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Establecimiento de las condiciones para el trasplante de celulas de medula osea en un modelo de enfermedad de Huntington y su efecto funcional a traves de la conducta motora.

Establishment of the conditions for the bone marrow cells transplants in a model of Huntington's disease and functional effect on the motor behavior

Introduccion

La enfermedad de Huntington (EH) es una enfermedad hereditaria que se caracteriza por una atrofia y perdida celular progresiva predominantemente en el estriado y la neocorteza (Huntington, 1872; Leegwater-Kim, 2004). El tratamiento de la EH ha abarcado desde el tratamiento etiologico hasta el tratamiento de los sintomas clinicos, tratamientos sustitutivos, preventivo-protectores y restauradores, en esta ultima direccion por mas de dos decadas se han desarrollado terapias basadas en la utilizacion de celulas, la que se ha sustentado de forma importante en la disponibilidad de modelos para su investigacion. En la actualidad los mas utilizados son los modelos inducidos por toxinas, que producen patrones de perdida celular en el cerebro de los animales de experimentacion, los cuales permiten simular o reproducir las alteraciones tipicas de la enfermedad, tales como las alteraciones conductuales, bioquimicas y patologicas que se observan en la enfermedad en humanos, estos modelos se basan en el mecanismo de excitotoxicidad y en la alteracion del metabolismo energetico mitocondrial (Coyle, 1976; Mason, 1978; Samberg, 1984; Schwarcz, 1979; Schwarcz, 1983, Borlongan, 1997; Beal, 1993).

Los modelos de excitotoxicidad han sido utilizados con mayor frecuencia para reproducir en parte los cambios bioquimicos y neuropatologicos de la EH, y estan basados en la sobreexcitacion de las neuronas como resultado de la estimulacion propagada y continua de los receptores a aminoacidos excitadores, lo que produce serias alteraciones en la fisiologia de las neuronas, conduciendolas a la muerte celular (Olney, 1974; Olney, 1971. El acido quinolinico representante de este grupo afecta a las neuronas espinosas y respeta relativamente a las no espinosas.

(Albin,1990; Young,1988). El mecanismo de accion excitotoxico de esta toxina incluye la entrada masiva de calcio a la celula a traves del receptor NMDA, provocando la activacion de enzimas liticas y de la oxido nitrico sintasa (NOS). El dano mitocondrial consecuente es uno de los factores para el incremento en la generacion de especies reactivas de oxigeno que conducen a la muerte neuronal debida, al dano de las biomoleculas y a la activacion de programas apoptoticos. El deficit energetico contribuye a la perpetuacion del proceso degenerativo por favorecer la despolarizacion de la membrana y mantener el estado activo del receptor NMDA (Albin, 1990).

Otra clase de modelo experimental en el que se ha puesto gran atencion en las ultimas decadas es aquel que utiliza un gen mutante, pues permite la generacion de ratones transgenicos, los cuales son portadores de las diferentes formas encontradas para este gen (Mangiarini, 1996), reproduciendo alteraciones motoras y en el aprendizaje equivalentes a aquellas que han sido observadas en la EH (Carter, 1999; Lione, 1999).

En general, todos estos modelos han aportado un cumulo de evidencias de disfuncion y muerte celular que han favorecido el estudio de la causa de los sintomas de la enfermedad (Menalled, 2002).

El avance vertiginoso en los metodos de tratamiento restaurador ha contribuido a que en el presente se trate de encontrar fuentes celulares alternativas no neurales para el trasplante, ya que la fuente de tejido fetal humano, obtenida durante el embarazo y utilizada hasta el momento, requiere de estrictos controles de calidad, sin olvidar los problemas eticos que entranan su uso, lo cual ha sido motivo de interminables polemicas, rechazos y aspectos legales (Boer, 1994).

Fuentes celulares para el trasplante en la EH:

Recientemente se ha encontrado que la fuente alternativa de tejido para el trasplante neural en la EH, es la celula madre, la que por definicion es celula que puede autorrenovarse y diferenciarse de un linaje alternativo para generar una o todas las celulas y tejidos del cuerpo (Seaberg, 2003).

Ademas existe una poblacion de celulas que tienen restriccion de linaje, las cuales constituyen las celulas progenitoras con capacidad limitada para diferenciarse de un tipo celular especifico y que tambien pueden tener importancia para el trasplante clinico (Seaberg, 2003).

Durante varios anos se considero a la celula madre hematopoyetica como la unica celula de la medula osea con capacidad regenerativa, y se pensaba que solo era multipotencial. Sin embargo, estudios recientes han mostrado que la composicion de la medula osea es mas compleja, pues en ella se ha identificado un grupo heterogeneo de celulas madre adultas, positivas para las moleculas de superficie celular que se muestran en los tipos siguientes:

* Hematopoyeticas: CD45, CD34, CD11 y CD14

* Mesenquimales (estromales): CD29, CD44, CD71, CD90 y CD106

* Poblacion lateral: CD34 positiva, pero la mayoria es CD34 negativa, ABCG2

* Celulas progenitoras adultas multipotentes (MAPC): CD13, SSEA-1, SSEA-4

* Celulas ovales: CD34 positiva y Lin negativa

La presencia de uno u otro marcador celular tiene gran importancia si tenemos en cuenta que no todas las CMO son multipotentes, sino que las que portan determinados marcadores celulares son las que se pueden diferenciar de un fenotipo neural dado.

Teniendo en cuenta estas observaciones se deduce que existe un numero de fuentes potenciales de celulas progenitoras y madre, que pueden ser utilizadas en el trasplante, dentro de las cuales se encuentran: 1) celulas madre embrionicas derivadas de los blastocitos, 2) celulas progenitoras pluripotentes de embriones, fetos o neonatos, las que estan parcialmente preparadas para dar origen a un linaje neural, 3) celulas progenitoras de la zona subventricular adulta, 4) celulas germinales epidermicas aisladas de las gonadas de embriones que normalmente estan destinadas a convertirse en ovocitos y espermatozoides, 5) celulas madre no neuronales de sangre del cordon umbilical, colectada despues del nacimiento, y 6) otro rango de celulas madre no neuronales que pueden tener la capacidad de diferenciarse de celulas neurales cuando se encuentran en un ambiente con senales apropiadas.

Debido al potencial de crecimiento y diferenciacion que tienen estas celulas, demostrado en gran medida en el campo de la investigacion, surgen tres preguntas sobre este sistema de celulas proliferantes:

1. ?Pueden estas celulas convertirse en neuronas?

2. ?Pueden estas celulas diferenciarse de celulas semejantes a las estriatales y ser utiles para los estudios de trasplante neural?

3. ?Pueden estas celulas sobrevivir cuando son trasplantadas en los modelos que se han disenado de la EH y tener efecto sobre las funciones perdidas?

Mucho se ha discutido acerca de este tema en la literatura actual y para la mayoria de las fuentes celulares las preguntas 1 y 2 siguen siendo el foco central de los estudios, y sobre la pregunta 3 han aparecido ciertas investigaciones en las cuales se ha intentado dar una respuesta plausible a dicho interrogante (Lescaudron, 2003).

La posibilidad de que la poblacion de celulas madre, tales como las CMO, puedan ser potencialmente neurogenicas, ha generado importantes estudios que han abierto una oportunidad para el trasplante autologo, dada la existencia de un facil acceso de tejido para ser utilizado en el trasplante. Aunque existen reportes de CMO que tienen la capacidad de diferenciarse en neuronas (Brazelton, 2000), en la literatura se plantean diferentes hipotesis relacionadas con este aspecto, evidenciando que tales resultados han sido consecuencia de diversos eventos de fusion celular (Long, 2003).

