lo muestra la figura 2.

La fraccion pesada luego de la destilacion del pitch, es una mezcla de esteroles saturados (estanoles) y mono-insaturados, cuyas estructuras se muestran en la figura 3. Dicha mezcla tiene un gran potencial por cuanto los esteres de estanol han demostrado reducir las lipoproteinas de baja densidad en el colesterol sanguineo lo que las convierte en agentes anticolesterolemicos (Nguyen, 1999; Lichtenstein y Deckelbaum, 2001). Productos basados en dichos esteres, producidos por esterificacion quimica de fitosteroles se encuentran en el mercado desde hace unos anos y han tenido gran aceptacion publica (4). Los esteres de estanoles han sido considerados superiores a los de esteroles, de modo que su separacion de la mezcla resulta beneficiosa desde esa perspectiva pero, mas aun, por cuanto los esteroles pueden ser empleados como materia prima por la industria farmaceutica en la produccion de drogas esteroidales. En efecto, los esteroles de madera ofrecen algunas ventajas respecto a los esteroles de soya, actualmente empleados, en cuanto a disponibilidad y composicion mas homogenea, segun se desprende de los datos presentados en la tabla 1.

El fraccionamiento de los fitosteroles de madera en una fraccion rica en esteroles orientada a la industria farmaceutica, y una fraccion rica en estanoles orientada a la produccion de alimentos saludables es de gran relevancia tecnologica y representa el objetivo del presente trabajo. Dada la similitud estructural y quimica entre esteroles y estanoles (esteroles insaturados) que puede apreciarse en la figura 3, no resulta factible separar estos componentes ni siquiera empleado la sofisticada tecnologia de destilacion molecular.

La esterificacion no especifica de fitosteroles de madera puede llevarse a cabo por via quimica (5); sin embargo, la esterificacion enzimatica con esteres de acidos grasos empleando lipasas tiene la potencial ventaja de un alta especificidad y moderadas condiciones de operacion, caracteristicas deseables tanto desde la perspectiva misma del proceso productivo como desde una perspectiva ambiental. La esterificacion selectiva de la fraccion de estanoles en los fitosteroles de madera mediante lipasas aparece entonces como una opcion tecnologica relevante ya que los compuestos esterificados y no esterificados pueden ser convenientemente separados mediante destilacion molecular. El presente trabajo se refiere a la seleccion y evaluacion de biocatalizadores enzimaticos para la transesterificacion selectiva de la fraccion de estanoles en los fitosteroles de madera.

Materiales y metodos

Materiales

Lipasas QL y QLG fueron proporcionadas por Meito Sangyo Co., Ltd. Qapon). Lipasa QL es producida en forma extracelular por Al calbgenes sp. PL-266, y Lipasa QLG corresponde a un preparado de Lipasa QL inmovilizado en tierra de diatomeas granulada (celita tipo G). Accurel MP-1000 [R] fue proporcionado por Membrana GmbH Accurel Systems, glioxil agarose y polietilenimina-glioxil agarose por Iberagar, Portugal, octil agarose por Amersham Pharmacia Biotech, EE.UU.; Cellite 580 [R] por Celite Chile S.A., Eupergit C [R] y Eupergit C250LC por Rohm Pharma Polymers, Alemania; quitosano por Sigma Co, EE.UU., butil Sepabeads [R] y octadecil Sepabeads [R] por Resindion S.R.L, Italia. Todos los reactives y solventes usados fueron de grado analitico. Los esteroles de madera y metil esteres de acidos grasos utilizados en la reaccion de transesterificacion fueron proporcionados por Harting S.A., Chile.

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Metodos

La proteina en la solucion enzimatica fue determinada mediante Bradford (1976) utilizando albumina de suero bovino como estandar. La determinacion de la proteina inmovilizada se realizo por diferencia entre el contenido to tal de proteina en la solucion enzimatica inicial contactada y la proteina final soluble una vez terminado el proceso de inmovilizacion.

