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Enzyme complexes production by A. niger from soybean under solid state fermentation/Producao de complexos enzimaticos por A. niger a partir de soja por fermentacao em estado solido.

Introducao

A soja e o carro chefe da producao agricola nacional. Os graos maduros contem cerca de 40,7% de proteina, 22,7% de oleo, 10,9% de acucares totais, 6,7% de fibra e cerca de 5,8% de cinzas e 30,8% de carboidratos, em base seca (COSTA et al., 1974, apud VIEIRA et al., 1999).

A soja convencional e produzida pela maneira tradicional, bastante difundida em todo o mundo, com a utilizacao de tecnicas adequadas de plantio e adubos quimicos e defensivos agricolas. O cultivo de soja organica e realizado sem a presenca de adubos quimicos e defensivos (herbicidas, fungicidas e inseticidas), e o produto final, alem de proporcionar beneficios e nao agredir o meio ambiente, ainda possui valor agregado mais alto do que o cultivo tradicional. No cultivo transgenico, a soja e modificada geneticamente em estudos laboratoriais com a finalidade de obter um produto com caracteristicas novas ou melhoradas em relacao ao produto original, como maior produtividade, melhor resistencia a pragas e doencas etc. Assim, a soja e uma materia-prima de custo acessivel e apresenta em sua composicao importantes elementos bioquimicos (proteinas, lipidios, carboidratos, minerais, vitaminas, fibras, polissacarideos, lecitina, isoflavonoides etc.) que constituem excelente meio nutricional para o crescimento e desenvolvimento de microrganismos utilizados em processos de Fermentacao em Estado Solido.

Este processo apresenta grande capacidade de producao de enzimas, tornando-se importante pelo fato de se poder utilizar o solido fermentado bruto como fonte direta para a obtencao das mesmas (PANDEY, 2003). Diversas aplicacoes para as enzimas hidroliticas sao encontradas na industria de alimentos, producao de detergentes, na industria farmaceutica, de cosmeticos, no tratamento de couros, na obtencao de biocombustiveis, entre outras.

Assim, o objetivo do presente estudo foi o de avaliar o potencial de uso das sojas convencional, organica e transgenica na producao das enzimas amilase, protease, lipase e celulase por FES usando o fungo A. niger.

Material e metodos Microrganismo e substratos

O microrganismo utilizado foi o fungo A. niger, cedido pelo Laboratorio de Bioquimica do Centro de Ciencias Biologicas e da Saude, da Universidade Estadual do Oeste do Parana. Foram preparados repiques em meio de cultura BDA (batata dextrose agar) esterilizado e mantidos em refrigeracao. No preparo do inoculo, foram utilizados 700 mL de meio BDA inclinado, com o fungo mantido em estufa bacteriologica a 30[degrees]C por sete dias. Realizouse a retirada dos esporos com Tween 80 (0,01%) e filtragem da suspensao em algodao para retirada do micelio vegetativo. Foi determinada a concentracao de esporos em suspensao por meio de microscopio optico em Camara de Neubauer. Os substratos utilizados foram a soja convencional, a transgenica e a organica doadas por uma empresa da regiao de Toledo, Estado do Parana. Os graos foram fragmentados e classificados em diferentes tamanhos de particula (1,4; 1,0; 0,6 e 0,3 mm), sendo determinados os teores de umidade para a conducao das fermentacoes.

