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Estado oxidativo de cuerpos luteos maduros y regresivos en bovinos.

Resumen

El objetivo del trabajo fue determinar en diferentes periodos evolutivos el estado oxidativo de los cuerpos luteos (CL) de bovinos, mediante la concentracion de malondialdehido (MDA), dienos conjugados (DC), actividad de superoxido dismutasa (SOD) y su presencia por inmunofluorescencia indirecta (IFI). Para determinar MDA y DC se homogenizaron 30 CL en buffer tris--sacarosa 250 mM pH 7,2 a 4[grados]C. En el sobrenadante se determino MDA por "sustancias reactivas al acido tiobarbiturico" (TBARS) y DC mediante extraccion con isopropanol. Para SOD 26 CL fueron homogenizados en sacarosa 0,25 M en una relacion de 10 ml/g de tejido humedo segun kit Calbiochem. En el caso de la de la IFI de CuZn--superoxido dismutasa se realizaron cortes de 133 CL. Los resultados de MDA, DC y SOD se analizaron estadisticamente por el test "t" con una significancia del 5% y para IFI se aplico estadistica descriptiva. Los CL maduros dieron valores de 25,94 [+ o -] 2,68 nmoles MDA/mg proteina (437,96 [+ o -] 56,61/g de tejido humedo) y el CL en regresion de 6,65 [+ o -] 0,87 (143,04 [+ o -] 15,45) (p<0,001). En los DC se obtuvieron valores de 14,76 [+ o -] 2,60 nmoles/mg proteinas (294,86 [+ o -] 57,96/g tejido humedo) para los CL maduros y de 6,66 [+ o -] 1,76 nmoles/mg proteinas (129,10 [+ o -] 9,8/g tejido humedo) para los CL regresivos (p<0,001). La actividad SOD en CL maduros alcanzo valores de 119,01 [+ o -] 42,38 U/mg proteina, para declinar en forma altamente significativa en los CL en regresion (26,28 [+ o -] 4,38). En el total de CL maduros y en regresion, se evidencio la presencia por IFI, cuyo grado de fluorescencia resulto alto en el 71,25% de los CL maduros y leve en el 71,69% de los regresivos, con una correlacion de 33% entre los dos estadios del CL y la presencia de la enzima (p [menor que o igual a] 0,05). Se concluye que en los CL maduros existe equilibrio entre produccion de radicales libres y estado antioxidante, al compararlos con los CL en estado de regresion.

Palabras clave: bovino, cuerpo luteo, estres oxidativo.

Abstract

The objectives of the present study were: (1) to measure the amount of malondialdehyde (MDA) and conjugated dienes (CD); (2) to determine the antioxidative capacity of the superoxide dismutase enzyme (SOD); and (3) to detect the presence of SOD in mature and regressive corpus luteum (CL) in cattle. Measurement of MDA and CD were performed in 30 CL homogenized in tris--saccharose buffer (250 mM pH 7.2) at 4[degrees]C to obtain the supernatant. TBARS method was used to determine MDA and isopropanol extraction to analyze CD. Calbiochem kit was used to quantify SOD activity from 26 CL. Indirect immunefluorescence (IFI) was used to detect CuZn--SOD presence from 133 CL slides. Statistical differences were determine by the t-test (p<0.05) and IFI results were described based on frequency of immunefluorescence (high, medium, and low). Means of MDA were 25.94 [+ or -] 2.68 and 6.65 [+ or -] 0.87 MDA/mg of protein in mature and regressive CL, respectively (p<0.001). Means of CD were 14.76 [+ or -] 2.60 x [10.sup.-3] and 6.66 [+ or -] 1.76 x [10.sup.-3] nmol/mg protein in mature and regressive CL, respectively (p<0.05). Activity of the CuZn-SOD in mature CL reached values of 119.01 [+ or -] 42.38 U/mg protein but decline sharply in regressive CL reaching 26.28 [+ or -] 4.38 (p<0.001). The presence of the enzyme CuZn--SOD was demonstrated in all CL analyzed. However, 71.25% of mature CL presented high fluorescence as compared to regressive CL, while the majority of regressive CL (71.69%) presented low fluorescence. In conclusion, mature CL hada higher activity of SOD than regressive CL for the present study. These results suggest that mature bovine CL had an increased production of ROS together with an increased antioxidative activity as compared to regressive CL. Possibly this increment could be due to the high steroidogenic capacity of CL during mature stage. Thus, the increase in the antioxidative capacity of the luteal cells prevents the oxidative stress even though there is an increase of ROS assuring that CL could complete its physiological cycle.