La actividad de hidrolisis de la enzima libre e inmovilizada se determino mediante el metodo de Fukuda (Fukuda et al., 1996) basado en la medicion de la velocidad inicial de hidrolisis de p-nitrofenil acetato mediante cuantificacion espectrofotometrica a 320 nm del p-nitrofenol producido. Una unidad internacional (Ul) de actividad se definio como la cantidad de enzima que catalina la formacion de 1 mol de pnitrofenol por minuto a partir de p-nitrofenil acetato 0,24mM a pH 7,0 y 30 [grados]C.

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El pretratamiento de la lipasa de Alcalbgenes sp. PL-266 con Na1[O.sub.4] se realizo conforme a lo previamente reportado por Wilson et al. (2006), con el fin de impedir la agregacion enzimatica y producir una mayor apertura del sitio activo previo a la inmovilizacion.

Los soportes empleados en la inmovilizacion, y algunas de sus caracteristicas principales se muestran en la tabla 2.

La inmovilizacion en Cellite 580[R], quitosano, Eupergit C[R], Eupergit C250L[R], poletilenimina --glioxil agarose, octil agarose, butil Sepabeads[R], octadecil- Sepabeads y Accurel --1000 [R] se realizo contactando entre 0,25 y 50 mg de lipasa pretratada por g de soporte hasta que la concentracion de proteinas en la solucion alcanzo un valor constante, para luego retener los solidos en filtro Millipore N[grados] 3 y lavarlos con abundante agua destilada hasta eliminar toda la proteina no inmovilizada. La inmovilizacion en glioxil agarose se realizo de acuerdo con lo previamente reportado por Guisan et al. (1997).

Las reacciones de transesterificacion en medio anhidro se llevaron a cabo en un reactor Eurostar de 2 L con agitacion a 200 rpm en las condiciones indicadas para cada experimento. Los fitosteroles de madera fueron disueltos en los esteres de acidos grasos en una relacion masica 1:5, iniciandose la reaccion mediante la adicion de la lipasa en la cantidad y condiciones establecidas en cada experimento. Se tomaron muestras en forma periodica para su analisis por cromatografia de gases, y luego de 30 h de reaccion el biocatalizador fue recuperado, lavado con hexano y secado a temperatura ambiente para eliminar el solvente. Finalmente se determino el porcentaje de recuperacion del biocatalizador y su actividad esterasica remanente. La determinacion de esteroles y estanoles se realizo por cromatografia gaseosa utilizando un cromatografo HP 6890 (Hewlett-Packard, Avondale, PA, USA) equipado con un detector de ionizacion (FID) y columna HP-5 (fenil metil silicona entrecruzada al 5%) 30 cm 0,25 mm - 0,88 ~Lm. Se utilizo helio 68,4 (64 cm/s) como gas transportador y colesterol como patron interno. La cuantificacion del grado de transesterificacion, definida como porcentaje de conversion, se determino a partir de la desaparicion de estanoles y esteroles libres (no esterificados) en la mezcla reactante. Los porcentajes de conversion de los estanoles y de los esteroles libres a los respectivos productos esterificados a distintos tiempos de reaccion de transesterificacion en las condiciones antes mencionadas se determinaron mediante la Ec. 1:

X = [C.sub.0] - [C.sub.t] / [C.sub.0] x 100 Ec. 1

donde:

[C.sub.0] = concentracion inicial de estanoles (o esteroles) en la mezcla reactante.

[C.sub.t]= concentracion de estanoles (o esteroles) libres en la mezcla reactante a tiempo t de transcurrida la reaccion.

X = porcentaje de conversion de estanoles (o esteroles) a los respectivos esteres.