Fermentacao em estado solido e extracao das enzimas

Os ensaios de FES foram conduzidos em frascos erlenmeyer de 250 mL em estufa bacteriologica a 30[degrees]C. No estudo das curvas de crescimento do A. niger, a umidade inicial do meio solido foi de 50%. Os substratos esterilizados foram inoculados com suspensao de esporos e os valores de pHs corrigidos com solucao-tampao. Para pH's 3,0 e 3,9 foi utilizado o tampao acetato 0,05 M, para pH's 6,0 e 8,1 foi utilizado o tampao fosfato de sodio 0,2 M e para pH 9,0 foi utilizado o tampao acido boricoBorax (DEUTSCHER et al., 1990). Os nutrientes foram adicionados conforme o meio agar-Czapeck modificado por Yunginger et al. (1980). Apos a fermentacao, foi realizada a extracao das enzimas, utilizando-se tampao fosfato de sodio 50 mM pH 7,0 na proporcao solido:liquido 1:17 a 35[degrees]C durante 2h em incubadora orbital a 130 rpm. O extrato bruto foi filtrado e centrifugado a 10.000 g para a remocao dos solidos suspensos e, posteriormente, acondicionado a -20[degrees]C.

Metodos analiticos

A determinacao da concentracao de gorduras no material solido foi baseado no metodo citado por Silva e Queiroz (2002). Para determinacao das proteinas presentes nas amostras solidas utilizou-se o metodo de Kjeldahl (AOAC, 1984), que se baseia na quantificacao do nitrogenio total presente na amostra solida. O teor de umidade foi determinado por metodo gravimetrico (AOAC, 1995). A determinacao da concentracao de acucares redutores (AR) e acucares redutores totais (ART) foi adaptada do metodo de Miller (1959), que utiliza o reagente DNS (acido 3,5-dinitrosalicilico). A determinacao da atividade enzimatica da amilase foi realizada segundo a metodologia descrita por Pandey (1992). Uma unidade de atividade amilolitica (U) foi definida como a quantidade de micromols de acucares redutores liberados por min por g de massa seca pela enzima, nas condicoes de ensaio descritas, (U = [micro]mol AR [min..sup.-1] [g.sup.-1]). A atividade enzimatica da protease foi realizada segundo adaptacao do metodo descrito por Germano et al. (2003), utilizando solucao de BSA (Bovine Serum Albumine) como substrato para a enzima, e uma unidade de atividade proteolitica (U) foi definida como a quantidade de enzima que produziu uma variacao na medida de absortividade (em relacao ao branco) nas condicoes da analise, para 20 min. de incubacao por g de massa seca da amostra solida, U = [micro]mol [min.sup.-1] [g.sup.-1]. Na determinacao da atividade enzimatica da lipase, a metodologia utilizada foi adaptada de Freire et al. (1997a e b), citados por Gombert et al. (1999). Uma unidade da atividade lipolitica (U) foi definida como a quantidade de enzima que produz 1 micromol de acidos graxos equivalentes por min por g de massa seca da amostra solida (U = pmol [min.sup.-1] [g.sup.-1]). Para todas as enzimas estudadas, a atividade enzimatica especifica foi determinada pelo quociente entre a AE e a quantidade de proteina presente no solido fermentado.

Analise estatistica

Utilizou-se o programa computacional STATISTICA[TM] (v. 8.0, StatSoft, Inc.) para calcular os efeitos principais das variaveis e suas interacoes, bem como os dados relativos a Analise de Variancia (ANOVA), com um nivel de significancia de 5%. O planejamento experimental DCCR (delineamento composto central rotacional) e a metodologia de superficie de resposta foram utilizados para otimizar as condicoes da FES e fornecer um modelo matematico adequado para a atividade enzimatica (AE) e atividade enzimatica especifica ([AE.sub.esp]) do processo.