Key words: cattle, corpus luteum, oxidative stress.

Oxidative status of mature and regressive corpus luteum in cattle

INTRODUCCION

Los radicales libres (RL), entre ellos las formas reactivas del oxigeno (ROS) se generan constantemente en el organismo, en muchos casos para cumplir funciones fisiologicas; no obstante cuando se producen en exceso pueden provocar estres oxidativo, especialmente ante la presencia de iones como hierro ([Fe.sup.+3]) o cobre ([Cu.sup.+2]). El exceso de ROS puede producir dano a lipidos de las membranas celulares o lipoperoxidacion de proteinas, carbohidratos y ADN (4,11).

Asi como los RL se forman durante el proceso oxidativo normal, en el organismo se sintetizan enzimas capaces de metabolizarlos, las cuales interrumpen la reaccion de peroxidacion de la cadena lipidica por poseer hidrogeniones facilmente donables, lo cual provoca abstraccion de los radicales peroxidos (15). Entre las enzimas antioxidantes se encuentran: superoxido dismutasa (SOD), catalasa, glutation--S--transferasa y glutation peroxidasa (GPx) entre otras (6). Existen tambien otros compuestos capaces de neutralizar la accion de los radicales libres debido a su caracter antioxidante, como las vitaminas E, A, beta--caroteno y glutation (11).

La muerte embrionaria temprana en las vacas es uno de los mayores problemas reproductivos de la ganaderia. Puede ser provocada por gran cantidad de factores, entre los cuales resalta la luteolisis temprana en hembras prenadas, que provoca disminucion de la concentracion de progesterona ([P.sub.4]) e interrupcion de la prenez puesto que la produccion inicial de [P.sub.4] viene dada por el cuerpo luteo (CL).

El CL es una glandula endocrina transitoria que produce [P.sub.4] durante un tiempo determinado. En ausencia de prenez el CL sufre un proceso de regresion conocido como luteolisis, la cual se divide en funcional, por perdida de la capacidad de sintetizar [P.sub.4] Y estructural, por perdida de integridad celular (5). La luteolisis es inducida principalmente por prostaglandina [F.sub.2.sup.[alfa]] ([PGF.sub.2.sub.[alfa]]) y de manera secundaria a traves de otras rutas paralelas mediadas por calcio, citoquinas, ROS y endotelinas. Todos estos factores conducen finalmente a la inhibicion de la esteroidogenesis y/o induccion de la apoptosis (17).

Durante la sintesis de [P.sub.4], el colesterol es transportado a la mitocondria para convertirse en pregnenolona. Los ROS formados en esta reaccion causan peroxidacion lipidica en la mitocondria, pudiendo inhibir de esta manera la actividad del sistema enzimatico mitocondrial y al mismo tiempo servir como reguladores de la sintesis de pregnenolona. Un radical libre muy toxico, el anion superoxido ([O.sub.2.sup.-]), es transformado en las celulas luteales a peroxido de hidrogeno ([H.sub.2] [O.sub.2]), molecula luteolitica que produce inhibicion del transporte de colesterol a la mitocondria, con la subsiguiente disminucion de la sintesis de [P.sub.4] [sup.14]y fallas en el funcionamiento normal del CL, incluyendo la luteolisis prematura, que resulta en muerte embrionaria o abortos espontaneos, lo cual se evidencia por la presencia de vacas repetidoras de celo con el consiguiente efecto negativo sobre la fertilidad del rebano.

El objetivo de este trabajo fue determinar el estado oxidativo de CL bovinos en diferentes periodos evolutivos, mediante la concentracion de malondialdehido (MDA) dienos conjugados (DC), actividad de CuZn--superoxido dismutasa (CuZn--SOD) y presencia de esta enzima por inmunofluorescencia.