Resultados y discusion

La conceptualizacion del proceso de transesterificacion enzimatica selectiva de fitosteroles de madera se presenta en la figura 4. La mezcla de fitosteroles de madera es transesterificada selectivamente en un reactor enzimatico (RE) con lipasa y metil o etil esteres de acidos grasos produciendose la esterificacion selectiva de los estanoles, como lo muestra la figura 5. Luego de la reaccion, la mezcla es separada mediante destilacion a vacio (DV), obteniendose por tope los acidos grasos y el alcohol, y por fondo la mezcla de estanoles esterificados y esteroles no esterificados, los que pueden ser ahora separados por destilacion molecular (Dn, obteniendose por tope los esteroles no esterificados que pueden ser recuperados para su uso como materia prima en la produccion de hormonas esteroidales mediante bioconversion, y por fondo los estanoles esterificados que pueden ser recuperados para su uso en la formulacion de alimentos nutraceuticos.

Seleccion de lipasas

Diferentes preparados de lipasas comerciales disponibles fueron caracterizados en su capacidad de catalizar la reaccion de transesteri ficacion de fitosteroles de madera con esteres de acidos grasos, seleccionandose los diecinueve que se muestran en la tabla 3 (Martinez et al., 2004).

[FIGURA 4 OMITIR]

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El siguiente paso fue evaluar la capacidad de transesterificacion selectiva de estanoles en los fitosteroles, considerando como selectivas a aquellas enzimas capaces de transesterificar mas de un 80% de los estanoles presentes y menos de un 30% de los esteroles presentes. De todas las enzimas analizadas solamente los preparados QLG y QL de Alcaligenes sp satisficieron el criterio de selectividad establecido (Fuenzalida et al., 2006) por lo que fueron seleccionadas para los estudios posteriores.

Seleccion del agente de esterificacion

Metil y etil esteres de acidos grasos de aceites comerciales de coco, girasol y raps (colza) fueron evaluados bajo el criterio de mayor productividad (g de esteres de estanoles producidos por unidad de volumen de reaccion y de tiempo) atendiendo a satisfacer en todos los casos el criterio de selectividad. La reaccion fue realizada en condiciones previamente establecidas como adecuadas para la transesterificacion no selectiva de fitosteroles (Martinez et al., 2004): 5% de lipasa respecto a fitosteroles de madera, 60 [grados]C, 20 mbar de presion y actividad inicial de agua del biocatalizador 0,75. La reaccion de transesterificacion ocurre en medio anhidro (sin adicion de agua) actuando el propio sustrato (ester de acidos grasos) como solvente y debe necesariamente conducirse a vacio para remover el alcohol (metanol o etanol) producido dado su marcado efecto inhibitorio sobre la actividad de lipasa (reacciones realizadas a presion atmosferica conducen a conversiones por debajo del 40%). De los seis agentes de esterificacion empleados, los mejores resultados fueron obtenidos con metil esteres de aceite de raps el que fue seleccionado para los estudios posteriores. En general se obtuvieron mejores resultados con metil que con etil esteres con la ventaja adicional de la mayor volatilidad del alcohol correspondiente, lo que facilita su eliminacion del reactor enzimatico.

Optimizacion de la reaccion de transesterificacion con lipasa QLG

Se realizo un diseno experimental conside rando las variables y los rangos de trabajo indicados en la tabla 4 empleando la lipasa QLG de Alcaligenes sp inmovilizada en Cellite G[R]. La f incion objetivo por optimizar fue la productividad especifica, bajo la restriccion del cumplimiento del criterio de selectividad antes indicado. Las condiciones operacionales optimas obtenidas se entregan en la mencionada tabla 4. En tales condiciones se obtuvo un 93% de esterificacion de estanoles y un 23% de esterificacion de esteroles. La cinetica de transesterificacion en las condiciones optimas se presenta en la figura 6. Como puede apreciarse, la especificidad por estanoles no es absoluta, y en verdad se trata de una resolucion de tipo cinetico ya que, dado suficiente tiempo, mas del 40% de los esteroles pueden ser tambien esterificados. Resultados similares fueron obtenidos con la lipasa soluble de Alcaligenes sp (lipase QL) excepto que la esterificacion tanto de estanoles como esteroles fue algo inferior: 88 y 20% respectivamente.