Resultados e discussao

Caracterizacao das sojas

Foi realizada a caracterizacao dos tres tipos de soja quanto aos teores de acucares redutores (AR), acucares redutores totais (ART), proteinas, gorduras e atividades de amilase e protease, em diferentes tamanhos de particula. Com relacao ao conteudo de AR, observou-se o maior valor para soja organica (0,75 mg glicose [mL.sup.-1]) para a fracao de tamanho de particula 0,6 mm. Nesta mesma fracao granulometrica, as sojas transgenica e convencional apresentaram valores inferiores (aproximadamente 0,5 mg glicose [mL.sup.-1]). Para o conteudo de ART, a soja organica apresentou 3,2 mg glicose [mL.sup.-1] na fracao de 0,6 mm, sendo que, para o mesmo tamanho de particula, a soja transgenica apresentou valor semelhante e a soja convencional atingiu menor teor (0,25 mg glicose [mL.sup.-1]). O maior valor de ART (3,75 mg glicose [mL.sup.-1]) foi observado para a soja convencional com 1,4 mm. Com relacao aos teores de proteina, na fracao de 0,6 mm observou-se o maior valor para a soja convencional (43%), enquanto que as sojas transgenica e organica atingiram valores inferiores a 40%. Com relacao a quantidade de gordura, na fracao de 0,6 mm o maior valor foi obtido para a soja transgenica (26%). Na determinacao da atividade amilolitica, notou-se que para os tres tipos de soja, houve um nivel mais elevado de atividade na fracao que contem particulas de 0,6 mm. Para a atividade da protease, verificou-se que as sojas organica e convencional apresentaram valores reduzidos para a fracao de 0,3 mm e valores mais altos para a fracao correspondente a 1,0 mm de tamanho de particula. Este resultado pode ser justificado pela maior quantidade de material proteico presente nas camadas intermediarias e externas do grao de soja, que estao contidas nas maiores fracoes granulometricas, de acordo com Moraes e Silva (1996).

Curvas de crescimento do A. niger

Foi avaliada a producao da enzima protease pelo fungo, considerando o tamanho de particula de 0,6 mm do substrato, fracao que apresentou maior teor de proteina na caracterizacao das sojas. O grafico da Figura 1(a) apresenta as curvas de atividade de protease, para os tres tipos de soja. Os valores mais altos foram obtidos nos tempos de 96 e 168h de fermentacao para a soja organica, 120h para a soja transgenica e 144h para a soja convencional. Os melhores resultados de produtividade do processo foram: 0,375 U [h.sup.-1] para a soja organica no tempo de 96h, 0,283 U [h.sup.-1] para a soja transgenica no tempo de 120h. A soja convencional apresentou produtividade de 0,264 U [h.sup.-1] para 144h, observando-se tambem a maior atividade enzimatica (aproximadamente 0,642 U). Menezes et al. (2006) observaram atividade enzimatica da protease de 5,78 U [mL.sup.-1], utilizando como substratos residuo de maracuja (33,25%) e farelo de trigo (66,75%), com umidade de 62,5%, apos 64h de fermentacao, o que corresponde a 0,09 U [mL.sup.-1] [h.sup.-1], na producao de poligalacturonase por FES por meio do fungo A. niger. Coelho et al. (2001), na producao de enzimas a partir da casca de coco verde por FES com A. niger, obtiveram produtividade maxima de protease de 26 U m[g.sup.-1] [min.sup.-1] para um tamanho de particula do substrato de 0,59 mm.

