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Elaboracion de un biodiente: enfoque actual y desafios.

Making a Bio-tooth: Current Approaches and Challenges

INTRODUCCION

La perdida de dientes es la insuficiencia de organos mas comun, pues se estima que aproximadamente 158 millones de personas en todo el mundo la padecen (1), por lo tanto el edentulismo constituye un problema de salud relacionado con la aparicion de enfermedades sistemicas al haber un deterioro de la funcion masticatoria (2), lo que ocasiona alteraciones foneticas y esteticas, aspectos importantes para las interrelaciones sociales del individuo (1).

Actualmente, se siguen empleando procedimientos clinicos tradicionales para sustituir las estructuras dentarias, como protesis fijas, removibles e implantes, los cuales utilizan materiales sinteticos o artificiales, disimiles a los dientes naturales en cuanto a las propiedades biologicas, fisicas y mecanicas, pues no restauran integramente las funciones fisiologicas y en muchas ocasiones son incomodos para el paciente (1-5). Aunque los implantes dentales de titanio gozan de amplio uso en la actualidad, poseen las inherentes desventajas mencionadas, ademas de que varios pacientes tienen problemas con ellos durante o despues de su colocacion, como perimplantitis, perdida osea, recesion gingival e incluso eventual perdida del implante (6,7). Es por estos inconvenientes que se ha planteado un enfoque mucho mas biologico para reemplazar las estructuras dentarias danadas o perdidas, empleando dientes elaborados con tecnicas de bioingenieria, tambien llamados biodientes (4,5).

La formacion de un diente es muy compleja y requiere la interaccion reciproca y bien organizada entre el epitelio y el mesenquima, que deben tener la capacidad de proporcionar senales moleculares inductivas el uno al otro. Por lo tanto, es imperativo que se reproduzcan estos eventos para la generacion in vitro de un diente entero de bioingenieria (4,5,8,9).

Aunque se dispone en la literatura de informacion acerca de los metodos de bioingenieria de tejidos empleados para crear un biodiente, existe carencia de evidencia condensada y actual, esto es, que reuna todos los acercamientos o enfoques empleados, particularmente en el idioma espanol. Es por ello que la presente revision aportara actualizando el estado del arte en el campo de la consecucion de un biodiente mediante bioingenieria de tejidos.

El objetivo de esta revision integrativa es describir los requisitos basicos para la obtencion de un biodiente, identificar y contrastar los enfoques o tecnicas disponibles para la obtencion de este, asi como describir sus desafios y perspectivas futuras, para asi aportar con fundamentos y conceptos para el desarrollo de futuras investigaciones que aporten con innovacion en el campo de generacion de un biodiente completo, y en general de la bioingenieria de tejidos dentales.

MATERIALES Y METODOS

El presente estudio es una revision integrativa de la literatura, por lo que se incluyen en la misma estudios de tipo experimental y no experimental, con el fin de abordar diversos aspectos como conceptos, definiciones, metodologias y evidencia cientifica disponible (10). Se realizo una busqueda electronica de articulos cientificos y libros que contengan la informacion requerida, empleando las bases de datos PubMed, Scopus, EBSCO, Science Direct, Wiley Online Library, Lilacs y Google Academico, tanto en idioma ingles como espanol. Los terminos clave de busqueda empleados en combinacion fueron "bioingenieria dental", "ingenieria de tejidos", "regeneracion dental completa", "celulas madre", "biodiente" y "bio-raiz". La estrategia de busqueda fue especifica para cada base de datos. Los terminos relacionados fueron combinados usando los operadores "OR y "AND". Se realizo la busqueda desde enero del 2000 hasta marzo de 2018, excluyendo resultados fuera de este periodo de publicacion. En la mayoria de los casos, los articulos que no tenian un vinculo explicito con los terminos clave de busqueda empleados, fueron eliminados. Luego, los resultados de la busqueda fueron unidos, procediendose a remover duplicados. Despues de la seleccion inicial de titulos y resumenes, se seleccionaron unicamente articulos y libros de mayor relevancia y pertinencia para el tema en revision; los articulos fueron categorizados de acuerdo a las secciones de la presente revision.

Por ultimo, se estudio y analizo el texto completo de los 53 articulos seleccionados, asi como la informacion pertinente de los 10 libros escogidos, con el fin de proveer a los lectores la mas reciente y relevante informacion sobre la elaboracion de un biodiente. Los contenidos a tratar seran abordados en tres grandes apartados: 1) Requisitos para la elaboracion de un biodiente, 2) Enfoques utilizados en la generacion de un biodiente, 3) Desafios y perspectivas futuras en la elaboracion de un biodiente.