Por otra parte, existen reportes en la literatura en los que se ha demostrado que las CMO son capaces de producir factores neurotroficos (FNT) como el BDNF (del inglesBrain Derive Neurotrophic Factor) y el factor de crecimiento nervioso NGF (del ingles NerveGrowth Factor) (Dormady, 2001). Estas celulas, debido a su potencialidad para producir factores troficos y generar diferentes tipos de celulas, podrian ser una fuente ideal para la neuroproteccion y restauracion celular en enfermedades neurodegenerativas tales como la EH.

Desarrollo futuro

En la actualidad no existe una terapia efectiva para reparar, reemplazar o proteger la neurodegeneracion que aparece en la EH; la estrategia de reemplazo celular y la neuroproteccion hasta hoy solo estan sustentadas sobre la base de estudios experimentales, en los cuales se busca reparar el dano ofreciendo proteccion celular generalizada sobre aspectos que no son especificos de una enfermedad neurodegenerativa en particular. Con la identificacion de genes se ha ampliado la hipotesis acerca de las causas del proceso patogenico en la EH (The Huntington's Disease collaborative Research Group, 1993), pero aun existen pocas evidencias que permiten concluir los mecanismos que subyacen a la mutacion genetica, los cuales provocan la degeneracion focal progresiva de las neuronas estriatales. Sin embargo,se han sugerido nuevas estrategias terapeuticas para normalizar los eventos transcripcionales, los cambios en el metabolismo celular y la respuesta al estres (TheHuntington'sD iseasecollaborativeResearchGroup, 1993), pudiera ser, que estos estudios experimentales identifiquen nuevos tratamientos que puedan ser efectivos en la investigacion clinica.Teniendo en cuenta el estado de la tematica abordada, se pudo establecer las condiciones para el trasplante de celulas de medula osea en un modelo de enfermedad de Huntington y evaluar su efecto funcional a traves de la conducta motora.

Materiales y metodos

Diseno experimental

El diseno experimental consto de tres fases:

La primera estuvo relacionada con la caracterizacion morfologica de la lesion en el modelo de AQ, la segunda estuvo encaminada a la obtencion, aislamiento y caracterizacion inmunocitoquimica de las CMO asi como a la determinacion de la concentracion optima de estas celulas para el trasplante en el modelo de AQ. En la tercera fase se realizo el trasplante de CMO y, previo a este y despues de este se hizo una evaluacion de la conducta del animal. Finalmente se realizo una evaluacion morfologica del trasplante.

Animales de experimentacion

Se utilizaron ratas machos adultas de la linea SpragueDawley (SD), con pesos entre 200-250 gr al comienzo del experimento, provenientes del Centro Nacional de Produccion de Animales de Laboratorio (CENPALAB), Cuba. Los animales fueron mantenidos en un ambiente de humedad (67 [+ or -] 3%) y a una temperatura media de 23 [grados]C (22 [+ or -] 2 [grados]C), con suministro de alimentos y agua ad libitum y periodos de luz y oscuridad de 12 horas. Las ratas fueron mantenidas en grupos de 5 por caja, al inicio del experimento, y una vez que los animales fueron trasplantados se mantuvieron 3 por caja.

Criterios de exclusion

Fueron excluidas del estudio aquellas rataspertenecientes a cualquiera de los grupos experimentales que mostraron en algun momento infecciones severas, lesiones en los ojos que les dificultaran la vision y atrofia marcada de alguna extremidad.

Modelo animal de EH por inyeccion intraestriatal de AQ

* Dosis de acido quinolinico de 1,4 [micron]L

Los animales fueron distribuidos en tres grupos experimentales:
No.    Grupos experimentales       N

 1     Ratas lesionadas con AQ    10
 2     Ratas falsas lesionadas     4
 3     Ratas sanas                 4


Con el fin de provocar la muerte neuronal de las celulas del cuerpo estriado (hemisferio derecho) las ratas fueron anestesiadas con hidrato de cloral 7% (420 mg/ Kg) y colocadas en un aparato de cirugia estereotactica para roedores (David Kopf Instruments). Se localizaron las siguientes coordenadas (mm) correspondientes al estriado derecho segun el Atlas de Paxinos y Watson (Paxinos, 1986) AP=+1.2 por delante de Bregma, L=+2,8 y DV=-5,5. Localizacion de la barra incisiva a 2 mm por debajo de la linea interaural.

Se inyectaron 1,4 [micron]l de una solucion de AQ a una concentracion de 112,5 nM, la cual se preparo de la siguiente manera:

1. Se pesaron en una balanza analitica 370 mg de AQ.

2. Se disolvio con 1 mL de NaOH 0,1 M + 1 mL de NaCL 0,9%.

3. Se adiciono 10 mL de NaCl 0,9%.

4. Se ajusto el pH a 7.4 anadiendo HCL 1 M.

5. Y,finalmente, fue completado a un volumen de 20 ml con NaCL 0,9%.

Una vez en el lugar, la neurotoxina se inyecto lentamente a una velocidad de flujo de 1mL/min, utilizando una jeringuilla Hamilton (10 [micron]L), la cual se mantuvo in situ 5 minutos despues de finalizada la inyeccion, para evitar el reflujo de la neurotoxina.

* Dosis de acido quinolinico de 1,2 [micron]L

El procedimiento quirurgico utilizado fue igual al descrito anteriormente, con la diferencia de que se inyectaron 1,2 [micron]L de la solucion de AQ.

El grupo de ratas falsas lesionadas fue obtenido de igual manera que el de ratas lesionadas con AQ, con la diferencia de que en vez de inyectar AQ, en su lugar se utilizo solucion salina fisiologica (SSF).

Evaluacion morfologica de la lesion

Transcurridos 30 dias de la lesion, todos los animales lesionados, 4 animales falsos lesionados y 4 animales sanos, fueron anestesiados con hidrato de cloral (420 mg/Kg, i.p) y sacrificados para la realizacion del estudio morfologico. La fijacion de las muestras se llevo a cabo por el metodo de perfusion aortica; se pasaron por cada rata 250 mL de solucion salina y luego 300 mL de solucion fijadora (paraformaldehido al 4% en buffer fosfato salino [PBS] al 0,1 mol/L, pH 7,3). Los cerebros fueron extraidos y posfijados en la misma solucion fijadora durante 3h. Posteriormente las muestras se deshidrataron en soluciones de sacarosa al 7, 15 y 30% durante 12 h en cada caso y seguidamente fueron congeladas y almacenadas a -70 [grados]C. Se realizaron cortes coronales a un grosor de 20 mm, en un criostato digital 1720 (Leitz, Alemania). Se recogieron 2 series de 20 cortes, cada una representativa de la lesion y del nucleo estriado, mediante un muestreo sistematico y al azar, en laminas gelatinizadas y se almacenaron a -20[grados]C, hasta su posterior uso. Para determinar la perdida neuronal estriatal fue coloreada una serie de secciones con cresil violeta al 0,5% y la otra serie se destino a la determinacion de la actividad astrocitica por el metodo inmunohistoquimico.

Inmunohistoquimica: Las muestras fueron descongeladas y lavadas (PBS 0.1M). Posteriormente se incubaron en una solucion de bloqueo durante 20 min (PB 0,1 M, suero fetal de ternera al 20% y triton al 0.25%). El anticuerpo primario policlonal anti-GFAP (proteina acida fibrilar glial, del ingles Glial Fibrilar AcidProtein) (1/1000, Dako), el anticuerpo secundario biotinilado anti-Ig de conejo (1/500, Dako), y el complejo ABC peroxidasa (1/100, DAKO), fueron diluidos con PBS que contenia suero fetal de ternera al 1%, y 0.125% de triton (X-100). Para el anticuerpo primario la incubacion se realizo durante toda la noche y para el anticuerpo secundario y el complejo ABC peroxidasa, durante una hora. Posterior a cada una de estas incubaciones se efectuaron 3 lavados en PBS de 5 mn cada uno. Para el revelado se utilizo 3,3 diaminobenzidina al 0.05% y [H.sub.2][O.sub.2] al 0.01%. Seguidamente las secciones fueron deshidratadas en concentraciones crecientes de alcohol, aclaradas en xilol y montadas con la solucion de montaje DPX. La observacion de las muestras se realizo en un microscopio de campo brillante.