Nas curvas de atividade enzimatica da lipase (Figura 1(b)), notou-se que, para a soja convencional, a maxima atividade da lipase foi obtida em torno de 72h. Para a soja organica obtiveram-se os resultados mais altos entre 120 e 168h e para a soja transgenica o pico de atividade foi obtido em 144h. Observou-se a inexistencia de um padrao de comportamento cinetico para os diferentes tipos de sojas, o que poderia sugerir eventual diferenca nas rotas metabolicas seguidas pelo fungo, em funcao do tipo de soja usado. Com base nos valores de produtividade para o processo, obteve-se melhor resultado para a soja convencional no tempo de 72h com produtividade de 0,0069 [10.sup.-3] U [h.sup.-1], seguido da soja organica (0,00625 [10.sup.-3] U [h.sup.-1]) e da soja transgenica no tempo de 144h com produtividade de 0,0045 [10.sup.-3] U [h.sup.-1]. Vargas et al. (2004), na producao de lipase por Penicillium simplicissimum, utilizando torta de soja como substrato, obteve produtividade de 0,375 U [g.sup.-1] [h.sup.-1], em ensaios realizados em bequeres, com parametros operacionais otimos (27,5[degrees]C e 55% de umidade). O autor observou que a umidade e a temperatura foram os principais fatores na obtencao da enzima. De maneira semelhante, Kempka et al. (2008), na producao e caracterizacao da lipase por FES com Penicillium verrucosum, utilizando farelo de soja como substrato, obtiveram uma atividade enzimatica de 40 U [g.sup.-1] em 48h de fermentacao e 52 U [g.sup.-1] em 72h de fermentacao, em condicoes otimas de operacao de 27,5[degrees]C e 55% de umidade inicial do substrato. A maxima produtividade foi alcancada com 0,74 U [g.sup.-1] [h.sup.-1]. Os autores afirmam que os diferentes indutores usados para a producao da enzima nao afetaram o processo, que foi influenciado pela temperatura e umidade inicial do meio. Comparativamente aos valores encontrados pelos autores mencionados, os quais utilizaram torta e farelo de soja, os valores obtidos neste trabalho podem indicar que o fungo da especie Aspergillus nao apresenta caracteristicas favoraveis a producao de enzimas lipoliticas a partir da soja ou seu residuo. Uma alternativa a este processo seria a utilizacao de meios com composicao conhecida, capazes de induzir o microrganismo a produzir este complexo enzimatico.

Para a atividade enzimatica da amilase (Figura 1(c)), observomse a maior AE para as sojas organica e convencional apos 96h de fermentacao (aproximadamente 1,5 U). Um valor de atividade semelhante foi observado para a soja convencional com 144h de fermentacao. No entanto, como os valores de atividade sao semelhantes, em termos de rendimento o melhor tempo de fermentacao e 96h. Kunamneni et al. (2005) obtiveram uma atividade enzimatica de 534 U [g.sup.-1] de farelo de trigo, na producao de amilase por FES, utilizando o fungo Thermomyces lanuginosus, apos um periodo de 120h de fermentacao, com 90% de umidade inicial a 50[degrees]C. Verificaram que a producao de amilase duplicou com a adicao no meio fermentativo de 1% de amido soluvel (m [m.sup.-1]) e 1% de peptona (m [m.sup.-1]). Anto et al. (2006) observaram maxima producao da enzima de 271,2 U [g.sup.-1], utilizando farelo de trigo como substrato, com pH e temperatura otimos de 5,0 e 55[degrees]C, respectivamente, por FES pelo fungo Aspergillus sp., e notaram aumento da producao da enzima pela adicao de nitrogenio organico (extrato de levedura e peptona, 0,02 U [g.sup.-1]). Os resultados obtidos neste estudo e comparados aos dos autores mencionados sugerem que uma otimizacao do meio fermentativo pela adicao de fonte de nutrientes a soja seria indicada para melhor producao da amilase fungica. Notou"se que, para cada tipo de soja, uma producao simultanea das enzimas amilase, lipase e protease pelo fungo denotava comportamentos diferentes para cada enzima nos diferentes tempos de fermentacao.

Para a producao de lipases, a soja nao seria um substrato ideal, pelo fato dela apresentar polissacarideos e proteinas em altas quantidades em sua composicao, em relacao a quantidade de lipideos, fato que foi comprovado pelo baixo valor de producao de lipases.

