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Establecimiento y caracterizacion de una linea celular derivada de un glioblastoma multiforme.

RESUMEN

Introduccion: Las lineas celulares y los cultivos primarios son una excelente herramienta para el estudio de la biologia, desarrollo y respuesta a la terapia en tumores cerebrales.

Objetivo: Establecer y caracterizar una linea celular derivada de un glioblastoma multiforme como un modelo de estudio in vitropara la extrapolacion y aplicacion futura en terapia genica.

Material y metodos: Se obtuvo una muestra de un paciente con diagnostico clinico e histopatologico de glioblastoma multiforme, se caracterizo mediante inmunohistoquimica en cortes de tejido y por inmunocitoquimica sobre celulas cultivadas a partir del tumor desde el inicio del cultivo y durante los seis primeros pases, con dos tipos de marcadores especificos para glia: GFAP (glial fibrillary acidic protein) y S-100 (proteina de union a calcio). Ademas, se evaluo la expresion de p53 y Bcl-2, como moduladores de apoptosis. Por ultimo se hizo la caracterizacion citogenetica.

Resultados: Histopatologicamente, se confirmo el diagnostico de glioblastoma multiforme. En los cultivos primarios se encontraron caracteristicas citomorfologicas propias de un glioblastoma: celulas fibroblastoides planas, celulas con escaso citoplasma con 3 o mas procesos y por ultimo bipolares o unipolares. Se encontro una expresion diferencial con los cuatro marcadores, con un patron de marcaciones a nivel citoplasmatico y nuclear a traves de los pases estudiados. La linea celular se caracterizo por ser en su mayoria aneuploide con un numero modal cromosomico entre 43 y 45, con un gran numero de poliploidias (55-102 <4n>, XXYY) y endo-reduplicaciones (end 45, X, -Y).

Conclusion: Se establecio una linea celular derivada de un glioblastoma multiforme con un fenotipo estable, con un notable mantenimiento del perfil glial y citogenetico.

Palabras clave: Linea celular; Glioblastoma multiforme; Inmunocitoquimica; Inmunohistoquimica; Bcl-2, p53.

Initiation and characterization of a glioblastoma multiforme derived cell line

SUMMARY

Introduction: Cell lines and primary cultures are a useful tool for studying basic biology, development and therapy responses in cancer and nervous system tumors.

Aim: To establish and characterize a human glioblastoma multiforme (GBM) derived cell line as an in vitro biological model to study nervous system cancer chemotherapy and gene therapy.

Materials and methods: A resected tumor piece was obtained from a patient with clinical and histopathological diagnosis of GBM. It was processed to obtain viable cells to culture and histological sections, which were immunostained to glial fibrillary acid protein (GFAP) and S-100 protein (calcium binding protein) and to evaluate expression of apoptosis related proteins p53 and Bcl-2. Finally a cytogenetic evaluation was carried out.

Results: Histopathological examination confirmed classic findings of GBM. Typical cytomorphological features of GBM were found in cells of the primary cultures: bipolar or unipolar cells, flat fibroblastoid cells, process-bearing cells with scant cytoplasm and 3 or more processes. It was found a differential expression of the four markers, which had a nuclear and cytoplasmatic staining pattern throughout studied subcultures. Cell line exhibited a high level of aneuploidy with modal chromosomal number between 43-45, with presence of poliploidy (55-102 <4n>, XXYY) and endoreduplication (end 45, X, -Y).

Conclusion: It was established a GBM derived cell line with a stable phenotype, maintaining morphological cell and cytogenetic characteristics.

Keywords: Cell Line; Human glioblastoma multiforme;Immunocytochemistry; Immunochemistry; Bcl-2, p53.

Los tumores gliales constituyen el grupo mas comun de tumores intracraneanos y de estos, el glioblastoma multiforme (GBM, grado IV de la OMS) sobresale por su malignidad, su rapida evolucion y resistencia a las medidas terapeuticas convencionales: irradiacion y quimioterapia despues de la cirugia (1-5). Este tumor se caracteriza por hipercelularidad glial, nucleos atipicos (pleomorfismo nuclear, multinucleacion, cromatina nuclear gruesa), actividad mitotica visible y proliferacion vascular prominente con hiperplasia endotelial, frecuentemente tan intensa que causa obstruccion vascular y por ende abundantes areas de necrosis tisular que actuan a su vez como estimulo hipoxico inductor de angiogenesis (1-3).