RESULTADOS

Requisitos para la elaboracion de un biodiente

El principal objetivo de la medicina regenerativa es desarrollar organos de bioingenieria completamente funcionales para reemplazar organos que se han perdido o danado (11). Los enfoques para construir tejidos emplean una triada basica de componentes: celulas madre, agentes bioactivos y andamios (4,5,12).

Celulas Madre

En los ultimos anos se ha dado enfasis a la investigacion con celulas madre ya que se ha demostrado su enorme potencial para promover la formacion de tejidos como los dentarios (5,13). Poseen habilidades de division continua, ya sea para replicarse a si mismas, lo que se conoce como autorreplicacion o para diferenciarse en celulas especializadas de varios linajes (12,14,15).

Considerando el potencial de diferenciacion, las celulas madre se clasifican en: totipotentes que son celulas embrionarias que pueden convertirse en cualquier tipo de celula del cuerpo; pluripotentes, que a diferencia de las anteriores no producen tejidos extraembionarios como la placenta; multipotentes cuyo potencial de diferenciacion esta mas restringido y constituyen el grupo de celulas madre postnatales (16-18); oligopotentes que pueden diferenciarse en algunos tipos celulares de linaje especifico; unipotentes, las cuales se diferencian unicamente en una clase de celula (18).

Dentro del campo de la medicina regenerativa se ha empleado dos tipos principales de celulas madre, las celulas madre embrionarias (ESC) y celulas madre postnatales, clasificacion que obedece a su origen. La ausencia de ESC en una persona adulta y los problemas eticos concernientes a su uso hacen necesario la utilizacion de celulas madre postnatales de preferencia autologas (obtenidas del propio paciente), sin embargo, deben superarse algunas dificultades inherentes a su aislamiento y diferenciacion limitada, para que sea factible la aplicacion en tecnicas regenerativas (8).

En el contexto de las celulas madre postnatales, es posible aislar estas celulas ya sea de tejidos dentarios o no dentarios; entre las fuentes potenciales de celulas madre mesenquimales de origen no dental se menciona a las celulas madre del tejido adiposo (ASCs) (19-21), las celulas madre de medula osea (BMSCs). Como fuentes dentales de celulas madre mesenquimales tenemos aquellas que provienen de dientes maduros o inmaduros (5,15,22), como las celulas madre que derivan de pulpa dental (DPSCs), celulas madre de dientes deciduos exfoliados (SHEDs), celulas madre del ligamento periodontal (PDLSCs), celulas madre de la papila apical (SCAPs), celulas madre del foliculo dental (DFSCs), celulas madre progenitoras del germen dental (TGPCs), asi como tambien celulas madre provenientes de otros tejidos orales y maxilofaciales, como celulas madre mesenquimales derivadas de encia (GMSCs), celulas madre del hueso orofacial (BMSCs), celulas madre del periostio (PSCs) y celulas madre derivadas de glandulas salivales (SGSCs); diferentes estudios han mostrado que estas celulas poseen gran potencial en la regeneracion de tejidos dentales y periodontales (1,3,22-27). Dentro de la boca existen otras fuentes de celulas madre mesenquimales, como las celulas madre derivadas de mucosa oral (MSCs) y celulas madre del tejido conectivo palatal (MSCs) (22).

No existen fuentes consistentes de celulas madre epiteliales generadoras de esmalte en el humano adulto (14,28) y probablemente este sea el factor limitante mas importante en la elaboracion de un biodiente (15,29,30); sin embargo, actualmente se investiga arduamente estas posibles fuentes celulares. Asi, ciertos tejidos orales postnatales podrian emplearse como fuente de celulas epiteliales, entre los que incluye celulas madre progenitoras del epitelio oral (OESCs); los restos epiteliales de Malassez (ERM) presentes en el ligamento periodontal (PDL) en la vaina epitelial radicular de Hertwig cerca de los extremos de una raiz en formacion; en el epitelio reducido del esmalte (REE) que cubre el esmalte durante la erupcion dental; el epitelio de union (JE) a nivel del cuello dentario; la lamina dental activa (DL) que se encuentra en el area retromolar a los 5 o 6 anos; los restos de la lamina dental del cordon gubernacular (GC), presentes por encima de los dientes en erupcion (9).