MATERIAL Y METODOS

1. Parametros de estres oxidativo

a. Sujetos experimentales, muestras. Se utilizaron 31 hembras bovinas mestizas adultas no prenadas con buena condicion corporal, las cuales se obtuvieron en el Matadero Industrial de Barquisimeto (Estado de Lara, Venezuela). A todos los animales se les determino la presencia de CL por palpacion rectal. Los ovarios fueron separados e inmediatamente colocados en buffer tris--sacarosa 250 mM pH 7,2 a 4[grados]C (hielo), para ser transportados al laboratorio. Cada CL fue pesado, medido su diametro y registrado su aspecto macroscopico. De acuerdo a estas caracteristicas se separaron en dos grupos segun estadio: maduros y en regresion.

b. Determinacion de MDA y DC. Muestras de CL de cada estadio fueron colocadas en buffer tris--sacarosa 250 mM pH 7,2 a 4[grados]C y tratadas en un homogeneizador de embolo y tubo (Potter--Elvehjem). En el sobrenadante se determino la concentracion de MDA por el metodo de "sustancias reactivas al acido tiobarbiturico" (TBARS) (16) y los DC por extraccion con isopropanol (18), (24). Los resultados se expresaron en nmol/mg de proteina y por g de tejido humedo.

c. Concentracion de proteinas totales. En 20 [micron]l del sobrenadante de los homogenizados de cuerpo luteo se determinaron las proteinas totales mediante kit Bio Rad (Richmond, CA, USA), utilizando como standard diluciones de una solucion de 1,41 mg/ml de albumina serica bovina. Las lecturas se realizaron a una longitud de onda de 540 nm en un espectrofotometro Spectronic Genesys 5.

2. Respuesta antioxidante luteal

a. Actividad SOD. Para la determinacion de SOD se homogenizo la muestra con una solucion de sacarosa 0,25M en una relacion de 10 ml/g de tejido y se mantuvo durante todo el proceso a 4[grados]C. Posteriormente se centrifugo a 12.000 rpm por 10 minutos a 4[grados]C, se colecto el sobrenadante y se procedio segun kit Calbiochem (Lajilla, CA, USA). Las mediciones se realizaron en un espectrofotometro Spectronic Genesys 5 a una absorbancia 525 nm a intervalos de 10 segundos durante 3 minutos.

b. Identificacion de Cn--Zn--superoxido dismutasa. Se realizo por inmunofluorescencia indirecta. Los cortes sobre la lamina portaobjeto se desparafinaron y se incubaron con el anticuerpo primario anti SOD--Cu--Zn goat polyclonal IgG (C-17 Santa Cruz Biotechnology) diluido en solucion de buffer fosfatada (PBS) 1:200 (dilucion previamente estandarizada), y se dejo reposar durante una hora a temperatura ambiente. Seguidamente, protegido de la luz y a temperatura ambiente se procedio a incubar con el anticuerpo secundario anti goat IgG FITC conjugate (Catalogo 075-10 VMRD Inc.) conjugado con isotiocianato de fluoresceina y diluido 1:50 con PBS. La muestra utilizada como control negativo no fue incubada con el anticuerpo primario. Finalmente, a cada muestra se le agrego el medio de montaje para fluorescencia y se protegio con cubreobjetos para ser observada en el microscopio de fluorescencia (Lieder ME--600).

3. Analisis estadistico

Los datos obtenidos en las determinaciones de parametros de estres oxidativo y actividad enzimatica se sometieron a estudio estadistico mediante el test de "t" de Student. Las diferencias de las medias fueron consideradas significativas para una p < 0,05. Para analizar los resultados de la presencia de actividad CuZn--SOD en CL, se realizo estadistica descriptiva (media aritmetica y desvio estandar, X [+ o -] DE), en todos los casos empleando el paquete estadistico SPSS 10.0 para Windows.

RESULTADOS Y DISCUSION

Cuantificacion de la lipoperoxidacion

En la Tabla 1 se muestra la concentracion de MDA y DC en homogenizados de CL bovinos en estadios de madurez y regresion. La concentracion de MDA, producto final del proceso de lipoperoxidacion (LPO), fue cuatro veces mayor en los CL maduros (p<0,001). Tambien en estos la concentracion de DC (productos iniciales de la LPO) se presento dos veces mayor a la obtenida en los CL en regresion, con una diferencia significativa entre los dos grupos (p<0,05). Todo ello indica que el proceso de LPO se lleva a cabo en el estadio de madurez, sentando las bases para el inicio de la luteolisis.