[FIGURE 1 OMITTED]

Avaliacao dos parametros operacionais da FES com A niger

Foram realizadas fermentacoes com base nos melhores resultados obtidos para a enzima protease, estabelecidos anteriormente, devido a caracteristica proteica do substrato. O planejamento fatorial completo [2.sup.3] foi utilizado para avaliar as variaveis do processo adotadas neste experimento: umidade inicial do meio (U), tamanho de particula do substrato (dp) e concentracao inicial do inoculo ([C.sub.0]). O tipo de soja utilizado (convencional) e o tempo de fermentacao (144h) foram os parametros fixos deste planejamento, assim como a temperatura otima de crescimento do fungo (30[degrees]C). Na Tabela 1 estao apresentadas as especificacoes dos niveis das variaveis usadas no planejamento nas suas formas codificadas (-1, 0, +1) e reais (entre parenteses) bem como os resultados obtidos para atividade enzimatica especifica ([AE.sub.esp]). Observa-se que os melhores resultados foram obtidos no ponto central do experimento (nivel 0).

Os ensaios 4 e 6 nao puderam ser analisados, pelo aspecto leitoso (turvo) do extrato enzimatico, com solidos suspensos. Desta forma, as etapas de filtracao e centrifugacao do extrato enzimatico nao puderam ser realizadas com eficiencia, ja que o extrato obtido nao pode ser clarificado, impedindo a aplicacao do metodo colorimetrico para medida de atividade. Assim, fez-se a analise estatistica do experimento usando a matriz do planejamento experimental, porem excluindo os ensaios 4 e 6 no programa STATISTICA. Os ensaios 9, 10, 11 e 12 sao replicatas realizadas do ponto central (nivel 0), com o intuito de verificar a reprodutibilidade e o erro experimental.

A estimativa dos efeitos principais e de interacao das variaveis e demais calculos estatisticos para o planejamento estao apresentadas na Tabela 2, para a [AE.sub.esp]. Os valores destacados em negrito e italico indicam que o efeito e significativo para o intervalo de confianca de 95% (p < 0,05). Nota-se que a umidade (U), a concentracao inicial do inoculo ([C.sub.0]), a interacao entre dp e [C.sub.0], bem como a interacao entre as tres variaveis avaliadas foram significativas no intervalo de confianca de 95%. Observa-se que U e C0 tem influencia positiva na resposta, ou seja, aumentando estas variaveis, verifica-se aumento no valor de [AE.sub.esp]. Ja, para as interacoes dpx[C.sub.0] e Uxdpx[C.sub.0], observa-se influencia negativa sobre o valor de [AE.sub.esp] indicando que nao ha sinergismo entre as variaveis.

Por meio da analise de variancia para o planejamento (Tabela 3), resultados para o teste F foram gerados (BARROS NETO et al., 2007). O valor tabelado de F para um intervalo de confianca de 95% e com os graus de liberdade e: F (6;3;0,05) = 8,94; e como [F.sub.calc] > [F.sub.tab], o modelo linear proposto pelo tipo de planejamento usado e valido. Pode-se, entao, descrever empiricamente o modelo matematico de [AE.sub.esp] em funcao das variaveis significativas (Equacao 1).

[AE.sub.esp] = 16,9898 + 7,6305 x U + 3,0943 x [C.sub.0] - 9,0468 x dp x [C.sub.0] -10,6470 x U x dp x [C.sub.0] (1)

em que:

[AE.sub.esp] e a atividade enzimatica especifica (U g de [proteina.sup.-1])

U e a umidade inicial do meio (%)

dp e o tamanho de particula do substrato (mm)

[C.sub.0] e a concentracao inicial de inoculo (esporos [g.sup.-1])

A superficie de resposta obtida para o modelo linear e apresentada no grafico da Figura 2. Como mencionado anteriormente, para a obtencao de valores mais elevados de [AE.sub.esp], deve-se conduzir os experimentos na direcao dos maiores valores de umidade e concentracao inicial de inoculo.