El potencial proliferativo y odontogenico de estas celulas epiteliales no se ha explorado del todo todavia y constituyen alternativas prometedoras para aplicarlas en la elaboracion de un diente de bioingenieria (9). Se ha citado que los ERM pueden diferenciarse en celulas similares a ameloblastos cuando se combinan con celulas de papila dental, pudiendo ser una atractiva fuente celular para la regeneracion del esmalte (31).

Tambien se ha demostrado que las celulas de la piel pueden diferenciarse en ameloblastos bajo la induccion del mesenquima. En un estudio en ratas se realizo la recombinacion de celulas epiteliales cutaneas con celulas mesenquimales de la papila dental y tras la implantacion por 14 dias en la capsula renal se observo la formacion de estructuras similares a esmalte y dentina. Se comprobo que las celulas posnatales derivadas de la piel de ratas pueden convertirse en ameloblastos mediante una senalizacion apropiada del mesenquima dada por el factor de crecimiento fibroblastico 8 (FGF8) (32). Pese a que es un estudio realizado en animales, podria dar paso a la investigacion en humanos con celulas cutaneas autologas.

Entre las alternativas mas llamativas para obtencion de celulas madre epiteliales posnatales humanas para la regeneracion de dientes enteros, se ha planteado el uso de queratinocitos aislados de prepucio humano, los mismos que se pueden diferenciar en ameloblastos bajo la induccion del mesenquima de raton, demostrandose el potencial de estas celulas para la generacion in vitro de un biodiente (33).

Por otro lado, es importante citar a las celulas madre pluripotentes inducidas (iPSCs), las cuales son generadas artificialmente a traves de la manipulacion genetica de celulas somaticas y tienen el potencial de convertirse en cualquier tejido, como el dental (1,34). Las iPSCs se pueden obtener a partir de celulas somaticas humanas mediante transduccion retroviral de cuatro factores de transcripcion Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc o Lin28/Nanog/Oct4/Sox2, asi como mediante tecnicas libres de virus o ADN, llamadas no integradoras, basadas en ARNm o en proteinas recombinantes (6,34,35).

Las iPSCs tienen la ventaja de que son celulas autologas, con lo que se evita preocupaciones eticas o de rechazo inmunologico, ademas son bastante accesibles y relativamente de facil procesamiento (34). Su produccion podria proporcionar una fuente ilimitada de celulas para aplicaciones clinicas, dejando atras la ausencia de fuentes celulares, especialmente de las epiteliales (13,29). Entre las desventajas del uso de las iPSCs se incluyen la memoria epigenetica de su fenotipo anterior que limita su potencial de diferenciacion, su naturaleza artificial, la transduccion viral, las mutaciones somaticas, la tumorogenesis y la formacion de teratomas, situaciones que deben ser superadas para su futuro uso clinico seguro (34,36).

Se ha disenado un modelo recombinante (29), donde se usan iPSCs derivadas de celulas de la orina humana que al contacto con mesenquima de raton permite la obtencion in vitro de celulas epiteliales dentales, modelo que luego al ser trasplantado bajo la capsula renal de raton deriva en la formacion de un biodiente (figura 1). Por lo tanto, se puede considerar que la orina no es simplemente un desecho sino mas bien constituye una fuente celular autologa asequible, no invasiva, comoda y que puede aplicarse a cualquier genero, raza o edad; asi, el sedimento de la orina posee celulas diferenciadas (epiteliales renales, uroteliales) y celulas madre (36).

Finalmente, en el contexto de las fuentes disponibles para la obtencion de celulas madre, se debe puntualizar en este apartado que aquellas obtenidas de la orina humana (29,36), al igual que las referidas celulas madre obtenidas de prepucio humano (33), ASCs obtenidas en procedimientos quirurgicos como la liposuccion (21), asi como las celulas madre mesenquimales obtenidas de la pared de quistes periapicales dentales (37) y, celulas obtenidas de germenes dentales de animales de mataderos (38), todas ellas en conjunto estan dentro del concepto moderno de medicina biologica del desecho (del ingles biological waste medicine), mediante el cual se puede obtener tejidos tan diversos como cardiaco, hepatico, oseo, neuronal y dental, a partir de tejidos considerados como "desecho" (39), homologando un proceso de "reciclaje biologico" que inherentemente constituye un metodo de obtencion celular totalmente no invasivo.