CMO de rata para el trasplante en el modelo de lesion por AQ

Las celulas fueron obtenidas de femur de ratas machos SD, con peso entre 250 y 300 g. Todo el material utilizado en la manipulacion de las celulas se trabajo en condiciones esteriles. El proceso de obtencion aislamiento y marcaje de estas celulas se describe brevemente a continuacion, asi como la tecnica inmunicitoquimica empleada para la caracterizacion de las mismas:

* Obtencion de las CMO

Las CMO fueron aisladas a partir de femures de rata segun se describe en el trabajo de (Woodbry y Col, 2000). Ratas SD machos fueron anestesiadas por via intraperitoneal con hidrato de cloral al 7% (0,6 mg/ Kg de peso). Se les realizo un corte de la piel en las patas traseras, decolando el tejido paralelo al hueso. Seguidamente se realizo un corte alrededor de las epifisis distales del femur. Durante 30 minutos fue colocado el hueso extraido en una placa de Petri que contenia cloruro de sodio al 0,9%. En condiciones esteriles se cortaron las epifisis distales del hueso para dejar expuesta la medula osea y se le infundio PBS en una sola direccion utilizando una jeringuilla de 10 mL, la suspension obtenida, rica en CMO, fue recogida en tubos esteriles para su posterior lavado por centrifugacion.

* Aislamiento de las CMO

Para el aislamiento celular se siguieron las normas establecidas en el PNO 605.5.22 del laboratorio de Inmunologia, como brevemente se explica:

El tubo que contenia las CMO en suspension, fue lavado con PBS 3 veces (en una proporcion volumen a volumen), durante 10 minutos a 540 g (20 [grados]C). Despues de cada lavado se desecho el sobrenadante y se mezclaron nuevamente las celulas con PBS.

Se colocaron en un tubo de cristal 2,5 mL de ficoll-Paque[TM] Plus (Amershan AB Sweden), y seguidamente se depositaron 5 mL de la suspension de CMO de forma cuidadosa, dejandola caer por las paredes del tubo evitando que se uniera el ficoll con la mezcla de PBS-celulas.

Los tubos se centrifugaron durante 45 minutos a 2100 g, a una temperatura de 20 [grados]C. Finalizada la centrifugacion se extrajo la capa de celulas mononucleadas, succionando el anillo celular con una pipeta pasteur.

Las celulas fueron lavadas 3 veces con PBS durante 10 minutos a 1100 g, a una temperatura de 20 [grados]C. Finalizados los lavados por centrifugacion desechamos el sobrenadante en un recipiente con hipoclorito al 7% y el sedimento celular fue resuspendido en medio de cultivo (DMEM + Suero Fetal Bovino [SFB] al 10% + Glutamina 2 mM).

* Marcaje de las CMO

A la suspension de celulas obtenidas por el metodo anteriormente descrito y resuspendidas en el medio de crecimiento (DMEM + SFB al 10% + Glutamina 2 mM) se le anadio un volumen de solucion de bisbenzimida (Reactivo de Hoechst-33258), para obtener una concentracion final en el medio de 1mg/mL. Seguidamente las celulas fueron incubadas durante 12 h en atmosfera de 5% de C[O.sub.2] /aire saturada de humedad. Al cabo de este tiempo las celulas se centrifugaron a 250 g durante 5 minutos. El sobrenadante resultante de esta centrifugacion se elimino y el boton celular se lavo tres veces con 10 mL de medio de cultivo DMEM. Las celulas marcadas mostraron un nucleo fluorescente azul a 420 nm. El conteo del numero de celulas se realizo en camara de Neubauer, utilizando como colorante vital azul de tripan, y la concentracion final de la suspension se ajusto en dependencia del tipo de experimento a realizar, como sera descrito en lo sucesivo. La viabilidad celular estuvo por encima del 90%, en todos los casos.

* Caracterizacion inmunofenotipica de las CMO

Para la caracterizacion de las CMO se utilizo una tecnica inmunicitoquimica que siguio las normas establecidas en el PNO605.5.24del laboratorio de Inmunologia, como brevemente se explica:

Utilizamos un formato en el cual las laminas de 12 pocillos fueron recubiertas con las celulas mononucleares, a las cuales se les uniria el anticuerpo monoclonal especifico contra una de las proteinas en estudio CD34 (1/40, DAKO), CD38 (1/200, DAKO), CD45 (1/50, DAKO) y CD90 (1/20, DAKO). Despues del lavado, la cantidad de anticuerpo monoclonal unido especificamente se detecto usando un anticuerpo anti-IgG de raton conjugado (1/700, DAKO) con biotina, que actuo como anticuerpo secundario. El complejo ABC/Fosfatasa Alcalina (1/100, DAKO) se diluyo en PBS que contenia suero fetal de ternera al 1% y 0,125 de triton X-100. Para el anticuerpo primario la incubacion fue durante toda la noche a 4 [grados]C y para el anticuerpo secundario y el complejo ABC se corrieron los tiempos de incubacion de 50 y 45 minutos, a temperatura ambiente respectivamente. Para el revelado se utilizo el 4-cloro 2-metilbencenodiazonio (fas red) 1 mg y naftol 1 mL. Este procedimiento permitio la entrada de la avidina, amplificando la respuesta del sistema cuando se le anadio el sustrato cromogenico. La lectura se realizo en un microscopio de luz.

Establecimiento de la concentracion celular

Este experimento estuvo dirigido a evaluar cual de las concentraciones de CMO trasplantadas (tabla 3), lograba una mejor sobrevivencia e integracion en el tejido hospedero.

* Grupos experimentales

Se crearon tres grupos experimentales que fueron lesionados en el estriado con AQ (1,2 mL) y trasplantados con tres concentraciones diferentes de la suspension celular segun el grupo experimental, ver tabla siguiente:

* Procedimiento experimental

1. Se trasplantaron por cirugia esteriotactica las CMO marcadas con bisbenzimida, en el estriado derecho de ratas lesionadas con AQ (1,2 mL).

2. La coordenada de trasplante utilizada fue: AP= +1.2 mm, L=+2.8 mm, [V.sub.1]= -5.5 mm, [V.sub.2]= -4.6 mm.

3. Se colocaron 2 [micron]l como volumen final de las suspensiones celulares. La concentracion final por deposito para cada caso se indica en la tabla No. 3 segun el grupo experimental.
    Grupo       n     Concentracion    Numero de
experimental             celular        deposito
                      por depositos
                     (cel/[micron]L)

Grupo I         8        150 000           2
Grupo II        3        100 000           2
Grupo III       7        50 000            2

    Grupo       Volumen por     Numero total
experimental      deposito       de celulas
                 ([micron]L)    trasplantadas

Grupo I              1            300 000
Grupo II             1            200 000
Grupo III            1            100 000

Cantidad de celulas utilizadas (cel/[micron]l), en la estandarizacion
de la concentracion de CMO. Se usaron 2 depositos con un volumen en
cada uno de ellos de 1 [micron]L.


* Parametros para seleccionar la concentracion de CMO a trasplantar

1. Sobrevivencia de las celulas trasplantadas.

2. Migracion de las celulas: Se evaluo la extension antero-posterior del trasplante, asi como la localizacion anatomica del mismo.