Aunque los resultados obtenidos con QLG fueron satisfactorios y cumplieron los requisitos de selectividad establecidos, la estabili dad operacional de la enzima, evaluada en lotes sucesivos de reaccion, fue sorprendentemente baja, debido a la desorcion de casi el 90% de la proteina enzimatica durante el primer lote, lo que fue comprobado mediante electroforesis en gel (SDS-PAGE). Ello no era anticipable ya que, no obstante que la inmovilizacion en Cellite es solo por adsorcion, la condicion del medio de reaccion es virtualmente anhidra. En tal circunstancia, el uso de enzima inmovilizada es de escaso interes ya que puede lograrse esencialmente el mismo resultado con la enzima soluble (cuyo costo es inferior). No obstante, la economia del proceso hace necesaria la recuperacion de la enzima y un ciclo de vida util no inferior a cinco lotes. Se planteo entonces la opcion de inmovilizar la lipasa QL a fin de obtener un biocatalizador mas estable y factible de ser recuperado al cabo de la reaccion.

Inmovilizacion de lipasa QL

La inmovilizacion de lipasas es un tema de gran actualidad y diversos sistemas han sido propuestos recientemente (petkar et al., 2006; Wilson et al., 2006; Chiou et al., 2007; Sheldon et al., 2007; Rodrigues et al., 2008). La naturaleza hidrofobica del sitio activo de la lipasa sugiere el uso de matrices hidrofobicas para su inmovilizacion (Wilson et al., 2005; Mateo et al., 2007); no obstante, se evaluaron diversos sistemas de inmovilizacion, resumiendose los resultados obtenidos en la tabla 5. Como puede apreciarse, los mejores resultados se obtuvieron en la inmovilizacion en soportes hidrofobicos (octadecil Sepabeads[R], butil Sepabeads[R] y octil agarose) observandose incluso el fenomeno de activacion interfacial, siendo seleccionados para los estudios posteriores octil agarose y butil Sepabeads[R]. La actividad especifica pudo ser sustancialmente incrementada al aumentar la carga de proteina al soporte, segun se muestra en la tabla 6; sin embargo, en estas condiciones no se observo el fenomeno de activacion interfacial.

Lipasa QL inmovilizada en butil Sepabeads[R] a una carga de 1,75 mg protein/g fue seleccionada como el biocatalizador mas ade cuado para realizar la reaccion de transesterificacion, por tener la mayor actividad especifica a un rendimiento de inmovilizacion aun bastante alto. Adicionalmente, el biocatalizador obtenido es robusto y facil de manipular. La estabilidad operacional del biocatalizador seleccionado fue entonces evaluada en la transesterificacion de fitosteroles de madera en la modalidad de lotes sucesivos, empleando las mismas condiciones operacionales evaluadas como optimas con lipasa QLG. A modo de ejemplo, en la figura 6 se muestra la cinetica de la reaccion del segundo lote. Los resultados obtenidos en los lotes sucesivos se resumen en la tabla 7. Como puede apreciarse, la recuperacion del biocatalizador fue muy alta, y la desorcion de proteina desde la matriz fue insignificante. Luego de cinco lotes sucesivos, el comportamiento del reactor se mantuvo con muy escasa variacion satisfaciendo los criterios de selectividad con una elevada esterificacion de estanoles. A partir del lote 6, sin embargo, el grado de esterificacion de estanoles (y tambien de esteroles) se redujo significativamente, llegando a un nivel por debajo de lo aceptable. Los resultados obtenidos han sido validados a traves de varias corridas del reactor y son satisfactorios por cuanto el biocatalizador puede ser empleado por cinco lotes productivos antes de ser descartado. El proceso esta siendo escalado a nivel piloto y transferido a la industria. Hay, sin embargo, espacio para una sustancial mejora del proceso ya que las condiciones operacionales con la lipasa QL inmovilizada en butil Sepabeads[R] no han sido aun optimizadas.