Agentes Bioactivos

Todos los procesos biologicos del organismo estan regulados por biomoleculas senalizadoras, tambien llamadas agentes bioactivos, como es el caso de la odontogenesis, cuyas fases estan mediadas por una serie de interacciones entre epitelio y mesenquima, coordinando la migracion, diferenciacion, proliferacion celular, expresion de genes, organizacion de tejidos y morfogenesis (4,5). Entre los agentes bioactivos estan genes especificos, factores de crecimiento y de transcripcion, que en ocasiones inducen el desarrollo y en otras lo inhiben (40,41), actuando de manera muy coordinada en tiempo, lugar y cantidad precisa, a lo que se conoce como regulacion espacio temporal (5). Al momento esta compleja expresion molecular no esta del todo clara, aunque cada vez se entiende mejor, particularmente la participacion genica (5). Entre algunos de los factores de crecimiento estan el factor de crecimiento transformante beta (TGFP), la proteina morfogenetica osea (BMP), el factor de crecimiento fibroblastico (FGF), proteinas de las familias Wnt, Hedgehog (Shh) y Ectodisplasina (Eda) (41).

Para las terapias regenerativas los agentes bioactivos pueden incorporarse a los andamios, liberandose de forma explosiva durante las primeras horas, encapsulados en micro y nanoparticulas cuya liberacion es controlada o, quedar inmovilizados para que se liberen mientras se degrada la matriz. Actualmente se esta desarrollando sistemas de liberacion estimulo-respuesta basados en el pH, temperatura, fuerza ionica, luz o impulsos electricos, con el fin de suministrar los agentes bioactivos al medio (5).

Andamios (scaffolds)

Los andamios son esencialmente armazones de soporte, crean un microambiente odontogenico (24) que facilita la biosintesis, proliferacion y diferenciacion celular (4). Este tipo de materiales deben cumplir ciertos requisitos como biocompatibilidad y biodegradabilidad, porosidad que permita la siembra, colonizacion y migracion celular, la resistencia mecanica para facilitar su manipulacion y la adaptacion al sitio del defecto (4,5).

Los andamios se clasifican en naturales y sinteticos. Entre los naturales se incluye el colageno, el alginato, la fibrina, el quitosano, la gelatina, la seda, el acido hialuronico, los mismos que son biocompatibles y biodegradables (5), pero sin embargo poseen propiedades mecanicas deficientes y podrian desencadenar respuestas inmunes negativas debido a la presencia de posibles impurezas dependiendo de su origen (42). Otra opcion natural creada recientemente con el objetivo de reducir la inflamacion, la reaccion de cuerpo extrano y el potencial de rechazo inmunologico constituye el modelo de andamios descelularizados, en el cual se elimina los componentes celulares de tejidos u organos por medio de procesos quimicos, enzimaticos, o fisicos, conservando la matriz extracelular (ECM). Estos andamios "biomimeticos" permiten la conservacion de la estructura, la biocompatibilidad con el entorno, la estabilidad mecanica y facilitan la difusion de moleculas bioactivas, la interaccion celular, la adhesion y la formacion de ECM, por lo que se sugiere idealmente a esta tecnologia para la generacion de organos de bioingenieria (5,42,43).

Por otro lado, se dispone de andamios sinteticos, con limitaciones inherentes a la biodegradabilidad y biocompatibilidad, como el acido poliglicolico (PGA), el acido polilactico (PLA), el acido poliglicolico poli-L-lactico (PGA-PLLA), el acido poliglicolico polilactico (PLGA), la policaprolactona (PCL). Tambien se han desarrollado materiales inorganicos, tales como la ceramica de hidroxiapatita, las ceramicas de fosfato de calcio y los vidrios bioactivos (1,5,44), e incluso se han disenado andamios en micro y nanoescala, con el fin de replicar los eventos celulares que ocurren en estas escalas (5).

Enfoques utilizados en la generacion de un Biodiente

Muy pocos han sido los estudios que han utilizado celulas humanas en la produccion de dientes enteros de bioingenieria y, aunque la mayoria de estos han tenido resultados exitosos al ser realizados en modelos animales, no obstante inherentemente representan una guia para establecer las estrategias basicas en la generacion de biodientes en humanos para la terapia de reemplazo dental (1).