[FIGURE 2 OMITTED]

Han et al. (2003), analisando os efeitos da temperatura e umidade relativa no crescimento e producao de enzimas por Actinomucor elegans e Rhizopus oligosporus na preparacao de queijo de soja, observaram producao de protease de 108 U [g.sup.-1] de substrato apos 48h de incubacao e 25[degrees]C, com umidade relativa entre 95-97%, para Actinomucor elegans. Para Rhizopus oligosporus, os autores observaram producao de 104 U [g.sup.-1] de substrato apos 48h de incubacao e 35[degrees]C, com umidade relativa de 95-97%. Concluiram que Rhizopus oligosporus era uma boa alternativa ao Actinomucor elegans para a producao de queijo de soja em estacoes climaticas com temperaturas elevadas. Agrawal et al. (2004) obtiveram maxima atividade da protease (8500 U [g.sup.-1]) em pH 9,0 a 45[degrees]C, na producao de protease alcalina por Penicillium sp. por FES e utilizando farelo de soja. Comparando aos resultados dos autores citados anteriormente, os resultados obtidos neste presente trabalho sao inferiores, indicando que, alem da umidade e concentracao inicial de inoculo, a especie do microrganismo utilizado e o pH do meio podem exercer influencia significativa na producao da protease. De acordo com os melhores resultados apresentados na avaliacao dos parametros da FES, na sequencia do estudo foram utilizados como parametros fixos a umidade (U) de 50% e o valor mais alto para [C.sub.0] (4.106 esporos [g.sup.-1]), com o intuito de otimizar as variaveis do processo fermentativo. O valor mais alto de [AE.sub.esp] foi 19,168 U g [proteina.sup.-1] (ensaio 12).

Otimizacao dos parametros operacionais da FES para a protease com A. niger

Com o intuito de determinar as melhores condicoes para a producao de protease, utilizou-se um planejamento experimental do tipo DCCR (delineamento composto central rotacional), com duas variaveis: tamanho de particula do substrato (dp) e pH da solucao nutriente (pH), utilizando solucoes-tampao com diferentes valores de pH para o preparo das solucoes nutrientes. Este planejamento permite, por meio da analise de regressao dos pontos experimentais, gerar modelos quadraticos, resultando em superficies de resposta curvas (RODRIGUES; IEMMA, 2005). Os demais parametros operacionais foram mantidos fixos para a FES com soja convencional: concentracao inicial de inoculo de [4.10.sup.6] esporos [g.sup.-1], tempo de fermentacao de 144h, umidade do meio fermentativo de 50% e temperatura de 30[degrees]C. A Tabela 4 apresenta o DCCR, em que os niveis (-1,414) e (+1,41) permitem gerar os termos quadraticos na equacao do modelo.

A estimativa dos efeitos principais e das interacoes das variaveis para o planejamento, referente a [AE.sub.esp] e apresentada na Tabela 5, em que (L) representa a parte linear e (Q) a parte quadratica do modelo. Os valores destacados em negrito e italico indicam que o efeito e significativo para o intervalo de confianca de 95% (p < 0,05). Assim, nota-se que nenhuma variavel avaliada foi significativa para [AE.sub.esp].

A analise de variancia para o planejamento obtida para [AE.sub.esp] esta apresentada na Tabela 6. Para um intervalo de confianca de 95%, tem-se o valor tabelado de F, com os respectivos graus de liberdade: [F.sub.tab] (5;5;0,05) = 5,05. sendo [F.sub.calc] < [F.sub.tab] 0 modelo linear proposto nao e valido para predizer o comportamento do processo. Entretanto, a superficie de resposta para [AE.sub.esp] da protease pode ser usada no sentido de verificar a direcao a ser tomada nos proximos planejamentos, visando a modelagem mais precisa para a otimizacao dos parametros.

Como observado nos resultados de [AE.sub.esp] do planejamento e nos valores negativos dos efeitos das variaveis, melhores resultados podem ser obtidos para valores mais baixos de pH e valores intermediarios de dp. Assim, planejamentos experimentais subsequentes podem ser conduzidos com diferentes faixas de estudo das variaveis, objetivando maior precisao dos parametros a serem otimizados. A matriz de dados (Tabela 4) indica, para o melhor resultado de [AE.sub.esp] (21,40 Ug de proteina-1), que o pH 3,0 e dp 0,6 mm foram os melhores parametros de processo para este planejamento, juntamente com o uso da soja convencional, U 50%, [C.sub.0] [4.10.sup.6] esporos [g.sup.-1], 144h de fermentacao a 30[degrees]C.