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Conclusiones

La esterificacion selectiva de fitosteroles de madera es una aplicacion novedosa de las lipasas que ha sido exitosamente aplicada a la separacion de fitosteroles de madera en una fraccion rica en esteres de estanoles, orientada a la industria de alimentos saludables, y una fraccion rica en esteroles no esterificados, orientada a la industria farmaceutica.

Entre un elevado numero de lipasas comerciales disponibles evaluadas se seleccionaron dos lipasas, provenientes ambas de Alcalgenes sp, que satisfacian el criterio de selectividad de transesterificacion de los estanoles presentes en los fitosteroles de madera.

Luego de optimizado el proceso con la enzima comercial inmovilizada, se obtuvieron conversiones de estanoles superiores al 90% con conversiones de esteroles en torno al 20%, lo que satisfizo ampliamente el criterio de selectividad establecido.

La enzima inmovilizada comercial exhibio una baja estabilidad debido a la desorcion de la proteina por lo que se desarrollaron estrategias de inmovilizacion de la lipasa comercial no soportada, obteniendose los mejores resultados con butil Sepabeads [R], un soporte hidrofobico que promueve la adecuada configuracion del sitio activo de la enzima. La estabilidad del biocatalizador seleccionado fue evaluada en la reaccion de transesterificacion de fitosteroles de madera en la modalidad de lotes repetidos lograndose un ciclo productivo de 5 lotes sin perdida significativa de actividad enzimatica ni reduccion de conversion, productividad y selectividad, lo que satisface los criterios de rentabilidad del proceso. Los resultados han sido transferidos al sector productivo encontrandose en marcha el escalamiento del proceso a nivel piloto. Ha sido presentada una patente de invencion referida al proceso de elaboracion del biocatalizador obtenido por inmovilizacion de la lipasa de Alcaligenes sp PL-266 a un soporte hidrofobico activado con grupos butilo (Alvarez et al., 2007).

Agradecimientos

Trabajo realizado en el marco del Proyecto FONDEF D001-1096-0

Recibido: mayo 9 de 2008

Aprobado: mayo 21 de 2008

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(4) www.benecol.com

(5) www.freshpatents.com/ Phytosterol-esterificationproduct-and-method-of-make-same-dt20070628p- tan20070148311.php

Andres Illanes [1], Lorena Alvarez [2], Gregorio Alvaro [3]

[1] ProfesorTitular, Escuela de Ingenieria Bioquimica, Pontificia Universidad Catolica de Valparaiso. aillanes@ucv.cl

[2] Investigadora asociada, Escuela de Ingenieria Bioquimica, Pontificia Universidad Catolica de Valparaiso. Iorenaangelica@msn.com

[3] Profesor Asociado. E)enartamento de Ingenieria Ouimica. Universitat Autonoma de Barcelona. Greeorio.AlvaroCfuab.cat
Tabla 1. Composicion media de la mezcla de esteroles y estanoles en
fitosteroles de madera y de soya

                     Porcentaje en peso

                     Fitosteroles   Fitosteroles
Compuesto            de madera      de soya

[beta]-sitosterol         75             50
Campesterol                7             25
Stigmasterol              <1             20
Brasicasterol              -              3
[beta]-sitostanol         15              2
Campestanol                2             <1