Tales hallazgos son concordantes con los reportados por otros autores (23) quienes verificaron que en la mujer, la maxima capacidad esteroidogenica del CL se manifiesta en el estadio intermedio de la fase luteal (CL maduro), en coincidencia con bajos niveles de glutation reducido, el cual es un agente antioxidante, altos valores de MDA y elevada actividad de SOD, que degrada al radical superoxido. En los CL en regresion se observo una drastica disminucion de la actividad pro--oxidante, evidenciada por la disminucion de los valores de MDA y DC, mientras que en el CL maduro se observo un aumento de estos parametros y en consecuencia un efecto de LPO de las membranas lipidicas. Estos hechos concuerdan con la aumentada actividad de SOD observada en este trabajo en el CL maduro y con la presencia de la enzima en este estadio evolutivo.

Queda demostrado que hay una notable actividad pro--oxidante en las celulas luteales maduras al mismo tiempo que existe aun alta capacidad antioxidante, lo que permite que este organo endocrino temporal siga ejerciendo su funcion sin que ocurra una degeneracion luteal prematura. Una vez que llega al maximo de produccion debe existir un agotamiento de la actividad enzimatica, lo que podria dar inicio a un estado de estres oxidativo (7). Este estado traeria como consecuencia el proceso de lipoperoxidacion de las membranas celulares, lo que contribuiria al inicio de la luteolisis.

Respuesta antioxidante luteal

a. Actividad de SOD

Teniendo en cuenta que la actividad SOD en la fase inicial fue de 1,573 [+ o -] 0,54 U/ml, la Figura 1 indica que en CL maduros alcanzo valores de 4,002 [+ o -] 0,596 U/ml (incremento de 60,68%), para declinar un 70,83% en la fase de regresion con una media de 1,167 U/ml.

En ovejas se registro un desbalance en los agentes pro--oxidantes/antioxidantes durante la prenez, debido al estres que implica este estadio fisiologico (10). Los resultados aqui obtenidos para la actividad SOD en las distintas etapas del CL, se asemejan a los reportados por otros autores, quienes indican que la enzima disminuye en el cuerpo luteo humano en regresion con respecto a la fase de madurez (2, 23).

En la fase luteolitica, el balance de la actividad de las enzimas luteoliticas puede determinar la distribucion de ROS (25). En los valores obtenidos se observo un incremento de la actividad SOD en la etapa de madurez, cuando los niveles de [P.sub.4] son maximos, lo cual cumple la funcion de proteger localmente contra el aumento de los RL producidos en esta etapa.

Se afirma que las actividades de SOD y catalasa se incrementan 6-8 veces desde el dia 6 al 16 del ciclo estral y luego descienden durante la regresion luteal; asi la catalasa disminuye cerca del 40% y la SOD alrededor del 60%. Ha sido demostrado que el superoxido producido en el sistema xantina--oxidasa inhibe la sintesis de [P.sub.4] en celulas luteales de rata y produce danos en las celulas luteales, inhibiendo proteinas de membrana y aumentando la fluidez de la membrana. Los niveles altos de catalasa y SOD al dia 16, donde la sintesis de progesterona es maxima, probablemente tengan la funcion de proteger localmente contra los RL producidos (19). La correlacion de la esteroidogenesis con los niveles de las enzimas estudiadas en esta investigacion, indica que los mecanismos antioxidativos son activados por el estres oxidativo asociado a la sintesis de hormonas esteroideas, en coincidencia con lo reportado por otros autores (19).

b. Identificacion de Cu--Zn--SOD

En todos los cortes histologicos de CL maduros sometidos a la tecnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI) se observaron abundantes granulos fluorescentes homogeneos, de variado tamano, distribuidos de forma multifocal e intracitoplasmaticos, tanto en celulas luteales grandes como pequenas, todas ellas diferenciadas del tejido de fondo no fluorescente, lo que confirio mayor contraste al preparado. Estos resultados corroboraron que la enzima CuZn--SOD se ubica en el citoplasma de las celulas del CL maduro.