Li et al. (2008) obtiveram uma AE de protease de, aproximadamente, 30 U [mL.sup.-1], em pH acido a 45[degrees]C, no estudo da protease extracelular por A. niger B1-D recombinante. Os autores observaram aumento significativo na atividade da enzima em temperaturas elevadas (em torno de 45[degrees]C), ao passo que, na producao de protease extracelular por A.niger AB100 mutante, Basu et al. (2008) notaram maxima producao de protease de 2,776 [micro]mol [mL.sup.-1] [min.sup.-1], utilizando farelo de soja como substrato, com pH e temperatura otimos de 7,0 e 30[degrees]C, respectivamente. Concluiram que a atividade maxima da enzima foi encontrada quando o meio fermentativo foi enriquecido com 5% de glicose (m [v.sup.-1]) e 2,5% de ureia (m [v.sup.-1]). Observando os resultados obtidos da fermentacao com soja e os resultados dos autores anteriormente citados, nota-se que este substrato pode ser considerado viavel para a producao de protease, utilizando o fungo A. niger, sendo que os parametros de otimizacao no processo fermentativo, neste caso, indicaram maior producao de complexos enzimaticos em pH acido.

Conclusao

As curvas de crescimento impossibilitaram a determinacao do comportamento cinetico das enzimas, sugerindo uma discrepancia nas rotas metabolicas seguidas pelo fungo. A avaliacao e otimizacao da fermentacao foram conduzidas com relacao a protease. O melhor substrato foi a soja convencional com 144h de fermentacao, umidade de 50%, [C.sub.0] de [4.10.sup.6] esporos [g.sup.-1] e dp de 0,6 mm. Na otimizacao dos parametros de fermentacao, dp e pH nao influenciaram significativamente o processo. Os valores negativos dos efeitos indicaram que melhores resultados podem ser obtidos em pH 3,0 e dp de 0,6 mm, onde observou-se o melhor resultado de [AE.sub.esp] (21,40 U g [proteina.sup.-1]).

Agradecimentos

A Fundacao Araucaria, pelo financiamento do projeto.

Doi: 10.4025/actascitechnol.v34i2.9447

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Received on February 20, 2010.

Accepted on January 26, 2011.

License information: This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Leandro Daniel de Paris (1)*, Fabiano Bisinella Scheufele (2), Ademir Teixeira Junior (2), Thiago Luiz Guerreiro (2) e Salah Din Mahmud Hasan (2)

(1) Departamento de Engenharia Quimica, Universidade Estadual de Maringa, Av. Colombo, 5790, 87020-900, Maringa, Parana Brasil.

(2) Departamento de Engenharia Quimica, Universidade Estadual do Oeste do Parana, Toledo, Parana, Brasil. *Autor para correspondencia.

E-mail: leandroparis@hotmail.com
Tabela 1. Matriz do planejamento completo 23 com os resultados
de [AE.sub.esp].

Ensaio    U (%)     dp (mm)    [C.sub.0] (esp        [AE.sub.esp] (U g
                               [gms.sup.-1])           [prot.sup.-1])