Tabla 2. Sonortes nreseleccionados nary la inmovilizacion de linasa QL

Soporte                           Tipo de interaccion con la enzima

Cellite 580[R]                    Adsorcion
Glioxil agarose                   Union covalente multipuntual
Eupergit C[R]                     Union covalente multipuntual
Eupergit C250L[R]                 Union covalente multipuntual
Quitosano                         Union covalente multipuntual
Poletilenimina -glioxil agarose   Adsorcion ionica
Octil agarose                     Adsorcion interfacial hidrofobica
Butil Sepabeads[R]                Adsorcion interfacial hidrofobica
Octadecil Sepabeads[R]            Adsorcion interfacial hidrofobica
Accurel MP-1000 [R]               Adsorcion interfacial hidrofobica

Tabla 3. Enzimas comerciales con capacidad de transesterificar
fitosteroles de madera

Enzima                        Fuente

Lipase QLG                    Alcaligenes sp.
Lipase QLC                    Alcaligenes sp.
Lipase QL                     Alcaligenes sp.
Lipase SL                     Pseudomona cepacia SL-25
Lipase UL                     Rhizopus sp. Q 119
Lipase TL                     Pseudomona stutzeri PL-836
Lipase PLG                    Alcaligenes sp.
Lipase PLC                    Alcaligenes sp.
Lipase ALG                    Achromobacter sp.
Lipase ALC                    Achromobacter sp.
Lipolyve AN                   Aspergillus niger
Lipolyve CC                   Candida cylindracea
Lipolyve R                    Rhizopus oryzae
Lipase PS-D "Amano" I         Pseudomona cepacia
Lipase PS-C "Amano" I         Pseudomona cepacia
Lipase PS-C "Amano" II        Pseudomona cepacia
Validase Fungal Lipase 8000   Rhizopus oryzae (ATCC 1996)
Lipolase 100 T
Lipozyme

Enzima                        Proveedor

Lipase QLG                    Meito Sangyo
Lipase QLC                    Meito Sangyo
Lipase QL                     Meito Sangyo
Lipase SL                     Meito Sangyo
Lipase UL                     Meito Sangyo
Lipase TL                     Meito Sangyo
Lipase PLG                    Meito Sangyo
Lipase PLC                    Meito Sangyo
Lipase ALG                    Meito Sangyo
Lipase ALC                    Meito Sangyo
Lipolyve AN                   Lyven
Lipolyve CC                   Lyven
Lipolyve R                    Lyven
Lipase PS-D "Amano" I         Amano
Lipase PS-C "Amano" I         Amano
Lipase PS-C "Amano" II        Amano
Validase Fungal Lipase 8000   Valle y Research
Lipolase 100 T                Novo
Lipozyme                      Novo

Enzima                        Presentacion

Lipase QLG                    Inmovilizada en tierra de
                                diatomeasgranuladas
Lipase QLC                    Inmovilizada en tierra de diatomeas
Lipase QL                     Polvo crudo
Lipase SL                     Polvo crudo
Lipase UL                     Polvo crudo
Lipase TL                     Polvo crudo
Lipase PLG                    Inmovilizada en tierra de
                                diatomeasgranuladas
Lipase PLC                    Inmovilizada en tierra de diatomeas
Lipase ALG                    Inmovilizada en tierra de
                                diatomeasgranuladas
Lipase ALC                    Inmovilizada en tierra de diatomeas
Lipolyve AN                   Polvo soluble en agua
Lipolyve CC                   Polvo soluble en agua
Lipolyve R                    Polvo soluble en agua
Lipase PS-D "Amano" I         Inmovilizada en tierra de diatomeas
Lipase PS-C "Amano" I         Inmovilizada en particulas ceramicas
Lipase PS-C "Amano" II        Inmovilizada en particulas ceramicas
Validase Fungal Lipase 8000   Polvo crudo
Lipolase 100 T                Inmovilizada
Lipozyme                      Inmovilizada

Tabla 4. Variables, rangos de trabajo y condiciones optimas obtenidas
en la optimizacion de la reaccion de transesterificacion con lipase
QEG de fitosteroles de madera (EM) con metilester de acidos grasos de
aceite de raps (MEAG)