* Estudio morfologico

Se realizo la evaluacion morfologica cualitativa del trasplante, 30 dias despues del mismo. El sacrificio de los animales, la extraccion del cerebro, el procesamiento, la conservacion y el corte fueron realizados como se describe anteriormente. Para el analisis de las celulas mononucleares de la medula osea, los cortes histologicos fueron observados al Microscopio Optico/fluorescencia a una longitud de onda de 330-380 nm (filtro ultravioleta).

Evaluacion funcional del trasplante de CMO

Se trabajo con la concentracion celular ajustada (50 000 cel/ml, en 2 depositos diferentes, o sea 100 000 celulas totales), en el estriado lesionado con AQ (1,2 [micron]l).

En todos los grupos experimentales se realizo la prueba una semana despues de la inyeccion con AQ y 2 meses despues del trasplante de CMO.

* Grupos experimentales: Se utilizaron animales SD machos adultos con peso corporal entre 200 a 250 g.

El DMEM es un medio artificial formulado para el mantenimiento in vitro de celulas de mamiferos.
Grupo           Designacion del grupo experimental           N

  I      Ratas sanas                                        10
  II     Ratas con lesion de AQ solamente                   10
 III     Ratas con lesion de AQ y trasplantadas con CMO     10
  IV     Ratas con lesion de AQ y trasplantadas con DMEM    10

Muestra los grupos experimentales utilizados para evaluar la conducta
motora en los animales de experimentacion. DMEM: (del ingles,
Dulbecco'sModifiedEagle's Medium).


* Pruebas conductuales:

Prueba conductual 1. Conducta de Giro inducida por D-anfetamina (Ungerstedt, 1970).

Este experimento estuvo dirigido a avaluar la conducta motora del animal a traves de la Conducta de Giro inducida por D-anfetamina.

Se inyecto a cada sujeto experimental 5 mg/Kg de peso de D-anfetamina intraperitoneal (i.p.), una semana despues de la inyeccion con AQ fue analizada en todas las ratas la Conducta de Giro inducida por esta droga, tomando el numero de vueltas completas (360[grados]) que dieron los animales cinco minutos despues de la inyeccion con D-anfetamina, las cuales se registraron en un rotometro electronico que cuantifica automaticamente los giros que realiza el animal hacia la derecha y/o izquierda (multicontador LE 3806 acoplado a sensores LE 902 panlab, Espana).

Prueba conductual2.Habilidades motoras de las extremidades anteriores (Montoya,, 1991).

Este experimento estuvo dirigido a evaluar la conducta motora del sujeto experimental a traves de la habilidad que muestra el animal al utilizar sus extremidades anteriores para capturar el alimento en una caja de restriccion.

Caja experimental:

En la evaluacion de las habilidades motoras en los animales de experimentacion, se emplearon cajas de acrilico transparentes (3 mm de espesor) de 28 cm de largo, 6,6 cm de ancho y 6,8 cm de altura (taller de prototipo, CIREN). Aproximadamente los dos tercios anteriores de la extension de la caja estaban ocupados por una plataforma central de 4.7 cm de alto y 2,9 cm de ancho, con espacios en ambos lados para insertar una escalerilla movil de seis escalones en cada uno de los extremos. Cada escalon y nivel inferior (piso de la caja) tenian una pequena concavidad donde se situaron dos trozos de alimento (pellets) con sabor diferente al que normalmente ingieren, por lo cual los animales disponian de catorce pellets a cada lado. La plataforma central impedia que cada animal alcanzara el alimento de un lado con la extremidad contraria. La base del extremo posterior de la caja fue eliminada para posibilitar el acceso de la rata al compartimiento interior.

Seis dias antes de la realizacion de la prueba las ratas fueron sometidas a un regimen restringido de alimentacion (10-12 g de alimento diario por animal). Tres dias despues de comenzado este, los animales se colocaron dentro de las cajas experimentales una vez por dia durante 15 minutos, con el proposito de que se familiarizaran con la prueba y las condiciones experimentales.

Una vez comenzadas las sesiones experimentales las ratas se introdujeron en las cajas de prueba, una vez al dia durante 15 minutos por 6 dias consecutivos. Al final de cada sesion se retiraron las escaleras de las cajas experimentales y se contabilizaron los trozos de alimentos que no fueron comidos, de cada lado (derecho e izquierdo), de manera independiente.

Procesamiento estadistico

Fue analizada la distribucion y la homogeneidad de varianza de la variable Conducta de Giro inducida por D-anfetamina,numero de trozos de alimentos, mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov y la prueba de Levene, respectivamente. Una vez comprobada la no distribucion normal de la muestra los datos fueron analizados con pruebas no parametricas.

Con el proposito de conocer de manera general el comportamiento de los grupos, en las diferentes pruebas conductuales desarrolladas se realizo una estadistica descriptiva y se proceso toda la informacion recogida mediante el software profesional Statistica para Windows. Version 6.0, Copyright Statsoft, Inc. 1993.

Para conocer la efectividad del trasplante se llevo a cabo la comparacion de los resultados de la Conducta de Giro inducida por D-anfetamina, de la "Prueba de Habilidades Manuales de las extremidades anteriores" antes y despues del trasplante mediante la aplicacion de la prueba de Wilconxon para muestras pareadas. Para el estudio comparativo de la Conducta de Giro inducida por D-anfetamina, entre los grupos experimentales, se realizo una prueba de Kruskal-Wallis seguida de una prueba U de Mann-Whitney. La comparacion de los resultados de la "Prueba de Habilidades Manuales de las extremidades anteriores" se hizo siguiendo el mismo esquema descrito para la Conducta de Giro inducida por D-anfetamina.

Resultados

Modelo animal de EH por inyeccion intraestriatal de AQ y evaluacion morfologica de la lesion

* Dosis de acido quinolinico de 1,4 [micron]L

La inyeccion con AQ en el estriado derecho provoco la perdida parcial de neuronas estriatales y abundante gliosis (hipertrofia e hiperplasia de microglias y astrocitos) que se acompano de una dilatacion del ventriculo lateral, caracteristica que se diferencia de lo observado en el estriado contralateral sano (figura 1A). La coloracion de cresil violeta empleada tine los cuerpos de Nissl presentes en el soma y las dendritas neuronales, asi como el nucleo de las celulas gliales (figura 1 B, C). La deteccion inmunohistoquimica de la GFAP demostro la gliosisastrocitica. La observacion en campo claro y microscopia de fluorescencia muestra en algunos casos la perdida de la imagen en parches caracteristica del estriado (figura 1 D, E).

Forma y extension de la lesion: La forma del area lesionada es ovoidal y en ocasiones algo irregular. El volumen de la lesion no abarca la totalidad del estriado, pero ocupa la mayoria del mismo. El nucleo estriado se extiende desde la coordenada +2,2 hasta -3,8 con respecto a bregma en sentido anteroposterior, lo que abarca una extension en este eje de 6 mm aproximadamente. Para la dosis de 1,4 [micron]L de AQ la lesion se extendio 3,6 mm en sentido anteroposterior y no solo se ubico en los nucleos caudado putamen, sino que se extendio a areas adyacentes tanto de tipo GABAergico, como no GABAbaergico. Las areas extraestriatales mayormente afectadas fueron: corteza frontal parietal motora, claustrum, nucleo endopiriforme, globos palido, palido ventral y areas talamicas.

* Dosis de acido quinolinico de 1,2 [micron]L

La reduccion de la dosis de AQ empleada a 1,2 [micron]L se realizo con el objetivo de reducir el dano extraestriatal. Las caracteristicas de la lesion para la dosis de 1,2 [micron]L de AQ se corresponden en general con las descritas en la primera etapa para 1,4 [micron]L de AQ, diferenciandose en la extension de la lesion. En este caso la extension anteroposterior promedio de la lesion fue de 3,0 mm y se observo menor afectacion de las areas extraestriatales, danandose en algunos casos claustrum, nucleo endopiriforme, globos palido, no asi palido ventral y las areas talamicas.