Los conceptos generales de la biologia de los gliomas incluyen la hipotesis que los defectos en la via que regulan la susceptibilidad a la apoptosis estan comprometidas en el desarrollo y progresion de su malignidad, asi como en la resistencia intrinseca a la quimioterapia adyuvante (2-8).

Durante la apoptosis, los cambios morfologicos observados en la celula, son la manifestacion de reacciones bioquimicas intercelulares. La maquinaria enzimatica responsable de estos cambios la constituyen principalmente las caspasas. Se han descrito dos vias que conducen a su activacion, la via extrinseca que se inicia en la membrana celular y es mediada por ligandos que se unen a sus receptores y la via intrinseca que se inicia en la mitocondria y es mediada por estres celular o por lesion en el AND (8.9). A los mecanismos intrinsecos de la apoptosis los controlan las proteinas y genes de la familia Bcl-2. Los productos de esta familia de genes pueden actuar como promotores ([p21.sup.BAX], Bcl-xS, etc) o inhibidores (Bcl-2, Bcl-xL) de apoptosis (8-12).

La expresion de proteinas de la familia Bcl-2 en gliomas malignos se analizo in vivo; mediante analisis inmunohistoquimico se encontro una expresion en 70% de los tumores cerebrales analizados (6,7). A su vez, se informo una alta expresion de Bcl-2, Bcl-x y Bax en gliomas, sobre todo en glioblastomas recurrentes (8-12). La expresion de esta familia de genes se puede regular de modo diferencial en asociacion con la progresion del tumor y la diferenciacion (10). Ademas, se encontro la expresion de proteinas anti y pro-apoptoticas de la familia Bcl-2 en lineas celulares de glioma humano (9-13).

Las anormalidades mas comunes a nivel genetico en canceres humanos son las mutaciones en p53, que es un activador transcripcional de corta vida que puede inducir apoptosis (14-16). Se ha informado la expresion de p53 en astrocitomas (difusos y anaplasicos) y en glioblastomas multiformes (9). Las mutaciones en p53 se presentan en mas de 30% de los gliomas, como un hecho temprano, para sugerir que las anormalidades de p53 estan comprometidas con el desarrollo de los gliomas. Es interesante resaltar que la incidencia de las mutaciones de p53 en lineas celulares de gliomas es similar a la que se informa para tumores cerebrales primarios, e indica que estas lineas son herramientas utiles para investigar el papel antineoplasico del gen p53 de forma silvestre en los gliomas (9,16,17). Es comun la perdida de heterocigocidad del cromosoma 10 en el GBM y podria muy posiblemente causar la disfuncion de un gen supresor de tumor adicional (14).

Las lineas celulares y los cultivos primarios se emplean en diferentes estudios de oncogenesis pues aportan un modelo importante para estudiar las caracteristicas y funciones del tumor del que proceden. Una linea celular muestra caracteristicas muy bien definidas, son mas sencillas de manejar que los cultivos primarios, crecen continuamente y se puede obtener un mayor numero de celulas, aunque pierden muchas de sus propiedades respecto a la muestra original del tumor y presenta cambios progresivos en el numero de cromosomas (18,19). Como el fenotipo estable de la linea celular surge de un cultivo primario a traves del tiempo, se hace necesario caracterizar las celulas en dos aspectos fundamentales:

1. Por su origen glial, que determina el aspecto del linaje.

2. Determinar si son verdaderamente neoplasicas (19).

Los cultivos primarios de tumores cerebrales de estirpe neuroepitelial y mesenquimal son un magnifico banco de pruebas para el estudio de las caracteristicas citocineticas y oncogenicas, asi como para comprobar in vitro la quimio o radiosensibilidad de las mismas caracteristicas (18).

El proposito de este estudio fue establecer una linea celular derivada de un GBM como un metodo de estudio in vitro para la extrapolacion y aplicacion futura en estudios de terapia genica para glioblastoma. Para la caracterizacion por inmunocitoquimica e inmunohistoquimica se utilizaron dos tipos de marcadores especificos para glia, previamente caracterizados: GFAP (glial fibrillary acidic protein) (20-22) y S-100 (23). Y a su vez se evaluo la expresion de p53 y Bcl-2, como moduladores de apoptosis. Por ultimo se hizo la caracterizacion citogenetica.