Variable                    Rango de Estudio   Valor optimo

Razon Q1G-EM (g/g)            0,01 - 0,1             3
Razon MEAG/EM (g/g)              1 - 5               5
Temperatura ([??]C)             50 - 80             70
Presion (mbar)                  20 - 100            50
Actividad de agua inicial     0,11 - 0,95           75

Tabla 5. Inmovilizacion de lipasa QL. RP: rendimiento de inmovilizacion
de proteina (mg proteina inmovilizada/mg proteina contactada); RE:
rendimiento de inmovilizacion enzimatica (unidades de actividad, UI *,
expresadas en el biocatalizador por unidad de actividad enzimatica
contactada); AE: actividad especifica (unidades de actividad expresadas
en el biocatalizador por unidad de masa de biocatalizador)

Soporte                           [R.sub.P] (%)   RE (%)   AE (UI/g)

Cellite 580[R]                         80           55        12
Glioxil agarose                        37           10        16
Polietilenimina-glioxil agarose        56           47        10
Lupergit C[R]                          52           38         8
Lupergit C250L[R]                      56           39         9
Quitosano                              44           33         7
Accurel MP-1000 [R]                    80          104        22
Octil agarose                         100          165        35
Butil Sepabeads[R]                     88          169        36
Octadecil Sepabeads[R]                 96          149        32

* 1 UI fue definida como la cantidad de enzima que cataliza la formacion
de 1 [micro]mol de p-nitrofenol por minuto desde una solucion 0,24 mM de
p-nitrofenil acetato a pH 7,0 y 30 [grados]C

Tabla 6. Inmovilizacion de lipasa QL en octil agarose y butil
Sepabeads[R] a cargas de proteina crecientes (CP) (mg de proteina
contactados/g de soporte). RP: rendimiento de inmovilizacion
de proteina (mg proteina inmovilizada/mg proteina contactada); RE:
rendimiento de inmovilizacion enzimatica (unidades de actividad, UI *,
expresadas en el biocatalizador por unidad de actividad enzimatica
contactada); AE: actividad especifica (unidades de actividad expresadas
en el biocatalizador por g de biocatalizador). LIO: lipasa inmovilizada
en octil agarose; LIB: lipasa inmovilizada en butil Sepabeads[R].

                     RP (%)      RE (%)    AE (IU/g)

[C.sub.P] (mg/g)   LIO   LIB   LIO   LIB   110   LIB

0,25               100    88   165   169    35    36
0,75                68    57    78    72    33    29
1                   60    46    77    64    42    35
1,25                57    48    71    62    47    39
1,5                 51    47    67    62    54    47
1,75                57    47    66    64    55    64
2                   50    46    52    54    55    58
2,5                 52    40    41    24    61    36
3                   50    43    35    21    63    38
5                   34    28    21    16    64    40
10                  20    16    11     7    64    41

Tabla 7. Operacion del reactor de transesterificacion en la modalidad
de lotes sucesivos con lipasa QL inmovilizada en butil Sepabeads[R] a
0,03 g enzima/g fitosteroles de madera; 5 moles esteres de acidos
grasos / mol fistosteroles de madera, 70 [grados]C, 50 mbar y
actividad de agua inicial del biocatalizador 0,75.

          Esterificacion(%)

                                  Razon de
                                  esterificacion
Lote No   Estanoles   Esteroles   estanol/esterol

1            95          32             30
2            93          30             32
3            96          28             34
4            92          31             30
5           100          27             37
6            73          19             38
7            74          23             32
8            70          11             64
9            66          12             55
10           56           7             80

          Recuperacion del
          biocatalizador (%)

Lote No   Por lote   Acumulativo

1            93          93
2            96          89
3            96          86
4            93          80
5            91          73
6            95          69
7            89          61
8            91          56
9            94          53
10           89          46
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Author:Illanes, Andres; Alvarez, Lorena; Alvaro, Gregorio
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Jul 1, 2008
Words:8192
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