[FIGURA 1 OMITIR]

Finalmente se selecciono la dosis de 1,2 [micron]L de AQ para lesionar el estriado, teniendo en cuenta la afectacion de las areas extraestriatales. Se comprobo que con este volumen de AQ se induce una lesion en el nucleo estriado, similar a la producida con el volumen de 1,4 [micron]L de AQ, pero a diferencia de lo que ocurre con este volumen, encontramos que con la dosis mas baja existe una menor afectacion de los tejidos vecinos.

CMO de rata para el trasplante en el modelo de lesion por AQ

Obtencion, aislamiento, marcaje y caracterizacion inmunofenotipica de las CMO

Las CMO fueron obtenidas, aisladas y marcadas como se describio previamente, ademas se realizo la caracterizacion de estas celulas desde el punto de vista inmunofenotipico, lo que permitio conocer la composicion de la suspension celular que seria utilizada para el trasplante. En la Figura No. 2 se muestra el estudio inmunocitoquimico, el cual permitio detectar, de manera especifica en las CMO, las proteinas de superficie celular. Durante su caracterizacion estas celulas fueron positivas para los marcadores (CD34+; CD38+; CD45+ y CD90+). Para cada caso se utilizo el correspondiente control negativo (figura 2 a, b, c, d y e).

[FIGURA 2 OMITIR]

La figura 3 muestra la media del porciento de celulas positivas para cada uno de los antigenos de superficie celular, indicando la contribucion que aporta cada marcador al porciento general dentro de la caracterizacion realizada: CD34 = 19,33%, CD38= 20,80%, CD45 = 17,27%, y CD90 = 23,52%. Estos resultados muestran la heterogeneidad de los marcadores estudiados.

Establecimiento de la concentracion celular

Para el establecimiento de la concentracion celular de las CMO que debian ser trasplantadas se realizaron tres grupos experimentales, cada uno a diferentes concentraciones como se describio en materiales y metodos. Los animales fueron lesionados en el estriado con AQ (1.2 [micron]l) y trasplantados con CMO, marcadas con bisbenzimida,a la concentracion indicada segun el grupo experimental.

[FIGURA 3 OMITIR]

* Estudio morfologico

Se constato en cada animal la lesion estriatal por AQ. La observacion al microscopio optico de fluorescencia demostro sobrevivencia de las celulas trasplantadas, las cuales mostraron un nucleo azul fluorescente. En general, las celulas trasplantadas se dispusieron linealmente en torno al area del trazo de la aguja de inyeccion, y se observo la union en sentido vertical de los dos depositos de inyeccion. No fue caracteristica la disposicion de las celulas trasplantadas en halo que supusiera la muerte de las celulas centrales. Se observo, ademas,una distribucion de las celulas marcadas en el tejido estriatal circundante.

Para las concentraciones de 200 000 y 300 000 celulas totales se aprecio una abundante respuesta inflamatoria, por la presencia de celulas macrofagicas del sistema inmune que mostraban autofluorescencia de color amarillo-verdoso.

Grupo I (300 000 celulas totales): Se observaron un total de 8 cerebros, en cinco de ellos pudo verse supervivencia de las celulas trasplantadas, en los tres cerebros restantes no se observaron celulas marcadas de color azul. Sin embargo, la supervivencia para esta concentracion puede evaluarse, desde el punto de vista cualitativo, como muy pobre, ademas existio muy poca definicion de celula a celula, las cuales en ocasiones formaban agregados celulares o "motas". Asociadas al area del trasplante se hallaron abundantes celulas macrofagicas de la respuesta inmune. Figura 4A.

Grupo II (200 000 celulas totales):Se analizaron un total de 3 cerebros. En todos los casos se observo una baja sobrevivencia de las celulas trasplantadas, acompanadas por celulas macrofagicas dispuestas como un cordon a lo largo del area de trasplante. Figura 4B.

Grupo III (100 000 celulas totales)

En los 7 cerebros analizados se pudo apreciar una alta supervivencia de las celulas trasplantadas. En el area del trasplante, definida en torno al trazo de inyeccion, se pudieron apreciar claramente los dos depositos celulares. Ademas se pudo comprobar que para esta concentracion se favorecio la migracion de las celulas hacia el tejido hospedero estriatal circundante. Hubo muy buena definicion celular, sin que se formaran agregados o "paquetes" de celulas y fue muy baja la respuesta inflamatoria asociada al area de trasplante. Se observaron claramente los dos depositos de inyeccion. Para esta concentracion se pudo evaluar la supervivencia, desde el punto de vista cualitativo, como muy buena. Figura 4C

En la figura 4 se muestra una fotografia de las concentraciones celulares utilizadas para el trasplante del estriado lesionado con AQ.

[FIGURA 4 OMITIR]

Evaluacion funcional del trasplante de CMO a traves de la conducta motora

Prueba conductual 1 pre y postrasplante de CMO:

Conducta de Giro inducida por D-anfetamina

La Conducta de Giro inducida por D-anfetamina (5 mg/Kg intraperitoneal) se evaluo una semana despues de la inyeccion intracerebral de AQ en todos los grupos experimentales, incluidos el grupo de controles sanos y un mes despues de realizado el trasplante de CMO. La grafica representada en la figura No. 5 muestra la conducta rotatoria antes y despues del trasplante de CMO, donde se puede constatar que un mes despues del trasplante de CMO (n= 10), las ratas trasplantadas mostraron una disminucion significativa (p< 0.005, prueba de Wilconxon para muestras pareadas) en la Conducta de Giro inducida por D-anfetamina. Un hallazgo interesante para el grupo de lesion con AQ solamente, fue la disminucion estadisticamente significativa (p< 0,0093), encontrada un mes despues de la lesion con AQ (sin tratamiento con CMO) cuando se comparo con la prueba inicial que se realizo una semana despues de la lesion con AQ.

De manera general la Conducta de Giro con D-anfetamina en el estudio pre-trasplante se manifesto de acuerdo con lo esperado, donde los grupos lesionados con AQ se diferenciaron del control sano; de igual manera, en la comparacion entre los grupos pos-trasplante se observaron diferencias significativas (p<0,005) en la Conducta de Giro entre el grupo de animales trasplantados con CMO, los lesionados con AQ y los que recibieron un falso trasplante, mostrando el grupo de trasplante un comportamiento similar al control sano.

Prueba conductual 2 pre y pos-trasplante de CMO:

Prueba de las habilidades motoras de las extremidades anteriores

A la tercera semana despues de la lesion con AQ y a la sexta semana despues del trasplante de CMO y/o DMEN fueron evaluadas las habilidades motoras de las extremidades anteriores, mediante la aplicacion de la "Prueba de Habilidad Manual". Los resultados obtenidos tanto para la extremidad derecha como izquierda pre y pos- trasplante se muestran en las figuras No. 6 y No. 7 donde se puede evidenciar que los grupos lesionados con AQ (grupo LAQ solamente; LAQ + TpCMO; LAQ + DMEN) dejaron un mayor numero de pellet que los animales del grupo sano (p< 0,0007). Ademas se demostro para ambas extremidades, una disminucion estadisticamente significativa (p<0,0007) en el numero de pellet dejados por el grupo LAQ + TpCMO para ambas extremidades despues del trasplante con CMO.

Discusion

Modelo animal de EH por inyeccion intraestriatal de AQ.