MATERIALES Y METODOS

Recoleccion de la muestra. Se tomo una muestra representativa del tumor en condiciones de total asepsia en el propio quirofano de neurocirugia, previo consentimiento informado de un paciente de 66 anos con diagnostico clinico y radiologico de GBM. La muestra se dividio en dos porciones, la primera se utilizo para el establecimiento del cultivo primario y se coloco en DMEM suplementado con antibiotico (penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 mg/ml) y anfotericina (0.25 mg/ml) y la segunda se transporto en paraformaldehido (PFA) al 4% para el analisis por inmunohistoquimica.

Cultivo primario obtenido a partir de un GBM. La muestra se corto en pequenos fragmentos, que se incubaron a 37[grados]C por 30 minutos en medio completo (DMEM, suero fetal bovino al 10% (SFB), antibiotico y anfotericina) con colagenasa (2 mg/ml, Gibco BRL) y dispasa (5 mg/ml, Gibco BRL). Se realizo una disociacion mecanica con pipeta Pasteur y se centrifugo a 1000 rpm por 7 minutos. Se sembraron la suspension celular y los explantes celulares en frascos de cultivo de 25 [cm.sup.2] en medio completo. Se incubo a 37[grados]C con 5% de C[O.sub.2] y se hizo el cambio de medio cada 48 horas.

Se realizaron pases sucesivos cuando el cultivo primario alcanzo una confluencia mayor de 70% mediante disociacion de la monocapa celular con tripsina al 0.25 %. La viabilidad celular se midio por el metodo de exclusion con azul tripan y recuento en camara de Neubauer. En el microscopio de contraste de fase se efectuo el seguimiento diario del crecimiento de las celulas en cultivo con un registro fotografico en los diferentes dias de cultivo y a traves de los pases sucesivos.

Criopreservacion de la linea celular. Desde el establecimiento y durante los diversos pases se criopreservo la linea celular en DMEM al 40% suplementado con SFB al 50% y DMSO 10% y se almaceno en nitrogeno liquido a -196[grados]C.

Anticuerpos utilizados. Se utilizaron los siguientes anticuerpos para el analisis inmunoquimico: un anticuerpo policlonal de conejo contra GFAP, en dilucion 1/250 (DAKO Z0334), anticuerpo anti-S-100, en dilucion de 1/ 500 (DAKO, ZO31), un anticuerpo monoclonal para p53, que reconoce los aminoacidos 211 a 220 tanto de la proteina silvestre como de la mutada, en una dilucion de 1/ 25 (Chemicon, CBL404) y por ultimo un anticuerpo policlonal anti-Bcl-2 humano, en dilucion de 1/500 (Beckton Dickinson, Ref 554160).

Inmunohistoquimica. Se hicieron cortes sucesivos de 10 mm a partir de bloques parafinados. Se coloreo con hematoxilina eosina para el analisis histopatologico. Las laminas se incubaron en un horno a 60[grados]C por 30 minutos, se desparafinaron con xilol y se rehidrataron con concentraciones descendentes de alcohol etilico. Se hizo un paso de recuperacion antigenica con amortiguador de citrato para cubrir totalmente las laminas y luego se llevaron al autoclave donde se las dejo hasta 15 libras de presion por 10 minutos. Despues se inactivo la peroxidasa endogena por 30 minutos con [H.sub.2][O.sub.2] al 3% preparada en PBS. Las celulas inmuno-reactivas se descubrieron con los anticuerpos primarios descritos antes preparados en PBS con 5% suero de caballo durante 30 minutos a 37[grados]C en camara humeda. Luego se incubo con un anticuerpo secundario (anti-IgG de conejo biotinilado o un anti-IgG anti-raton biotinilado, a una concentracion 1/200 Vector Labs). Se agrego estreptavidina acoplada a peroxidasa (1 mg/ml, Vector Labs) por 20 minutos a temperatura ambiente. Se revelo con una mezcla 1:1 de [H.sub.2][O.sub.2] al 0.02% y diaminobenzidina (3 mg) en Tris-HCl (pH 7.2). Se agrego sulfato de cobre por 5 minutos, se tineron con hematoxilina, se deshidrataron y se montaron en Poly-mount con cubreobjetos. La metodologia se llevo a cabo de acuerdo con protocolos estandar ya informados (29).

Ademas, se siguio el mismo proceso en distintos cortes de tejido de un melanoma humano (DAKO, T1241) que se emplearon como controles positivos con los diferentes anticuerpos para la tecnica inmunohistoquimica.

