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Embryo-fetal Development of Iris: Immunohistochemestry of Morphogen Shh/Desarrollo Embriofetal del Iris: Inmunotincion del Morfogeno Shh.

INTRODUCCION

El iris tiene varias funciones, tales como regular la cantidad de luz que ingresa a las vias visuales y que llega a la retina, participar en el ajuste focal de los objetos mas cercanos y estar implicado en la circulacion del humor acuoso y en la regulacion de la presion intraocular. Durante la embriogenesis, el iris se forma a partir de la copa optica y del mesenquima periocular. A lo largo de este desarrollo, ocurre una especificacion de la capa periferica de la copa optica a un destino no neuronal, migracion de celulas del mesenquima periocular circundante y la formacion de musculos lisos del neuroectodermo (Cvekl & Tamm, 2004; Davis-Silberman & Asheiy-Padan, 2008).

Durante el desarrollo del segmento anterior del bulbo ocular, las celulas que se originan desde el epitelio superficial necesitan interactuar con las celulas mesenquimales, que se originan principalmente en la cresta neural. Los defectos de la interaccion epitelio-mesenquimatica dan como resultado trastornos del desarrollo tales como la aniridia. La hipoplasia o ausencia del iris puede ser inducida experimentalmente en el raton por deficiencia de la vitamina A materna (Cvekl & Tamm).

Entre los factores de transcripcion que se han identificado para participar en la coordinacion del desarrollo anterior del bulbo ocular esta PAX6, que es activo tanto en celulas epiteliales como mesenquimales durante el desarrollo ocular, aunque a diferentes dosis y etapas del desarrollo (Glaser etal, 1994). Por otra parte, la proteina morfogenetica de hueso 4 (BMP4) y el factor de crecimiento transformante B2 (TGF-B2) estan directamente involucrados en los procesos que controlan la morfogenesis en la parte anterior del bulbo ocular. BMP4 se expresa en iris, cuerpo ciliar y epitelio pigmentario de la retina de embrion y adulto (Ashery-Padan etal., 2000), en cambio en TGF-B2 en fotorreceptores, microglia y celulas musculares lisas ubicadas en vasos sanguineos (Sukhikh et al, 2010).

Sonic hedgehog (Shh) es un morfogeno, es decir, una molecula de naturaleza organica que es producida y secretada por un grupo de celulas embrionarias y que puede difundir y actuar a distancia sobre otras celulas o tejidos (Tabata & Takei, 2004). En el bulbo ocular puede separar campos visuales a fines de tercera semana en la especie humana (Wallace, 2008). Variaciones en la senalizacion de Shh puede producir diversas malformaciones congenitas como holoprosencefalia, anomalias craneofaciales y ciclopia (Rimkus et al., 2016). Existen pocos estudios sobre el rol de Shh en el desarrollo ocular en etapas avanzadas. Nuestro objetivo fue reconocer los cambios histologicos graduales de los derivados perifericos de la copa optica y del mesenquima periocular como tambien reconocer la presencia del morfogeno Sonic hedgehog (Shh) en las capas que constituyen el esbozo de iris en los periodos mas avanzados del desarrollo.

MATERIAL Y METODO

Se utilizaron 15 ratones hembra (Mus musculus) adultas jovenes. Estas se colocaron en jaulas con machos reproductivamente sanos y jovenes. Se considero como el dia 1 post-coital el momento en que se verifica la presencia de tapon mucoso a nivel vaginal, lo que significa que hubo copula. A los 12, 14,5 y 17 dias post-coital (dpc), los ratones gestantes se anestesiaron y se practico eutanasia con tiopental sodico. Los embriones y fetos fueron fijados en formalina al 10 % tamponada en PBS e incluidos en paraplast. Se obtuvieron cortes de 5 [micro]m con microtomo Microm (HM315R), los cuales se adhirieron a portaobjetos xilanizados y con carga positiva (Citoglas). Fueron adheridos 4 cortes por portaobjeto, considerando un total de 3 portaobjetos por muestra. Se realizo tincion histologica con Hematoxilina-Eosina y tecnica inmunohistoquimica. La recuperacion antigenica fue realizada en vaporera por 40 minutos, con los cortes sumergidos en solucion desenmascarante de antigenos (Vector Labs, H-3301). Se realizo bloqueo de peroxidasa endogena con peroxido de hidrogeno en metanol y bloqueo inespecifico de proteinas con PBS[+ or -]BSA al 3 %. Para la incubacion con el anticuerpo primario SHH (Santa Cruz Biotechnology, H-160, conejo) se uso una dilucion 1:100 en PBS. Para la deteccion del anticuerpo primario se incubo con polimero conjugado con anticuerpo anti-conejo y HRP durante 15 minutos (SuperPictureTM, Thermo Fisher, 878963). Como sustrato para la HRP se uso diaminobencidina (DAB, Vector Labs, SK-4100). El control negativo estuvo dado por el desarrollo de la tecnica completa, pero sin considerar el anticuerpo primario. Como control positivo se considero la notocorda. Los cortes transversales seriados fueron analizados si resultaron marcados positivamente y fueron descritos morfologicamente