Al comparar cualitativamente la cuantia de granulos fluorescentes, se constato que 57 CL maduros (71,25%) presentaron alto contenido, 22 de ellos (27,5%) mostraron moderado contenido y solo un CL (1,25%) revelo contenido escaso. Por su parte, al observar bajo el microscopio de fluorescencia los cortes histologicos del total de CL en regresion, se evidencio escasa cantidad de pequenos granulos verdes fluorescentes homogeneos contenidos en el eitoplasma de las celulas luteales y distribuidos multifocalmente. El tejido de fondo tampoco presento fluorescencia, lo que indico la expresion de la enzima Cu--ZnSOD en el citoplasma de las celulas del cuerpo luteo en regresion.

[FIGURA 1 OMITIR]

Cuando se comparo cualitativamente la presencia en mayor o menor grado de los granulos de fluorescencia se obtuvo que 38 CL en regresion (71,69%) presentaron un leve contenido de granulos fluorescentes, mientras que los restantes 15 CL (28,3%) presentaron moderado contenido de granulos fluorescentes (Figura 2).

Cualitativamente pudo evidenciarse una mayor expresion de la enzima CuZn--SOD en los CL maduros que en los regresivos. Ademas, existio asociacion significativa con una correlacion del 33% (p [menor que o igual a] 0,05) entre los dos estadios de CL y la presencia de granulos de inmunofluorescencia en el citoplasma de las celulas luteales (Figuras 3, 4, 5 y 6).

Estos resultados concuerdan con los obtenido por autores que reportan que en bovinos el CL maduro expresa significativamente mayores niveles de CuZn--SOD y Mn--SOD al compararlo con el CL en regresion, por lo cual concluyen que durante la luteolisis ocurre una disminucion en la expresion de genes especificos encargados de la respuesta oxidativa (3,7,20), y que mantener la expresion de esos genes en el CL durante la prenez puede prevenir el dano oxidativo y retrasar la regresion, etapa en la cual el balance de la actividad de las enzimas luteoliticas puede determinar la distribucion de las ROS (25). Nuestros hallazgos tambien se asemejan a otros anteriormente reportados, indicando que la actividad SOD presenta un aumento creciente desde la fase inicial a la media en el CL humano y disminuye en forma gradual, por lo cual los valores mas bajos se presentan en la fase de regresion (21,23)

Un aumento en dicha actividad enzimatica durante la gestacion temprana fue evidenciada por autores que aseveran que la gonadotropina corionica humana (HCG) puede ser importante para mantener la integridad de la celula luteal cuando ocurre la gestacion (22) Anteriormente otros investigadores habian reportado que la prolactina y los lactogenos placentarios estimulaban la expresion de SOD en ratas, fenomeno importante para mantener la capacidad esteroidogenica de dichas celulas (21).

[FIGURA 2 OMITIR]

El estres oxidativo provocado por la disminucion de vitamina E antes del parto, ha sido relacionada con la aparicion de retencion placentaria, por accion de los lipoperoxidos o retrasos en la aparicion del primer celo (6). Se ha senalado que las hembras bovinas que presentan una mayor generacion de ROS en celulas luteales mostraran peroxidacion lipidica, afectando a sus membranas, con importantes consecuencias como perdida de receptores para gonadotrofinas, disminucion de la formacion de adenosin--monofosfato ciclico o de la capacidad esteroidogenica del CL durante la involucion.

Existe una alta correlacion entre el aumento de la actividad SOD en los CL bovinos maduros y la presencia de la enzima por IFI en los CL en la misma etapa, lo cual demuestra que durante esta fase hay una alta expresion de la enzima, posiblemente como resultado del aumento de la sintesis de [P.sub.4], lo que representaria un importante mecanismo de defensa celular, porque en la fase de madurez del CL se determino que el proceso de peroxidacion lipidica luteal esta aumentado (15). Por esta razon la actividad de la enzima se encuentra en niveles maximos, confirmando el reporte de otros autores quienes indican que la actividad SOD en el CL de ratas prenadas y conejas pseudoprenadas, es tambien paralela a la concentracion de progesterona del plasma (12,13), lo que indicaria que la actividad SOD es corregulada con la esteroidogenesis del CL de animales con diferentes perfiles del ciclo estral (19).