Inmunocitoquimica. Aproximadamente 5,000 celulas a partir del cultivo primario se sembraron en cajas de 24 pozos (Corning 25870) sobre cubreobjetos redondos pre-tratados con poli-L-lisina (10 mg/ml) durante el primero, segundo, tercero y sexto pases. Al quinto dia de cultivo las celulas se fijaron con PFA al 4% por 30 minutos y, se protegio la monocapa con gelatina al 0.5% por 10 minutos a 0[grados]C para evitar su desprendimiento. Luego se permeabilizo con triton X-100 por 30 minutos y se inactivo la peroxidasa endogena con [H.sub.2][O.sub.2] al 0.5% en metanol al 50% por 45 minutos. Las celulas inmuno-reactivas fueron detectadas mediante los anticuerpos primarios descritos antes, preparados en PBS con 5% suero de caballo durante 30 minutos a 37[grados]C en camara humeda. Luego se incubaron con un anticuerpo secundario (anti-IgG de conejo biotinilado o un anticuerpo anti-IgG anti-raton biotinilado, a una concentracion 1/200 Vector Labs). Despues se agrego estreptavidina acoplada a peroxidasa (1 mg/ml, Vector Labs) por 30 minutos a temperatura ambiente y se revelo con una mezcla 1:1 de [H.sub.2][O.sub.2] al 0.02% y diaminobenzidina 0.1% en Tris-HCl (pH 7.2). Las celulas se contracolorearon con haemalum de Mayer, se deshidrataron y montaron en Poly-mount. En la metodologia se siguieron las tecnicas estandar ya informadas (29). En un microscopio triocular con 40 X se contaron distintos campos hasta completar 100 celulas, entre celulas inmunoreactivas y no inmuno-reactivas. Se efectuo el recuento celular en 3 replicas para cada tiempo analizado (n=3).

Inmunofluorescencia indirecta. El metodo en la primera parte fue el mismo que se empleo para inmunocitoquimica. Se coloco un anticuerpo contra GFAP (DAKO) en camara humeda por 1 hora a 37[grados]C. Despues de lavar con PBS, se incubo por 30 minutos a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario anti-IgG de conejo biotinilado (Vector Labs). Luego se agrego estreptavidina conjugada a CY3 (1/400, Sigma) por 30 minutos a temperatura ambiente. Las laminas se montaron con glicerol amortiguado 9:1 y se observaron en un microscopio de epifluorescencia.

Obtencion de preparados cromosomicos a partir de cultivo primario de GBM. La monocapa celular se disocio con tripsina al 0.25% preparada en PBS. Se sembro 1 ml de suspension celular en una lamina portaobjetos, y se dejo en adhesion por 50 minutos y luego se completo el volumen con 14 ml de medio completo, y se incubo por 48 horas. Se adiciono colchicina (100 mg/ml) por 3 horas a 37[grados] C, se agregaron 15 ml de solucion hipotonica (KCl 0.052 M a 37[grados]C) por 10 minutos y luego 2 ml de fijador Carnoy (3: 1 metanol y acido acetico) gota a gota por las paredes de la caja por 10 minutos. Se paso la lamina portaobjeto a una caja de Petri con 15 ml de fijador frio por 50 minutos, se saco cuidadosamente y se secaron las laminas a temperatura ambiente. Estas se incubaron en 2X SSC a 60[grados]C durante 30 min, se lavaron con abundante agua de chorro y se dejaron secar a temperatura del medio. Se agrego una solucion de tripsina (1/125) en agua destilada, se colocaron en solucion por 1 a 5 segundos agitando con suavidad. Luego se sacaron, se lavaron con abundante agua de chorro, se secaron a temperatura ambiente, se colorearon con Giemsa durante 10 min. Por ultimo, se observaron y se fotografiaron a 1,000 X de aumento.