Los cortes histologicos fueron fotografiados en un microscopio optico Leica ICC50 HD conectado a un computador. Se realizo una descripcion morfologica de caracter cualitativo de las celulas del iris y se midio la altura de la capa interna del iris, capa externa del iris, capa nerviosa y capa pigmentaria de la retina con software ImageJ 1.50i (NIH, EE.UU.), presentandose como media y desviacion estandar. Se utilizo test de ANOVA de dos vias y post-test de Tukey, con el software GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE.UU), considerandose un valor de p<0,05 como significativo.

RESULTADOS

A los 12 dpc se observa la copa optica con sus dos hojas capa retiniana interna (CRI), capa retiniana externa (CRE) y lente. Entre la retina y el lente se observa una matriz extracelular rica en glicosaminoglicanos, en cuyo espesor se observan vasos sanguineos con globulos rojos nucleados. Entre el lente y el ectodermo superficial se identifican 4 capas de celulas mesenquimales (Fig. 1). La altura de la CRI en su porcion periferica fue de 36,069[+ or -]1,936 [micro]m y en la porcion central 67,326[+ or -]3,264 [micro]m, y la CRE periferica 13,457[+ or -]2,469 [micro]m y a nivel central 9,562[+ or -]1,528 mm.

A los 14,5 dpc ocurre la diferenciacion del iris. La diferenciacion del iris tiene lugar en la copa optica donde se encuentran las retinas neural y pigmentaria. El iris rodea la parte exterior del lente, contiene una capa epitelial interna (IRI) que mide 25,502[+ or -]2,501 [micro]m y una capa epitelial externa (IRE) cuyo espesor es de 13,097[+ or -]1,977 mm, que se continuan con las capas neural que en la periferia mide 65,173[+ or -]5,871 [micro]m y a nivel central 222,929[+ or -]22,213 mm, y pigmentaria de la retina con un espesor periferico de 26,045[+ or -]4,231 [micro]m y central de 12,286[+ or -]1,719 mm. Se observan 8-10 capas celulares mesenquimales (Fig. 2).

A los 17 dpc, la altura del epitelio de la capa nerviosa de la retina se concentra en la parte central midiendo 160,357[+ or -]11,978 [micro]m y disminuye hacia la region periferica a 102,111[+ or -]5,789 [micro]m. La capa externa (o pigmentaria) de la retina varia en forma inversa desde la parte media con 7,756[+ or -]0,951 [micro]m hasta la region mas periferica donde aumenta a 12,911[+ or -]1,539 [micro]m. Aun no se ha constituido el estroma del iris, tampoco esta formado el cuerpo ciliar. La IRI mide 18,725[+ or -]3,324 |m la IRE 34,623[+ or -]3,178 |m (Fig. 3).

Al comparar las diferentes alturas, hubo diferencias significativas en relacion a la capa externa del iris, donde se evidencio un aumento en su longitud entre los 14,5 a 17 dpc. La capa nerviosa de la retina en su porcion central y la capa pigmentaria de la retina en su porcion periferica, evidenciaron diferencias significativas entre todos los grupos, mostrando un espesor mayor a las 14,5 dpc, seguido por el grupo de 17 dpc y el menor lo presentaron los embriones de 12,5 dpc. En la porcion periferica, existio una progresion lineal de menor a mayor segun el avance de la gestacion, con diferencias significativas (Tabla I).

En relacion a la inmunotincion, la capa epitelial interna del iris presenta una parte con inmunotincion positiva al anticuerpo anti-SHH y otra parte que constituye un epitelio de celulas cilindricas simples negativas a este anticuerpo. La capa epitelial externa presenta epitelio cilindrico simple negativos al anticuerpo anti-SHH. Las capas de la retina tambien son positivas, como tambien la pared externa del lente (Fig. 3).