[FIGURA 3 OMITIR]

[FIGURA 4 OMITIR]

Sin embargo, anteriormente fue evidenciado un aumento progresivo en las actividades CuZn--SOD y GPx durante las diferentes etapas (inicial, media y final) del CL en ovejas, con un mayor aumento en la fase final, ademas de un aumento en la actividad de Mn--SOD y glutation S--transferasa, hallazgos que permiten inferir que la capacidad antioxidante no esta correlacionada con el estado esteroidogenico de las celulas (1), resultado que difiere al encontrado en la presente investigacion. Los mismos investigadores demostraron un aumento en la actividad de enzimas antioxidantes durante los primeros 40 dias de gestacion en ovejas, e indicaron que este aumento puede estar ligado a las ROS generadas continuamente en las celulas luteales esteroidogenicamente activas y estaria implicito en el mantenimiento de la actividad esteroidogenica luteal y la integridad celular durante la gestacion temprana (2).

[FIGURA 5 OMITIR]

[FIGURA 6 OMITIR]

Al valorar la actividad de las enzimas CuZn--SOD, Mn--SOD, catalasa, GPx y glutation reductasa a las 0, 12, 24 y 48 horas despues de la inyeccion de [PGF.sub.2][alfa] durante el dia DO del ciclo estral de ovejas, se evidencio que esta hormona induce muerte de las celulas luteales sin alterar la actividad de dichas enzimas antioxidantes, solo la catalasa aumento a las 12 y 24 horas despues del tratamiento, sugiriendose que ese aumento transitorio es una respuesta de adaptacion del CL al proceso oxidativo causado por la [PGF.sub.2][alfa] (8). Sin embargo, los efectos de esta hormona en el sistema de SOD y GPx del CL no han sido aclarados todavia, aunque la regresion luteal es causada parcialmente por el incremento de las ROS (11).

Las ROS estimulan la produccion de [PGF.sub.2][alfa] en celulas del endometrio humano y estas pueden afectar la funcion endometrial al regular la produccion de dicha hormona (22). Al respecto, en CL en regresion de ratones (comparado con CL funcionales), se observo un aumento de la ciclo--oxigenasa--2, enzima limitante de la sintesis de prostaglandinas, asi como aumento de la peroxidacion lipidica y de la actividad SOD total, ademas de una disminucion en la actividad de la catalasa (9).

Para los diferentes mecanismos capaces de aumentar la expresion de SOD, algunos investigadores reportan un incremento in vitro de la expresion de esta enzima en celulas endometriales humanas inducida por estrogenos y progesterona, ademas indican que en el caso de la Mn--SOD este aumento ocurre por via del AMPc (22).

En base a estos resultados se puede concluir que existe produccion de radicales libres y actividad SOD, asi como presencia de la enzima en el CL maduro al comparado con el CL regresivo. Ello puede deberse a la alta capacidad esteroidogenica de este organo durante el estadio de madurez, el cual merced a su gran poder antioxidante no padece estres oxidativo, asegurando el cumplimiento de la vida media del CL funcional.

Agradecimientos. Al CDCHT de la UCLA por el financiamiento para realizar este trabajo. A la Asociacion El Tunal por facilitar los animales.

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Recibido: 11 febrero 2011/Aceptado: 24 mayo 2011

Marquez, Y.C. [1]; Marquez, A. [1]; Fuentes, M. [3]; Salas, Y. [2]; Lopez--Ortega, A. [1]

[1] UNHIM, [2] Area de Patologia Animal y [3] Area de Investigacion, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Centroccidental "Lisandro Alvarado" (UCLA), Barquisimeto (Lara, Venezuela). Tel. 0251-2592630.

Email: isabelmarquez@ucla.edu.ve.
Tabla 1. Concentracion de MDA y DC en CL maduros
y regresivos.

estadio del CL MDA DC

maduro 24,94 [+ o -] 2,68 (a) 14,70 [+ o -] 2,60 (a)
en regresion 6,65 [+ o -] 0,87 (b) 6,66 [+ o -] 1,70 (b)

CL: cuerpo luteo, MDA: malondialdehido (nmol/mg proteina),
DC: dienos conjugados (mol/mg proteina [10.sup.-5]). Los
valores representan X [+ o -] DS. Letras distintas en la misma
columna indican diferencias significativas.
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Author:Marquez, Y.C.; Marquez, A.; Fuentes, M.; Salas, Y.; Lopez-Ortega, A.
Publication:Revista Veterinaria
Date:Jul 1, 2011
Words:5014
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