RESULTADOS

Caracterizacion inmunohistoquimica de tejidos de GBM. Histopatologicamente, se encontro una marcada proliferacion microvascular (Foto 1A) y focos de necrosis. A su vez, se observaron fragmentos de una lesion tumoral constituida por celulas pleomorficas, algunas gigantes, con marcas atipicas, nucleos angulados, hipercromaticos, inmersas en una matriz fibrilar, figuras mitoticas y necrosis fibrinoide de las paredes vasculares. Todos los marcadores presentaron inmuno-reactividad principalmente en el citoplasma, pero se observo marcacion nuclear para p53 y Bcl-2. En la Foto 1 se muestran los diferentes marcadores estudiados, para GFAP (1B) se presento inmunoreactividad en el citoplasma, S-100 (1C) mostro marca nuclear y citoplasmatica, p53 (1D) fue positivo en los nucleos de las celulas tumorales y para Bcl-2 (1E) la marcacion fue citoplasmatica. A su vez, se utilizaron como controles positivos cortes de tejido de melanoma humano donde se observo inmuno-reactividad; para cada uno de los marcadores estudiados, se muestra solamente la marcacion especifica obtenida para Bcl-2, como ejemplo (1F).

Cultivos primarios de celulas de GBM. En los cultivos primarios se encontraron caracteristicas citomorfologicas propias de un GBM, con celulas gigantes multinucleadas, celulas sincitiales fusiformes pequenas que varian en su extension, con tendencia a fusionarse entre sus prolongaciones (Foto 2A). Se logro establecer el cultivo en los primeros 22 dias cuando se hizo la descripcion detallada para los diversos tipos celulares. Al cuarto dia del aislamiento celular, se observaron distintos tipos celulares diferenciales (2A, muestra uno de los explantes en el lado inferior de la microfotografia en contraste de fase), se aprecia un fenotipo estable que emergio del cultivo a traves del tiempo como se puede apreciar a los 10 dias de cultivo (2C) y que se hace mas notorio a los 22 dias (2D). Se encontro migracion de las celulas, pues se disponian inicialmente en forma radial con celulas bipolares y unipolares de gran tamano, para luego transformarse con rapidez en elementos fibroblastoides (flechas, Figura 2B). Una vez el cultivo alcanzo una confluencia de 70% se realizo el primer subcultivo, durante los primeros seis pases se hizo la caracterizacion celular, donde ya se observaba un fenotipo estable con un predominio de celulas unipolares y bipolares; es de anotar que en pases posteriores (pase 30) la caracterizacion morfologica indico un comportamiento identico.

Caracterizacion inmunocitoquimica de las celulas de cultivos de GBM. Los analisis inmunocitoquimicos con los marcadores gliales (GFAP y S-100) demostraron un gran numero de celulas positivas, se observo una marcacion citoplasmatica uniforme e irregularmente observada en el nucleo. El patron de coloracion fue filamentoso o compacto y homogeneo en los tres diferentes tipos celulares identificados: celulas fibroblastoides planas, grandes, con gran cantidad de citoplasma respecto del nucleo (cabeza de flecha, Foto 3C), el segundo tipo correspondio a celulas con escaso citoplasma con 3 o mas procesos (flechas oscuras, Foto 3A) y por ultimo celulas bipolares o unipolares (flechas claras, Foto 3E-3G).

El patron de las marcas a traves de cada uno de los pases con los cuatro marcadores fue muy heterogeneo, en la mayoria de los casos fue citoplasmatico (GFAP y S- 100), aunque eventualmente se observo expresion en el nucleo (p53). En la Foto 3 se ven celulas positivas con los diferentes marcadores, con anti-GFAP (3A) mediante inmunoperoxidasa indirecta y por inmunofluorescencia indirecta en el primer pase (3B) donde se aprecia el patron filamentoso caracteristico, anti-S-100 (3C), anti-p53 en el segundo pase (3D) donde se muestra una marca celular tenue, anti-p53 en el sexto pase de cultivo (3E) con una marcacion intensa, anti-Bcl-2 en el tercer pase (3F) y sexto pase con marcacion intensa (3G).

Respecto a la frecuencia de la expresion, se hizo un recuento de las celulas inmuno-reactivas y no inmunoreactivas para los diferentes marcadores; los datos se presentan como proporciones en la Grafica 1. Para GFAP se evidencio 79% de expresion en el primer pase; 96.3% en el segundo; 82% en el tercero; y 100% en el sexto pase (Grafica 1, diamantes). Para S-100 se encontro 77.3% de expresion en el primer pase; 81% en el segundo; 96% en el tercero; y 94% en el sexto pase (Grafica 1, circulos). A medida que las celulas se diferenciaban, se evidencio mayor expresion de los marcadores gliales. En caso contrario, para p53 no se encontro expresion en el primer pase, para los pases segundo y tercero se encontro una baja expresion, con una marca tenue solo en el citoplasma (21 % fueron positivas) y en el sexto pase se aprecio 95.3% de expresion que comprometia tanto el citoplasma como el nucleo (Grafica 1, cuadrados). Para Bcl-2 en los pases primero y sexto, se vio que todas las celulas eran positivas (100%), en el segundo 90.3%, y en el tercer pase solo 8.4% de las celulas fueron positivas (Grafica 1, triangulos); esto puso de manifiesto un proceso de indiferenciacion celular.