DISCUSION

En este estudio se ha reconocido cambios histologicos de los derivados de la copa optica y del mesenquima periocular. Tambien se observo la presencia de Sonic hedgehog (Shh) en las capas que constituyen el esbozo de iris en los periodos mas avanzados del desarrollo, como a las 17 dpc.

Sobre los cambios histologicos de los derivados perifericos de la copa optica, cuando ha transcurrido el 57 % de la gestacion, se evidencia el desarrollo del iris. Es asi como a los 12 dpc ocurren cambios significativos tanto en la altura del epitelio de la capa nerviosa de la retina, como tambien de la capa externa. La capa nerviosa de la retina disminuye en altura desde el centro hacia la periferia, en cambio la capa externa (que en esta cepa de raton no es pigmentada) aumenta su espesor hacia la periferia, para formar las capas interna y externa del iris. Esto se relaciona con lo observado por Davis-Silberman & Ashery-Padan quienes indican que la diferenciacion neuronal progresa desde la retina central hacia la periferia hasta alcanzar el margen de la copa optica, la cual contiene los progenitores del iris y cuerpo ciliar. En las etapas siguientes, es decir a los 14,5 dpc y 17 dpc, estos cambios se acentuan en el iris, lo cual es similar a lo observado por el mismo grupo de estudio, quienes indican que los progenitores ya se han diferenciado de la neuroretina y no expresan marcadores neuronianos [beta]III-tubulma, como tampoco hay mitosis. A los 17 dpc no se ha constituido el estroma del iris, ni tampoco el cuerpo ciliar.

Sobre los cambios histologicos del mesenquima periocular, solo hubo un aumento de las capas de celulares migratorias conforme avanza la gestacion. De acuerdo con Reza & Yasuda (2004) estas se encontraban entre el angulo de la futura cornea y el margen de la copa optica.

En el caso del reconocimiento de la presencia de Sonic hedgehog (Shh) en las capas que constituyen el esbozo de iris, observamos que a los 17,5 dpc existe una inmunotincion positiva del morfogeno Shh en el primer segmento de la capa interna del iris. Este epitelio pierde completamente la inmunotincion en el ultimo segmento del iris. Por el contrario, la capa externa del iris es completamente negativa al anticuerpo anti-SHH. Otras estructuras que resultaron positivas fueron la capa ganglionar de la retina. Esto ultimo concuerda con los estudios realizados por Perron et al. (2003) en los cuales indica que Shh se expresa en la capa ganglionar de la retina. Ademas ha sido demostrado que Shh juega un rol importante en la diferenciacion de fotoreceptores y en el control de poblaciones de celulas ganglionares (Levine et al., 1997; Zhang & Yang, 2001). En estudios realizados en alevines de Salmon Salmo salar observamos inmunotincion positiva en las celulas ganglionares y capa nuclear interna de la retina (Rojas et al., 2016).

Tambien observamos la inmunotincion positiva del epitelio del lente. Varios autores han enfatizado el rol del lente en el desarrollo de las estructuras del segmento anterior, incluyendo el iris (Beebe, 1986; Davis-Silberman & Ashery-Padan). Por ejemplo si se retira el lente, se impide el desarrollo del iris, cuerpo ciliar y cornea (Beebe & Coast, 2000).

En los salmones existe una zona proliferativa germinativa formada por celulas con morfologia fusiforme, que corresponde a un remanente del neuroepitelio embrionario (Pellon et al., 2015). Esto es similar a lo descrito en la retina adulta donde Stenkamp & Frey (2003) describe que se generan nuevas celulas a partir de dos poblaciones de retinoblastos, la zona periferica germinal (ZPG) y el linaje de los progenitores de bastones. Desde la ZPG se forman todos los tipos celulares retinianos excepto los bastones (Otteson & Hitchcock, 2003).

A los 17 dpc aun no esta constituido el estroma del iris, su formacion es lenta y tardia, incluso continua en el periodo postnatal. Esto se relaciona con la caracteristica fenotipica con las cuales nace el raton, ya que ellos nacen con los ojos cerrados y solo los abren a los 5 dias postnatales (Boatright et al., 2015).