Los enfoques disponibles actualmente para la elaboracion de un biodiente completo, son: metodos que utilizan andamios, metodos libres de andamios, metodo basado en el empleo de iPSCs, metodo del germen de organos, el modelo de diente quimerico (5,23,45-47) y la estimulacion de la formacion de la tercera denticion (48), los cuales seran descritos a continuacion.

Metodo basado en andamios

En esta tecnica de bioingenieria se emplea andamios, los cuales dan el soporte estructural a las celulas que posteriormente seran sembradas en el mismo. Las celulas epiteliales y mesenquimales son aisladas de brotes dentales postnatales de animales, luego son sembradas sobre andamios biodegradables y a continuacion son trasplantadas a la capsula suprarrenal, al omento o directamente al sitio de la exodoncia para su maduracion in vivo (figura 2A) (49), demostrandose la formacion de estructuras de dientes pequenos con tejidos como esmalte, dentina y pulpa dental (3). La desventaja mas grande de este metodo es la incapacidad de controlar la forma y el tamano de los dientes, asi como la orientacion de los ameloblastos y odontoblastos (49).

Recientemente se ha citado el empleo de andamios dentales descelularizados creados a partir de brotes dentarios porcinos sin erupcionar; luego se resembraron celulas epiteliales dentales porcinas, celulas de pulpa dental humana y celulas endoteliales de vena umbilical humana (proveyendo una red vascular), para luego implantar los constructos en las mandibulas de minicerdos y cultivarlas por 3 o 6 meses. Tras el analisis histologico y con tomografia microcomputarizada (pCT) se observo una produccion significativa de dentina organizada y tejidos similares al esmalte, confirmandose el potencial de este tipo de tecnologias para el estudio de la formacion de biodientes de tamano semejante a los dientes naturales (38).

Metodo libre de andamios

Denominado tambien metodo de agregacion celular, este metodo produce germenes dentales de bioingenieria reconstruidos sin andamios, utilizando a su vez celulas epiteliales y mesenquimales obtenidas de germenes dentarios de modelos animales, a traves de centrifugacion. Las interacciones epitelio-mesenquima se reproducen correctamente por la capacidad de los agregados celulares de autorreorganizarse, lo que permite obtener biodientes, pero no obstante suele ser dificil controlar su desarrollo y formacion tisular (figura 2B) (3,47).

Un metodo libre de andamios es la tecnica de gotas colgantes, de reciente introduccion, la cual permite el cultivo de esferoides multicelulares en un medio liquido en 3D (GravityPLUS[TM]). Los molares inferiores del raton de dia embrionario 14 (ED 14) se disociaron en celulas individuales epiteliales y mesenquimales, luego se sembraron en una placa de cultivo liquido que favorecio las migraciones celulares y al cabo de 3 dias se formaron esferoides bien organizadas dentro ellas. Despues de la implantacion bajo la piel de ratones adultos por 2 semanas, se desarrollaron dientes vascularizados que tenian una corona bien formada, con esmalte, dentina y la iniciacion de la formacion radicular. Finalmente, y para propiciar la inervacion del mesenquima dental, incluyendo la capa odontoblastica, se realizo un coimplante en el ganglio del trigemino. Este modelo puede reproducir las interacciones epitelio mesenquima que permiten un desarrollo optimo de los dientes y una ventaja es el pequeno numero de celulas que se requiere (50).

Metodo basado en el empleo de iPSCs

Este constituye un metodo libre de andamios que utiliza unicamente iPSCs y es un modelo planteado en humanos, donde se induciria a las celulas somaticas (dentales o no dentales) para formar iPSCs, las cuales a su vez permitirian obtener tanto celulas madre epiteliales como mesenquimales con potencial odontogenico, que luego se recombinarian y en conjunto pasarian a cultivarse in vitro hasta la etapa de casquete y a continuacion serian trasplantados los germenes dentales a los sitios edentulos de los maxilares, para el reemplazo con dientes funcionales (figura 3) (6,8,13,35). Este metodo tendria las ventajas antes ya referidas respecto a las iPSCs.

Metodo del germen de organos

Es un enfoque de manipulacion celular tridimensional in vitro que replica el proceso de odontogenesis, pues ocurre una compartimentacion de las celulas epiteliales y mesenquimales dentro de un gel de colageno de alta densidad, reproduciendo el montaje multicelular y las interacciones epitelio-mesenquima para desarrollar biodientes (51).