1        -1 (35)   -1 (0,3)    -1 (5.[10.sup.4])           7,536
2        +1 (65)   -1 (0,3)    -1 (5.[10.sup.4])           1,250
3        -1 (35)   + 1 (1,0)   -1 (5.[10.sup.4])           4,994
4        +1 (65)   + 1 (1,0)   -1 (5.[10.sup.4])             --
5        -1 (35)   -1 (0,3)    + 1 (4.[10.sup.6])          10,524
6        +1 (65)   -1 (0,3)    +1 (4.[10.sup.6])             --
7        -1 (35)    +1(1,0)    +1 (4.[10.sup.6])           14,383
8        +1 (65)   + 1 (1,0)   +1 (4.[10.sup.6])           8,603
9        0 (50)     0 (0,6)    0 (5,25.[10.sup.5])         17,585
10       0 (50)     0 (0,6)    0 (5,25.[10.sup.5])         15,348
11       0 (50)     0 (0,6)    0 (5,25.[10.sup.5])         15,858
12       0 (50)     0 (0,6)    0 (5,25.[10.sup.5])         19,168

Tabela 2. Estimativa dos efeitos para AEesp da protease no
planejamento completo 23.

Variavel              Efeito    Erro-padrao   p-valor    Coeficiente

Intercepto           16,9898      0,8696      0,000293     16,9898
U                    15,2610      2,4597      0,008437     7,6305
Dp                    0,9115      1,7392      0,636486     0,4558
[C.sub.o]             6,1885      1,7392      0,037872     3,0943
U x dp                0,2530      1,7392      0,893569     0,1265
dp x [C.sub.0]       -18,0935     2,4597      0,005193     -9,0468
U x dp x [C.sub.o]   -21,2940     2,4597      0,003242    -10,6470

[R.sup.2] = 0,970 (coeficiente de determinacao do modelo).

Tabela 3. Analise de variancia obtida para o planejamento
completo 23 para AEesp.

Fonte de        Soma      Graus de      Media      [F.sub.calc]
variacao     Quadratica   Liberdade   Quadratica

Regressao      301,30         6         50,22         16,60
Residuos        9,08          3          3,03

Total          310,38         9

Tabela 4. Matriz do planejamento DCCR com os resultados de
[AE.sub.esp].

Ensaio      dp (mm)           ph           [AE.sub.esp]
                                        (U g [prot..sup.-1])

1           -1 (0,4)       -1 (3,9)            17,155
2           1 (0,9)        -1 (3,9)            14,778
3           -1 (0,4)       1 (8,1)             15,946
4           1 (0,9)        1 (8,1)             19,795
5           0 (0,6)        0 (6,0)             20,457
6           0 (0,6)        0 (6,0)             17,919
7           0 (0,6)        0 (6,0)             17,454
8           0 (0,6)      1,414 (9,0)           15,385
9           0 (0,6)      -1,414 (3,0)          21,400
10        1,414 (1,0)      0 (6,0)             14,008
11        -1,414 (0,3)     0 (6,0)             15,533

Tabela 5. Estimativa dos efeitos para AEesp da protease para o
planejamento DCCR.

Variavel          Efeito    Erro-padrao   p-valor    Coeficiente
                                                     regressao

Intercepto        18,6099     1,3179      0,000032     18,6099
dp (L)            -0,1711     1,6143      0,919705     -0,0855
dp (Q)            -3,6717     1,9216      0,114282     -1,8358
pH (L)            -1,1744     1,6143      0,499519     -0,5872
pH (Q)            -0,0486     1,9216      0,980786     -0,0243
dp (L) x pH (L)   3,1130      2,2828      0,230856     1,5565

[R.sup.2] = 0,560 (coeficiente de determinacao do modelo).

Tabela 6. Analise de variancia obtida para o planejamento DCCR
para [AE.sub.esp.]

Fonte de        Soma      Graus de      Media      [F.sub.calc]
variacao     Quadratica   Liberdade   Quadratica

Regressao      33,17          5          6,64          1,27
Residuos       26,06          5          5,21

Total          59,23         10
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Author:de Paris, Leandro Daniel; Scheufele, Fabiano Bisinella; Teixeira, Ademir, Jr.; Guerreiro, Thiago Lui
Publication:Acta Scientiarum. Technology (UEM)
Date:Apr 1, 2012
Words:5461
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