CONCLUSIONES

En el periodo fetal tardio se observa la inmunotincion positiva de Sonic hedgehog (Shh) en el lente, en el primer segmento de la capa interna del esbozo del iris y en la capa ganglionar de la retina. La expresion de este morfogeno a los 17 dpc se relaciona con la diferenciacion tardia del iris y con los ojos cerrados de las crias al nacimiento.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Ashery-Padan, R.; Marquardt, T.; Zhou, X. & Gruss, P. Pax6 activity in the lens primordium is required for lens formation and for correct placement of a single retina in the eye. Genes Dev., 14(21):2701-11, 2000.

Beebe, D. C. & Coats, J. M. The lens organizes the anterior segment: specification of neural crest cell differentiation in the avian eye. Dev. Biol, 220(2):424-31, 2000.

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Boatright, J. H.; Dalal, N.; Chrenek, M. A.; Gardner, C.; Ziesel, A.; Jiang, Y.; Grossniklaus, H. E. & Nickerson, J. M. Methodologies for analysis of patterning in the mouse RPE sheet. Mol. Vis, 21:40-60, 2015.

Cvekl, A. & Tamm, E. R. Anterior eye development and ocular mesenchyme: new insights from mouse models and human diseases. Bioessays, 26(4):374-86, 2004.

Davis-Silberman, N. & Ashery-Padan, R. Iris development in vertebrates; genetic and molecular considerations. Brain Res., 1192:17-28, 2008.

Glaser, T.; Jepeal, L.; Edwards, J. G.; Young, S. R.; Favor, J. & Maas, R. L. PAX6 gene dosage effect in a family with congenital cataracts, aniridia, anophthalmia and central nervous system defects. Nat. Genet., 7(4):463-71, 1994.

Levine, E. M.; Roelink, H.; Turner, J. & Reh, T. A. Sonic hedgehog promotes rod photoreceptor differentiation in mammalian retinal cells in vitro. J. Neurosci, 17(16):6277-88, 1997.

Otteson, D. C. & Hitchcock, P. F. Stem cells in the teleost retina: persistent neurogenesis and injury-induced regeneration. Vision Res., 43(8):92736, 2003.

Pellon, M.; Rojas, M.; Yaikin, P. & del Sol, M. Morphological study of the retina of salmon (Salmo salar). Int. J. Morphol., 33(2):788-93, 2015.

Perron, M.; Boy, S.; Amato, M. A.; Viczian, A.; Koebernick, K.; Pieler, T. & Harris, W. A. A novel function for Hedgehog signalling in retinal pigment epithelium differentiation. Development, 130(8):1565-77, 2003.

Reza, H. M. & Yasuda, K. Lens differentiation and crystallin regulation: a chick model. Int. J. Dev.. Biol, 48(8-9):805-17, 2004.

Rimkus, T. K.; Carpenter, R. L.; Qasem, S.; Chan, M. & Lo, H. W. Targeting the sonic hedgehog signaling pathway: review of smoothened and GLI inhibitors. Cancers (Basel), 8(2):E22, 2016.

Rojas, M.; Saint-Pierre, G.; Hartley, R.; Vasquez, B.; Conei, D. & del Sol, M. Immunolocalization of morphogen sonic hedgehog in salmon fry (Salmo salar). Int. J. Morphol., 34(2):770-4, 2016.

Stenkamp, D. L. & Frey, R. A. Extraretinal and retinal hedgehog signaling sequentially regulate retinal differentiation in zebrafish. Dev. Biol., 258(2):349-63, 2003.

Sukhikh, G. T.; Panova, I. G.; Smirnova, Y. A.; Milyushina, L. A.; Firsova, N. V; Markitantova, Y. V; Poltavtseva, R. A. & Zinov'eva, R. D. Expression of transforming growth factor-b2in vitreous body and adjacent tissues during prenatal development of human eye. Bull. Exp. Biol. Med, 150(1):117-21, 2010.

Tabata, T. & Takei, Y. Morphogens, their identification and regulation. Development, 131(4):703-12, 2004.

Wallace, V. A. Proliferative and cell fate effects of Hedgehog signaling in the vertebrate retina. Brain Res., 1192:61-75, 2008.

Zhang, X. M. & Yang, X. J. Regulation of retinal ganglion cell production by Sonic hedgehog. Development, 128(6):943-57, 2001.

Direccion de correspondencia:

Dra. Mariana Rojas R.

Laboratorio de Embriologia Comparada

Programa de Anatomia y Biologia del Desarrollo

Facultad de Medicina, ICBM

Universidad de Chile

Santiago--Chile

Email: dramrojas@hotmail.com--mrojasr@u.uchile.cl

Recibido : 10-10-2018

Aceptado: 31-12-2018

Mario Pellon (1), Daniel Conei (2,3,4); Gustavo Saint-Pierre (2); Carolina Smok (2,5); Viviana Donoso (2); Mariano del Sol (3) & Mariana Rojas (2)

(1) Departamento de Morfologia, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile.