Con este modelo se puede obtener inicialmente germenes dentales que luego son trasplantados a una area edentula de raton (3), se consigue controlar exitosamente el tamano del diente de bioingenieria, asi como regular el ancho de la corona mediante el control de la zona de contacto entre el epitelio y las capas de celulas mesenquimales. Esta tecnica ha permitido obtener incisivos (51) y molares de raton (52).

En este metodo se inyectan celulas mesenquimaticas (aisladas de un germen molar de raton) disociadas en el centro de una gota de colageno de alta densidad. Se procede luego a la inyeccion de las celulas epiteliales derivadas del germen dental de un molar de raton en una gota adyacente al agregado celular mesenquimal. Luego de un dia de cultivo se observa la formacion de un germen dental de bioingenieria con adecuada compartimentacion entre las celulas epiteliales y mesenquimales y compactacion celula a celula, el cual se desarrolla in vitro durante 14 dias. Luego se realiza el trasplante de este germen dental bajo la capsula renal por 30 dias (figura 4A) (51,52).

Al cabo de este periodo se obtiene un biodiente maduro, con todos los componentes estructurales como esmalte, dentina, PDL y hueso alveolar bien formados (figura 4A). De la misma manera se puede obtener conjuntos de multiples unidades de biodientes, rodeados de hueso alveolar, que pueden ser trasplantados para reparar grandes zonas edentulas de los maxilares (figura 4B). Cabe destacar que los biodientes obtenidos mediante este metodo se injertaron en un ambiente adulto mediante union osea, esto es, a traves de integracion osea del hueso del biodiente con el hueso maxilar. El biodiente alcanzo el plano oclusal en 49 dias, realizando funcion masticatoria normal con el diente antagonista natural (52). Ademas, se observo la presencia de vasos sanguineos y fibras nerviosas sensoriales y simpaticas, tanto en pulpa como PDL (51,52).

Es importante destacar que los biodientes obtenidos fueron sometidos a tratamiento de ortodoncia y expuestos a trauma por exposicion pulpar, ante los cuales la respuesta neural fue completamente normal. Por otro lado, a estos biodientes se les aplico pruebas de dureza de Knoop, dando como resultado valores similares al diente natural (52).

Recientemente se ha desarrollado un nuevo enfoque denominado modelo biomimetico del germen dental, en el cual empleando celulas dentales porcinas postnatales epiteliales y mesenquimales, celulas endoteliales de venas umbilicales humanas, asi como hidrogel de gelatina metacrilato como andamio, se obtuvo in vitro germenes dentales bien conformados, los cuales fueron luego implantados de manera subcutanea en ratas inmunodeprimidas. Estos "constructos biomimeticos de germenes dentales en 3D", como lo denominan los autores, tenian todos los tejidos dentales y, fueron estudiados mediante imagenes de volumen de fuerzas, empleando el microscopio de fuerza atomica (AFM), con el fin de analizar los modulos de elasticidad de los tejidos dentales obtenidos, los cuales fueron similares a los del germen dental natural. Ademas, se monitoreo en 3D la morfologia celular, actividad metabolica y formacion de redes vasculares; estas redes a futuro permitirian la integracion y crecimiento in vivo del germen dental despues de su trasplante al nicho oseo en humanos, como lo predicen los autores (7).

Diente quimerico o recombinante

El termino quimera segun la mitologia griega describe a un monstruo hibrido con cuerpo de cabra, cola de serpiente o dragon y cabeza de leon, que escupia fuego y aterrorizaba a la gente; sin embargo en la ciencia medica, una quimera es un organismo o un organo que contiene poblaciones celulares procedentes de individuos geneticamente distintos, bien sean de la misma especie o de otra diferente (28).

Las investigaciones en quimeras se estan enfocando en el campo del trasplante de organos como corazon, higado, rinon, piel y dientes. Con el fin de disenar un biodiente quimerico DPSCs adultas humanas se han recombinado con celulas epiteliales dentales de otras especies como minicerdos y ratones, obteniendose buenos resultados (28).