La infusion intracerebral de AQ produce cambios morfologicos y bioquimicos en los animales de experimentacion que semejan lo observado en los cerebros de pacientes con enfermedad de Huntington, es por ello que en la busqueda de modelos para el estudio de esta enfermedad se ha planteado la hipotesis de que esta excitotoxina interviene en su patogenia. La lesion tisular producida por el AQ constituye el mejor modelo de excitotoxicidad que se conoce hasta ahora, lo que ha sido atribuido al tipo de dano neuronal que produce, donde hay una lesion selectiva de neuronas de talla media, con una perdida significativa de GABA y de sustancia P, unido a una perdida relativa de las concentraciones de somatostatina y neuropeptido (Beal, 1986).

En este trabajo se utilizaron dos dosis diferentes de AQ para lesionar el estriado (1,4 [micron]L y 1,2 [micron]L). Con ambas dosis se obtuvieron perdidas neuronales que abarcaron, aunque no en su totalidad, una gran parte de esta estructura. Esto permitio reproducir el modelo de AQ, que ya habia sido establecido hace varias decadas (Schwarcz, 1983). Se demostro que la lesion estriatal con AQ induce una marcada muerte neuronal en el estriado, acompanada por una gliosis de grado variable en dependencia de la dosis de AQ utilizada, que pudo ser evidenciada por la alta reactividad en la expresion de GFAP (fig. 1 D y E). En los animales lesionados con AQ, esta marcada gliosis aparece no solo en el estriado, sino tambien en otras areas. Ademas, con las dosis utilizadas, las estructuras danadas fuera del estriado,reportadas en este trabajo, fueron muy similares a las que se reportan en la literatura, relacionadas a la amigdala, septum, hipotalamo, globo palido, entre otras (Beal, 1986). Este hecho tambien ha sido obtenido por otros autores (Francis,(verificar, en la bibliografia aparece T y no L) 2000), quienes describen, ademas, hipertrofia e hiperplasia de las microglias y los astrocitos, unido a la perdida neuronal (Beal, 1991).

Las dos dosis se trabajaron a una concentracion de 112,5 nM, lo que se encuentra en el rango reportado en la literatura (Perez-De La Cruz, 2009, Curry, 2004, Hanbury, 2003). Para la ultima etapa del presente estudio, fue seleccionada la dosis de 1,2 [micron]L. Se escogio esta ultima dosis teniendo en cuenta la afectacion de las areas extraestriatales, ya que se comprobo que con este volumen de AQ se induce una lesion en el nucleo estriado, similar en amplitud a la observada con el volumen de 1,4 [micron]L, pero con una menor afectacion de los tejidos vecinos. Una explicacion plausible a la decision de no reducir mas el volumen de AQ, estuvo basada en que una disminucion mayor de la cantidad de esta neurotoxina, implicaria una mayor reduccion del area estriatal lesionada; es decir, que la perdida celular no podria ser evidenciada a traves de cambios morfologicos manifiestos, lo que entorpeceria la obtencion adecuada de nuestro modelo. La perdida neuronal y la gliosis astrocitica, reportada en el estudio, concuerdan con lo obtenido por otros autores, evidenciandose que inmediatamente que las neuronas mueren, aparecen mecanismos por medio de los cuales se trata de reparar el dano. Por tanto, se puede deducir que la dosis de 1,2 mL de AQ es apropiada para la lesion del nucleo estriado, independientemente de que no queda lesionado en su totalidad y que se mantienen algunas afectaciones extraestriatales. Esta dosis brinda el sustrato morfologico adecuado para la obtencion del modelo, que pudo ser evidenciado a traves de los estudios conductuales.

Empleo de las CMO de rata para el trasplante

Las CMO son una fuente importante de celulas que pueden ser utilizadas con un alto grado de confiabilidad para el trasplante celular en aquellas enfermedades donde se ha demostrado que pueden jugar un papel fundamental en la generacion del tejido danado. Estas celulas constituyen una fuente alternativa para ser empleadas en el trasplante de pacientes con enfermedades neurologicas. En nuestro estudio las CMO fueron obtenidas, aisladas y marcadas con bisbenzimida, sin presentar ningun riesgo, y utilizando metodos sencillos, lo cual indica que existe una forma de acceder a ellas relativamente facil y libre de censuras eticas. Para comenzar, se partio de una muestra obtenida directamente del femur de las patas traseras de la rata, la cual contenia una mezcla de celulas, que posterior al aislamiento fueron separadas y permitio circunscribirnos a las celulas mononucleares, hecho que demuestra la heterogeneidad de la composicion de la suspension celular, pues ya se conoce que en ella existen celulas de diferentes linajes. El aislamiento de las CMO fue realizado utilizando un gradiente de Ficoll-Hypaque (Colter, 2001), que permitio la obtencion de las celulas deseadas con un alto rendimiento y buena viabilidad. De manera general se puede asegurar que en el estudio realizado se monitoreo este proceso bajo condiciones estrictas de esterilidad, lo que garantizo una muestra pura para obtener resultados mas confiables.

[FIGURA 5 OMITIR]

Existen marcadores de superficie que indican el tipo de celula especifica que forma parte de la poblacion de las CMO. Habitualmente se ha empleado marcadores de superficie celular para la identificacion de estas celulas en etapas tempranas, pero estudios mas amplios han mostrado que el inmunofenotipo de ellas es mucho mas complejo. Estas celulas pueden expresar un espectro de marcadores mas extenso que esta sujeto al estado de diferenciacion celular, donde los antigenos de superficie aparecen y desaparecen en un periodo determinado del desarrollo evolutivo (Prosper, 2003; Weissman, 2001 (verificar orden cronologico)). Los resultados expresaron los porcientos de celulas positivas para los marcadores CD34, CD38, CD45 y CD90 (figura 3), demostrandose que los mismos se encuentran en el rango de lo reportado por otros autores. El hecho de que no todas ellas hayan sido portadoras del mismo marcador, indica la existencia de lineas celulares diferentes, que estan formando parte de la muestra en estudio. En este caso, la heterogeneidad celular explicaria el hallazgo encontrado , que no difiere con lo reportado por otros autores.

Durante varios anos se considero que la celula madre hematopoyetica era la unica CMO, con capacidad regenerativa, sin embargo hoy se sabe que la composicion de la medula osea es mas compleja, ya que se ha identificado un grupo heterogeneo de celulas madre adultas que incluyen ademas de las hematopoyeticas y mesenquimales, la denominada poblacion lateral (Jiang, 2002) y las celulas progenitoras adultas multipotentes (Zanjani, 1999). El estudio realizado apoya el concepto actual de la diversidad de las poblaciones de celulas madre adultas existentes en la medula osea, pues la identificacion de los antigenos CD34, CD38, CD45 y CD90 fue posible en todos los casos, y los mismos representan subclases de poblaciones existentes, en diferentes estadios de diferenciacion. Este resultado no fue obtenido de lineas celulares separadas, sino que se calculo sobre la base de una suspension celular en la cual habia una mezcla de todas estas poblaciones celulares. Lo que puede indicar que al porciento general de cada marcador este contribuyendo al aporte individual suministrado por cada una de las subpoblaciones celulares que porte el marcador correspondiente. Ademas, la posibilidad de que no todas las celulas hayan sido positivas para un marcador, pudiera significar que hay celulas en diferentes estadios de diferenciacion, o que este grupo de celulas corresponda a una subpoblacion celular diferente, como las celulas progenitoras multipotenciales adultas, que pertenecen tambien a la poblacion de celulas que forman parte de la medula osea, y que no fueron identificadas en este estudio, ya que no se utilizaron marcadores especificos para ellas. Ademas de estos aspectos se puede pensar en que el porciento de positividad a un marcador dado este representando la union de mas de un tipo celular, pues se conoce que varias de estas celulas son portadoras de un mismo marcador de superficie que las identifica.