(2) Laboratorio de Embriologia Comparada, Programa de Anatomia y Biologia del Desarrollo, Instituto de Ciencias Biomedicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile.

(3) Programa de Doctorado en Ciencias Morfologicas, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile.

(4) Departamento de Ciencias Morfologicas, Facultad de Medicina y Ciencia, Universidad San Sebastian, Puerto Montt, Chile.

(5) Instituto de Investigacion e Innovacion en Salud, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Central, Santiago, Chile.

Caption: Fig. 1. A. Bulbo ocular de 12 dias post-coital. Barra 50 [micro]m. B. Capa interna (CRI) y externa de la retina (CRE), cristalino (C). C. Iris (IR) en desarrollo. D. Capa central de la retina (CNR) y epitelio pigmentario de la retina (EPR) en desarrollo. Barra 20 | m.

Caption: Fig. 2. A. Bulbo ocular de 14,5 dias post-coital. Barra 200 [micro]m. B. Capa neural de la retina (CNR) en su porcion central. C. Capa neural de la retina (CNR), epitelio interno del iris (IRI), epitelio externo del iris (IRE), epitelio pigmentario de la retina (EPR) en su porcion periferica. D. Flechas indican epitelio pigmentario de la retina.Barra 50 [micro]m.

Caption: Fig. 3. A. Bulbo ocular a los 17 dias post-coital. Barra 200 mm. B. Inmunotincion con anticuerpo anti-Shh. Flecha blanca indica capa interna del iris inmunopositiva y fecha roja indica capa externa del iris negativa a Shh. C. Capa neural de la retina (CNR), cristalino (C), epitelio interno del iris (IRI), epitelio externo del iris (IRE). D. Capa neural del aretina (CNR), flechas indican epitelio pigmentario de la retina.
Tabla I. Longitud de las capas del iris y retina a los
12, 14,5 y 17 dias post-coital.

Capa                                 12 dpc

Capa interna del iris                  --
(pm)

Capa externa del iris                  --
([micro]m)

Capa nerviosa de la         67,326[+ or -]3,264 (b)
retina (central)
([micro]m)

Capa nerviosa de la         36,069[+ or -] 1,936 (c)
retina (periferica)
([micro]m)

Capa pigmentaria de la         9,562[+ or -]1,528
retina (central)
([micro]m)

Capa pigmentaria de la        13,457[+ or -]2,469d
retina (periferica)
([micro]m)

Capa                                14,5 dpc

Capa interna del iris         25,502[+ or -]2,501
(pm)

Capa externa del iris       13,097[+ or -]1,977 (a)
([micro]m)

Capa nerviosa de la         222,929[+ or -]22,213 (b)
retina (central)
([micro]m)

Capa nerviosa de la          65,173[+ or -]5,87 (c)
retina (periferica)
([micro]m)

Capa pigmentaria de la        12,286[+ or -]1,719
retina (central)
([micro]m)

Capa pigmentaria de la      26,045[+ or -]4,231 d (e)
retina (periferica)
([micro]m)

Capa                                17 dpc

Capa interna del iris        18,725[+ or -]3,324
(pm)

Capa externa del iris        34,623[+ or -]3,178a
([micro]m)

Capa nerviosa de la         160,357[+ or -]11,978b
retina (central)
([micro]m)

Capa nerviosa de la         102,111[+ or -]5,789c
retina (periferica)
([micro]m)

Capa pigmentaria de la        7,756[+ or -]0,951
retina (central)
([micro]m)

Capa pigmentaria de la       12,911[+ or -]1,539e
retina (periferica)
([micro]m)

dpc: dias post-coital; (a) diferencias entre los 14,5 y 17 dpc con
valor p <0,001; (b) y (c) diferencias entre todos los grupos con
valor p <0,001; (d) diferencias entre 12 y 14,5 dpc con valor p
<0,005 y (e) diferencias entre 14,5 y 17 dpc con valor p <0,001.
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Author:Pellon, Mario; Conei, Daniel; Saint-Pierre, Gustavo; Smok, Carolina; Donoso, Viviana; del Sol, Maria
Publication:International Journal of Morphology
Date:Mar 1, 2019
Words:3235
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