En un estudio, se diferenciaron iPSCs derivadas de la orina humana en celulas epiteliales dentales y, se recombinaron luego con el mesenquima de un molar de raton. Tras 3 semanas de cultivo bajo la capsula renal de ratones se observo la formacion de un diente quimerico con propiedades fisicas tales como el modulo de elasticidad y dureza similares a las del diente humano (figura 5); se comprobo el potencial de las iPSCs derivadas de la orina para dar origen a ameloblastos secretores de esmalte (29). Por otro lado, en un estudio aislaron y cultivaron queratinocitos obtenidos del prepucio humano, luego se recombinaron con el mesenquima dental aislado de un germen dental de raton, en presencia de FGF8 exogeno y se observo la diferenciacion en ameloblastos formadores de esmalte (33). Otros dos estudios tambien emplearon el modelo quimerico, los cuales ya fueron descritos anteriormente (29,38).

De la misma manera se creo dientes quimericos derivados de celulas madre homologas de diferentes individuos de la misma especie, donde se aislaron DPSCs de incisivos y BMSSCs de la medula osea y se recombinaron con las celulas del brote apical (ABC) de un germen de incisivo postnatal. Los conjuntos DPSC-ABC y BMSSC-ABC fueron incubados por 14 dias in vivo y se formaron quimeras con estructuras dentarias tipicas, pero en el grupo BMSSC-ABC no se llevo a cabo la formacion de esmalte (53). Se requieren de investigaciones adicionales en este campo para la su futura aplicacion clinica.

Metodo de estimulacion de la tercera denticion

El termino "tercera denticion" se refiere a un conjunto de dientes adicionales que pueden formarse ademas de los permanentes, es decir uno o mas dientes supernumerarios. Durante la odontogenesis el numero de dientes esta estrictamente determinado, por lo que la manipulacion de las vias moleculares puede inducir la formacion de una tercera denticion (48,54,55), cuyo rudimento se ha evidenciado en humanos (48).

La senalizacion Wnt esta relacionada con la formacion supernumeraria ya que interviene en el mantenimiento o la reactivacion de la lamina dental (48) y se ha identificado que mutaciones en el gen Runx2 ocasionan la formacion de dientes supernumerarios (54,55), lo que podria constituir una via para la induccion de formacion de una tercera denticion mediante terapia genica. Por otro lado, en un modelo de raton se ha demostrado que la inhibicion de la senalizacion de BMP, modulada por Wnt, permite la formacion de dientes supernumerarios en cultivos de incisivo. El gen 1 asociado a sensibilizacion uterina (USAG-1) controla la senalizacion de BMP y de Wnt; se ha informado que este gen es deficiente en ratones que tienen dientes supernumerarios, por lo que su represion in situ o activacion podria ser una alternativa posible para inducir formacion de nuevos dientes (48).

La terapia genica podria ser el medio ideal para suministrar moleculas de senalizacion, previamente identificadas en tiempo y espacio, que estimulen la formacion de una tercera denticion y la regeneracion de dientes manipulados con genes (28,48). Con el fin de promover un efecto biologico especifico se realiza la terapia genica (activacion o represion), que consiste en la insercion de genes en las celulas de un individuo directamente en el sitio diana (in vivo), como ocurriria en el caso de la estimulacion de una tercera denticion en humanos (figura 6), o indirectamente sobre celulas seleccionadas, cosechadas, expandidas, transducidas geneticamente (ex vivo), y luego reimplantarlas (48).

Hasta ahora, el suministro de genes in vivo parece ser viable para la regeneracion de un diente mediante estimulacion de la tercera denticion, con lo que se induciria nuevamente el proceso de denticion en la boca de la persona (48); sin embargo este enfoque ha sido cuestionado por posibles afectaciones sistemicas a la salud del individuo (28,55).

Bio-raices

El termino "bio-raiz" se refiere a una raiz creada por bioingenieria, que puede estar perfectamente integrada con los tejidos periodontales y el hueso alveolar, sobre la cual sea posible colocar una corona (3,15). La elaboracion de una bio-raiz, pese a que no constituye un biodiente completo, podria ser una opcion que solucione el problema de la regeneracion del esmalte, ya que permitiria que una corona sintetica sea soportada por una raiz de bioingenieria, considerando ademas que con los metodos protesicos actuales se puede reproducir perfectamente tamano, forma y color de una corona natural (27,30).