[FIGURA 6 OMITIR]

[FIGURA 7 OMITIR]

En general, muchas son las moleculas que pueden ser utilizadas para la caracterizacion de las diferentes poblaciones celulares que forman parte de los elementos formes de la medula osea. En la subpoblacion de celulas hematopoyeticas el marcador CD34, asi como el CD38 y el CD45, son considerados dentro del inmunofenotipo caracteristico de esta poblacion, ya que constituyen marcadores de linaje celular (Verfaillie,2002;Langman,1997). Por otra parte, dentro de la subpoblacion de celulas mesenquimales que forman parte del repertorio de las CMO, se ha identificado otro antigeno de superficie valido para su caracterizacion, el CD90 (Prosper, 2003;Haynesworth, 1992). Este antigeno fue detectado de manera satisfactoria en las celulas del presente estudio, aportando tambien como el resto de los antigenos un porciento en la identificacion de las mismas. Formando parte de la poblacion lateral se ha detectado subpoblaciones CD34 + y CD34 - (Garrido, 2003), y de las celulas ovales el CD34+, entre otros (Theise, 2000). Un aspecto que se debe destacar y que conforma el elemento basico del presente estudio, es que los porcientos hallados de celulas positivas para los marcadores de superficie celular se encuentran dentro de los valores que han sido descritos en la literatura (Haynesworth, 1992; Weissman, 2001). De manera general las celulas madre tienen una frecuencia media en la medula osea muy baja, por lo que esto explica los bajos porcientos de expresion determinados en este estudio para los diferentes marcadores analizados.

Establecimiento de la concentracion celular para el trasplante

Desde hace varias decadas el trasplante de celulas ha constituido una via alternativa de tratamiento para las enfermedades degenerativas en el SN, donde se conoce que el principal problema de la perdida de las celulas que componen dicho sistema radica en que son celulas muy diferenciadas que pierden su capacidad para proliferar, de ahi que a pesar de su plasticidad este hecho provoque deficiencias funcionales irreversibles. Asi, en la EH el cambio patologico que probablemente desempena el papel principal en la sintomatologia de la enfermedad es la muerte de las celulas gabaergicas de talla media del estriado (Ferrante,, 1985). Esta perdida ocasiona diferentes alteraciones morfofuncionales, que al parecer son las responsables de los trastornos observados en estos pacientes. Uno de los campos de la medicina que mas expectativas ha levantado en los ultimos anos es la terapia celular con celulas madre para sustituir a las celulas danadas, constituyendo una via potencial para el tratamiento de la EH. El aislamiento de celulas embrionarias humanas, la aparente e inesperada potencialidad de las celulas madre adultas y el desarrollo de la terapia genica nos lleva hacia posibles tratamientos de enfermedades incurables como la EH. Las aplicaciones de las celulas madre se basan, fundamentalmente, en su potencial de diferenciacion y su capacidad para servir como vehiculo terapeutico de genes. De ahi la importancia de tener una fuente segura y confiable de celulas para su uso en el injerto celular si se tiene en cuenta que numerosos trabajos presentes en la literatura demuestran la utilidad de las celulas madre en la recuperacion del tejido danado (Lescaudron, 2003). En el presente estudio se empleo, como fuente de trasplante, celulas procedentes de la medula osea de rata. Antes de su uso se establecio la concentracion a la cual debian ser utilizadas, para obtener un resultado satisfactorio en cuanto al impacto que estas celulas pudieran tener sobre las alteraciones conductuales previamente encontradas en el modelo de AQ. Para partir de una concentracion adecuada, fue necesario apoyarse en la experiencia previa de trasplantes celulares que habian sido realizados por otro grupo de investigacion (Blanco, 2000).

Para este estudio se probaron tres concentraciones diferentes, distribuidas en tres grupos (grupo I:100 000 cel/[micron]L, grupo II:200 000 cel/[micron]L, y grupo III:300 000 cel/[micron]L), demostrando que la menor concentracion utilizada era la mas apropiada para los trasplantes en el modelo de AQ. Una explicacion posible a esta consideracion estuvo basada en el analisis de los resultados obtenidos en cada grupo; asi en los animales perteneciente al grupo I, con concentracion de celulas de 300 000 cel/[micron]L totales (figura 4A), se observo una supervivencia baja de las celulas trasplantadas y una respuesta inflamatoria potente. Los resultados concuerdan con los obtenidos por otros autores, que evidencian que en los trasplantes donde la concentracion celular a implantar es alta, no logran una buena integracion con el tejido hospedero. De igual manera los animales pertenecientes al grupo II con concentracion de 200 000 cel/mL totales (figura 4B), mostro un comportamiento similar al grupo I. Aunque la respuesta inflamatoria fue menos potente en este grupo, tambien se observo una baja sobrevivencia de las celulas trasplantadas. A diferencia de las concentraciones anteriores, para los animales pertenecientes al grupo III, con concentracion de celulas de 100 000 cel/mL totales (figura 4C), es decir una concentracion menor de celulas, se pudo apreciar una alta supervivencia celular. Se supone que esta ultima concentracion favorecio la integracion y migracion de las celulas, lo que sugiere que, en el lugar donde fueron implantadas, ellas pueden actuar de manera beneficiosa, si no hay agregacion de las mismas en el sitio de la inyeccion, ya que se favorece el desplazamiento, una vez que se han integrado en el tejido hospedero. Estos resultados permiten afirmar que la concentracion celular a utilizar en el trasplante es un parametro muy importante para lograr una adecuada sobrevivencia e integracion de estas celulas en el tejido hospedero. Por otro lado se piensa, como ya han sugerido otros autores, que el ambiente alrededor del sitio del implante interviene de alguna manera sobre las celulas que seran implantadas y viceversa, o sea que las celulas trasplantadas ejercen una influencia notoria sobre el tejido hospedero, siempre y cuando estas lleguen al sitio del implante en un numero adecuado que favorezca su insercion. Con relacion a la respuesta inflamatoria que tuvo lugar en cada uno de los grupos experimentales, se puede senalar que la respuesta mas baja fue encontrada en el grupo III, lo cual concuerda con los datos reportados por otros autores, y es congruente con los hallazgos encontrados, donde la maxima migracion y sobrevivencia celular tuvo lugar en aquel grupo cuya concentracion celular era mas baja, lo que favorecio junto a otros factores ambientales que las celulas no murieran y se integraran mejor al tejido. Esto explica el porque la respuesta inflamatoria fue menor para este grupo y abundante en los grupos I y II, donde el factor concentracion celular, mas el dano tisular previo provocado por la lesion AQ, marco el inicio de una respuesta inflamatoria que fue mas potente donde los mecanismos de muerte celular fueron mas evidentes.