[GRAFICA 1 OMITIR]

Analisis citogenetico. Las diferentes mitosis estudiadas a partir de los cultivos primarios se caracterizaron por ser en su mayoria aneuploides con un numero modal cromosomico entre 43 y 45, siendo la mas frecuente la monosomia del cromosoma Y (45, X, -Y) como se aprecia en la Foto 4A. Se observo un gran numero de poliploidias (55-102 <4n>, XXYY) (Foto 4 C-D) y endoreduplicaciones (end 45, X, -Y) (Foto 4B).

DISCUSION

Muchos de los progresos conseguidos en oncogenesis, desarrollo y respuesta a la terapia de los tumores cerebrales han sido posibles gracias a estudios in vitro, como las tecnicas de calculo de la cinetica celular en gliomas, la comprension de las interacciones entre celulas gliales, neuronas, celulas endoteliales y tumorales, o la identificacion de los mecanismos celulares implicados en la resistencia a ciertos medicamentos (18). Un paso imprescindible en el estudio de los cultivos de tumores cerebrales es caracterizar las celulas de los cultivos resultantes (4). Habitualmente las tecnicas de citomorfologia e inmunohistoquimica son las mas empleadas, aunque las pueden complementar metodos como la hibridacion in situ, la histoquimica enzimatica y la microscopia electronica (18,19).

Las lineas celulares y los cultivos primarios, son una herramienta indispensable para investigar la biologia de los tumores cerebrales. Por tanto, en este estudio se quiso establecer una linea celular inmortalizada a partir de un tejido obtenido de un paciente diagnosticado clinicamente con GBM. Mediante el analisis histopatologico se encontro tanto proliferacion microvascular como necrosis, rasgos diagnosticos esenciales, que confirman las caracteristicas de GBM de acuerdo con la clasificacion WHO (2,25).

En cuanto a la caracterizacion celular, se encontro en los cultivos primarios una migracion de las celulas, que se disponen inicialmente en forma radial con celulas bipolares y unipolares de gran tamano, para luego transformarse con rapidez en elementos fibroblastoides, un patron celular caracteristico en estos cultivos que concuerda con estudios anteriores (20-22). En pases posteriores (pase 30) al hacer la caracterizacion morfologica se hallo un fenotipo estable a traves del tiempo, con un predominio de celulas unipolares y bipolares.

Mediante el analisis inmunocitoquimico se encontro que los cultivos retuvieron la expresion para S-10020,23 y GFAP, que es un marcador especifico para celulas astrociticas (20-22). La inmuno-reactividad encontrada con estos dos marcadores gliales en los cultivos en los diferentes pasajes, permitio establecer que la expresion fue progresiva y que el fenotipo se mantuvo a traves de los pases analizados, los datos concuerdan con la expresion que se evidencio mediante el analisis por inmunohistoquimica.

Y a su vez se evaluo la expresion de p53 y Bcl-2, como moduladores de apoptosis, pues se cree que defectos en la via que regulan la susceptibilidad a la apoptosis estan comprometidos en el desarrollo y progresion en la malignidad de los gliomas. Rieger et al. (6) encontraron 70% de incidencia de reacciones positivas para Bcl-2. Stirket et al. (12) revelaron un alto porcentaje de reaccion positiva para Bcl-2 en glioblastoma tanto recurrentes como iniciales (92% y 97%, respectivamente) y Krajewski et al. (10) comunicaron 92% de expresion para Bcl-2. Estos datos concuerdan con los resultados obtenidos en los cultivos analizados para la expresion de Bcl-2 mediante inmunocitoquimica, en los cuales se vio un alto porcentaje de celulas positivas en tres de los cuatro pases analizados.