Evaluacion funcional del trasplante de CMO a traves de la conducta motora

Conducta de Giro inducida por D-anfetamina

En los estudios dirigidos al desarrollo de nuevas estrategias terapeuticas para el tratamiento de la EH, asi como para la busqueda de alteraciones que expliquen la fisiopatologia de la enfermedad, se han usado diferentes modelos experimentales que tratan de simular sus caracteristicas clinicas. En el modelo utilizado, la inyeccion intraestriatal de AQ provoca la muerte de neuronas en el area lesionada, lo cual induce un deficit de la conducta motora (Hantraye, 1990). Para evaluar los trastornos conductuales que aparecen en este modelo, se pueden utilizar diferentes pruebas. Para este estudio se realizaron las rotaciones inducidas por D-anfetamina, como predictoras del grado de deficit motor presente en los animales, tanto antes de realizar el trasplante de CMO como despues de este. La conducta motora en esta prueba es dosis dependiente y usualmente se acompana de episodios de rotaciones en barril, las cuales han sido relacionadas con un incremento de la actividad de la dopamina en el estriado (Marrannes, 1988). Los animales controles tambien fueron sometidos a esta prueba con el objetivo de observar su conducta, aun cuando no hay posibilidades de obtener una asimetria como la encontrada en los animales lesionados. Este grupo control mostro una conducta estereotipada tipica, que fue debida a la reaccion que tiene un cerebro intacto ante la accion de un agonista dopaminergico. La grafica representada en la figura No. 5 muestra la conducta de giro antes y despues del trasplante de CMO, donde se puede constatar que antes del trasplante los animales lesionados desarrollaron una actividad rotatoria ipsilateral al hemisferio lesionado que contrasta con la conducta que aparece en los animales sanos descrita anteriormente. La explicacion a esta conducta hipercinetica clasica en los animales lesionados es debida a la perdida de las proyecciones gabaergicas inhibitorias, ya descrita por otros autores (Hantraye, 1990). Un hallazgo interesante para el grupo de lesion con AQ solamente, fue la disminucion estadisticamente significativa (p< 0,0093) de la Cconducta de Giro, que fue encontrada un mes despues de la lesion con el AQ (sin tratamiento con CMO) cuando se comparo con la prueba inicial que se realizo una semana despues de la lesion. Este resultado puede indicar la presencia de regeneracion espontanea de la lesion, lo cual ya ha sido descrito por otros autores, y traduce la existencia en el organismo de mecanismos compensatorios propios que ayudan a reparar parcialmente el tejido lesionado.

En el presente estudio tambien se observo que, un mes despues, los animales que recibieron trasplante de CMO mostraron una disminucion significativa en la Conducta de Giro inducida por D-anfetamina, lo que habla a favor de la efectividad del trasplante de CMO sobre el area lesionada. Estos resultados estan en linea con los de otros autores que afirman que el trasplante de CMO mejora los trastornos conductuales en los animales lesionados con AQ (Lescaudron, 2003).

Para explicar este efecto conductual, es necesario apoyarse en la idea de que las CMO trasplantadas son capaces de diferenciarse de otros tipos celulares, que no son del tejido que ellas originan, sino que tienen la potencialidad de convertirse en celulas del tejido nervioso (Sanchez Ramos, 2000). Este hecho puede ser responsable, al menos en parte, de la recuperacion motora vista en el grupo experimental despues del trasplante de CMO. Por otro lado, la accion positiva del trasplante puede estar modulada tambien por la produccion de diferentes factores neurotroficos, por parte de las CMO trasplantadas, que ejercen su accion sobre las celulas que estan en via de muerte y/o que circundan los tejidos lesionados. Estos factores potencian la supervivencia de las neuronas, favorecen su diferenciacion y funcionamiento e inducen a la formacion de sinapsis. En la literatura se han publicado datos referentes a la produccion por parte de la CMO de factores neurotroficos, tales como el BDNF (Dormady, 2001); por tanto, este podria ser otro mecanismo a traves del cual se pueda explicar como estas celulas revierten los efectos de la lesion producida por el AQ en el estriado.

Prueba de las habilidades motoras de las extremidades anteriores

La prueba de la escalera es una tarea eficaz para evaluar el uso de las extremidades anteriores, y se ha considerado una prueba compleja de conducta sensorimotora (Whihaw, 1992; Pavon,, 1998), que depende de la integridad del circuito intrinseco cortico-estriato-palidal (Montoya, 1990, Montoya, 1991). En el experimento hecho se observo que la lesion unilateral del estriado con AQ provoco una mayor dificultad en la utilizacion de las extremidades anteriores tanto derechas como izquierdas en aquellos grupos que presentaban lesion con AQ, cuando se compararon con los controles sanos. Cuando se aplico este paradigma a los animales lesionados se detecto que el deterioro encontrado en las extremidades anteriores, reflejaba el dano que ocasiono la perdida neuronal provocada por la lesion de AQ en el estriado. Igualmente, que las alteraciones fueron localizadas en ambos miembros superiores, sin predileccion por uno de ellos, lo cual pudo ser debido al dano de circuitos motores de integracion, localizados en ambos hemisferios cerebrales, implicados en la ejecucion de los movimientos de ambos miembros, de ahi la importancia de conocer la integridad de las vias nerviosas que intervienen en la correccion postural del animal (Montoya, 1990; Pavon, 1998). Tambien se demostro que despues del trasplante de CMO los animales mejoran en el empleo del uso de las extremidades anteriores, por lo que con esta prueba se evidencia tambien el efecto positivo del trasplante de CMO sobre el area lesionada. De manera general, los resultados obtenidos estan en concordancia con lo reportado por otros autores que ya han utilizado esta prueba para medir el deficit motor producido por la lesion y la recuperacion de este tras un trasplante de celulas madre (Pavon, 2004). Los mecanismos por medio de los cuales aparece la mejoria significativa en estos animales, estan muy relacionados con los explicados en la prueba de la Conducta de Giro inducida por D-anfetamina. Para este caso especifico sera necesario realizar otros estudios que permitan saber si estas celulas trasplantadas se diferenciaron en algun fenotipo neural que haya permitido la reconstruccion de circuitos danados o que permitan saber si estas celulas fueron capaces de liberar factores neurotroficos que previenen los cambios degenerativos de las neuronas estriatales y brindan una neuroproteccion que reduce el dano estriatal producido por la lesion (Alberti, 2005). Evidentemente se necesita profundizar mas en el conocimiento de los mecanismos por los cuales el trasplante de celulas actua sobre la zona lesionada, ya que este podria ser una diana farmacologica interesante para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, especialmente la EH.

Conclusiones

La dosis mas baja de AQ seleccionada fue capaz de lesionar adecuadamente el estriado, con una menor afectacion de estructuras fuera del estriado.

Las celulas de medula osea fueron positivas para los marcadores CD34, CD38, CD45 y CD90.Esto sugiere la heterogeneidad de esta poblacion.

La mejor concentracion de CMO para el trasplante fue la de 100 000 cel/ml, ya que con ella se obtuvo la mejor supervivencia y migracion celular.

Las pruebas conductuales demostraron una mejoria en la conducta motora de los animales trasplantados con CMO. Este resultado sugiere la importancia de las CMO en el recobrado de las funciones perdidas.

Recibido: agosto 3 de 2011

Aprobado: noviembre 30 de 2011

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Teresa Serrano Sanchez *, Lisette Blanco Lezcano *, Esteban Alberti Amador *, Ivan Diaz Armesto **, Nancy Pavon Fuente *, Lourdes Lorigados Pedre *, Maria Elena Gonzalez Fraguela *, Jorge Felipe Montero Leon ***, Liliana Francis Turner ****, Ivette Fernandez Verdecia *

* Centro Internacional de Restauracion Neurologica. Ave. 25 No. 15805 entre 158 y 160. Cubanacan, Playa. Codigo Postal 11300. LaHabana, Cuba. Correspondencia a: Teresa Serrano Sanchez, Centro Internacional de Restauracion Neurologica. Ave. 25 No. 15805 entre 158 y 160. Cubanacan, Playa. Codigo Postal 11300. La Habana,Cuba.E-mail: teresa.serrano@infomed.sld.cu Fax: (537) 33 6339/2420/ 6302 Telefax: 33 6028.Telefonos del CIREN: 271 5353/5379

** Hospital Clinico Quirurgico "Juaquin Albarran". Ave. 26.Playa. La Habana, Cuba.

*** Instituto Nacional de Oncologia y Rehabilitacion (INOR). 29 y E. Vedado. La Habana, Cuba.

**** Universidad del Tolima, Ibague, Tolima, Colombia.
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Title Annotation:ARTICULO DE INVESTIGACION
Author:Serrano Sanchez, Teresa; Blanco Lezcano, Lisette; Amador, Esteban Alberti; Diaz Armesto, Ivan; Pavon
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Article Type:Perspectiva general de la enferm
Date:Dec 1, 2011
Words:12204
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