En contraste, para p53 no se hallo expresion en los primeros pases de cultivo. Se ha encontrado que la mutacion o inactivacion de p53 ocurre en etapas tempranas en los gliomas y se asocia con la progresion del tumor. Muchos tumores, incluso glioblastomas multiformes de alto-grado, llevan un gen de p53 funcionalmente intacto (24). En el sexto pase hubo alta expresion de p53, esto es explicable porque un alto porcentaje de inmunopositividad a traves de los diversos pases sugiere que este tipo de cultivo exhibe una alta tasa de mutaciones para p53. A su vez, p53 se encontro a nivel citoplasmatico; este fenomeno se propuso como un mecanismo por el cual la funcion de p53 es abolida. Es posible que un aumento en la frecuencia nuclear de la sobreexpresion de p53 silvestre (25) sea un signo de anormalidades de otros componentes de la via para p53, pues con frecuencia se sobre-expresa p53 en astrocitomas humanos de todos los grados, mientras que en mucho otros tipos de canceres se encuentran en la mitad de los casos en estado normales. Esto sugiere un mecanismo para subvertir la apoptosis mediada por p53 (15).

La perdida de inmuno-reactividad en los distintos pases de cultivo ocurre normalmente en cultivos primarios, se ha descrito que las celulas que mantienen las caracteristicas tumorales por mas tiempo son las que expresan una mayor inmuno-reactividad. De forma semejante ocurre con los marcadores de la cinetica tumoral, como la bromodeoxiuridina, cuyo resultado decrece con el tiempo en las celulas en cultivo, e indica algun mecanismo no identificado de diferenciacion in vitro, particularmente para los astrocitomas de alto grado de malignidad. Una vez que se establece una linea celular, por lo general en el pase 20 o despues de 4-6 meses in vitro, las celulas en los pases van adquiriendo un fenotipo estable (18-22).

Todas las lineas de gliomas estudiadas hasta ahora son altamente aneuploides; ademas, el dano y los re-arreglos cromosomico son comunes (21,26). En estudios citogeneticos llevados a cabo en glioblastomas primarios y secundarios se ha encontrado una alta frecuencia de anormalidades combinadas en los cromosomas sexuales y autonomicos, estas incluyen trisomia del cromosoma 7, monosomia del cromosoma 10, monosomia del cromosoma X y la perdida del cromosoma Y (27,28). La linea celular establecida presento una alta tasa de aneuploidias, siendo la mas frecuente la monosomia del cromosoma Y (45, X-Y) lo que corrobora otros estudios en gliomas malignos (26,27), ademas tuvo un gran numero de poliplodias (55-102 <4n>, XXYY) y endoreduplicaciones (end 45, X-Y), indicativos propios de la progresion tumoral.

Este estudio confirma la utilidad de los cultivos primarios y las lineas celulares derivadas a partir de tumores cerebrales, pues por medio de ello se pueden establecer diferentes estrategias experimentales y terapeuticas para el estudio de tratamientos de quimioterapia, radioterapia y terapia genica.

AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan sus agradecimientos a la Clinica El Bosque, a la Division de Investigaciones de la Universidad El Bosque y a Diana Patricia Martinez del Instituto de Genetica de la Universidad Nacional de Colombia.

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Veronica Rincon, B.Sc., M.Sc. (1), Carmen Lucia Roa, M.D. (2), Gloria Osorio, Biol., Ph.D. (3), Gerardo Aristizabal, M.D. (4), Jaime E. Castellanos, O.D., M.Sc., Ph.D. (5)

(1.) Instructora Asociada, Instituto de Virologia, Universidad El Bosque, Bogota, Colombia. e-mail: veroka_27@yahoo.es

(2.) Profesora Asistente, Facultad de Medicina, Universidad El Bosque, Bogota, Colombia. e-mail: clroa@hotmail.com

(3.) Profesora Asociada, Instituto de Genetica Humana, Universidad Javeriana, Bogota, Colombia. e-mail: gosorio@javeriana.edu.co

(4.) Profesor Titular, Facultad de Medicina, Universidad El Bosque, Bogota, Colombia. e-mail: garisti@unbosque.edu.co

(5.) Profesor Asistente, Instituto de Virologia, Universidad El Bosque. Facultad de Odontologia, Universidad Nacional de Colombia, Bogota, Colombia. e-mail:castellanosjaime@unbosque.edu.co

Recibido para publicacion diciembre 7, 2005 Aceptado para publicacion enero 4, 2007
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Author:Rincon, Veronica; Roa, Carmen Lucia; Osorio Biol, Gloria; Aristizabal, Gerardo; Castellanos, Jaime E
Publication:Colombia Medica
Date:Jan 1, 2007
Words:5856
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