En un estudio reciente, se obtuvo bio-raices en un modelo de minicerdo, mediante un sistema de cultivo 3D de celulas PDLSCs, DPSCs y de un injerto de (HA/TCP)/DPSC. Estas bio-raices fueron rehabilitadas con coronas y postes 6 meses despues de la implantacion inicial y fueron comparadas in vivo con implantes de titanio igualmente rehabilitados, que fueron colocados en el mismo animal. Los estudios histologicos, radiograficos, biomecanicos y de microscopio electronico de barrido, evidenciaron que la fuerza compresiva, modulo de elasticidad y fuerza torsional fueron muy similares a las del diente natural nativo; sin embargo, el implante de titanio mostro propiedades biomecanicas significativamente mayores que la bio-raiz, lo que pudo haber influido en la tasa de exito del 100 % y 22 %, respectivamente. Aunque resulta un modelo prometedor, la bio-raiz necesita mas investigacion antes de su aplicacion clinica (56).

Desafios y perspectivas futuras en la elaboracion de un biodiente

Las limitadas fuentes de celulas madre epiteliales postnatales que generen esmalte constituye uno de los mayores desafios, debido a que son dificiles de encontrar en ambientes adultos (29,30,46). Sin embargo se estan haciendo muchos adelantos al respecto y se proyecta el uso de algunos tejidos dentales o no dentales, los mismos que fueron descritos anteriormente, e inclusive de fuentes celulares de otras especies como posibles donantes (13,28,47).

El control exacto de la forma y el tamano del biodiente se vuelve dificil tomando en cuenta que el diente debe tener una oclusion y funcion masticatoria normal y que las morfologias de todos los grupos dentarios son complejas de reproducir con bioingenieria (28). Tambien, sera un reto replicar con el biodiente las caracteristicas mecanicas y de anisotropia del diente nativo perdido (5).

El conocimiento de la regulacion molecular de los agentes bioactivos de senalizacion y de los genes involucrados en el desarrollo de un diente, al momento no esta del todo dilucidado, pero si se llega a comprender y controlar este aspecto espacio temporalmente y cuantitativamente, ello facilitaria de manera significativa la recreacion de todos los eventos de la odontogenesis y la consecucion de un biodiente (5,27,28).

El rechazo inmunologico al biodiente trasplantado generalmente es causado por un grupo de antigenos conocido como el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), que reaccionan ante la presencia de tejidos injertados no identicos a los de la persona, destruyendolos rapidamente. De ahi que es importante que los tejidos de bioingenieria se realicen con celulas autologas (13,28).

El crecimiento del biodiente en los maxilares se considera un limitante debido a la dificultad de imitar las condiciones locales. Basicamente, los tejidos dentarios de bioingenieria se pueden incubar in vitro, in situ (ortotopicamente) y, heterotopicamente, es decir en habitats temporales para su crecimiento, como el ectodermo embrionario de pollo, el area subcutanea, el epiplon (omento), mesenterio, la capsula renal, o la camara anterior del ojo en cerdos o ratas; sin embargo, estos sitios no reproducen exactamente el escenario de los maxilares (28,47).

La erupcion del biodiente en los maxilares tambien es dificil de replicar, ya que la erupcion dental es un proceso gobernado por el foliculo dental y el organo del esmalte. Asi mismo, conseguir que el biodiente llegue a una posicion oclusal correcta es uno de los retos mas importantes en los que se debe trabajar en humanos (28,46).

Conseguir una adecuada vascularizacion es uno de los grandes desafios asociados a la consecucion de un diente de bioingenieria tanto en modelos in vitro como in vivo, sobre lo cual se debe seguir trabajando (5,47), aunque los avances en este sentido han sido satisfactorios con algunos modelos de bioingenieria dental (7,38,50,57).

Obtener una optima inervacion del biodiente es otro reto a conseguir, lo cual ha sido ya evidenciado con el modelo de germen de organos (3), asi como en estudios de membrana de policaprolactona funcionalizada con factor de crecimiento neural (57,58). Esta inervacion del biodiente permitiria la percepcion neuronal ante estimulos nocivos y fisiologicos (51).

Aunque el proceso de implantacion y erupcion de los biodientes toma pocas semanas en modelos animales como el raton, hay que considerar que el proceso de desarrollo dental en humanos toma varios anos. De ahi que otro importante desafio sera conseguir acelerar este proceso para poder lograr su aplicacion clinica en tiempos "aceptables" (6,27).

Las iPSCs se proyectan como fuente promisoria de obtencion tanto de celulas epiteliales como mesenquimales para la terapia dental regenerativa, incluyendo el biodiente (13,34,35,46), aunque quedan por superarse muchos aspectos relacionados con su seguridad, eficacia y costo (6). Asi mismo, el modelo de germen de organos parece prometedor para la consecucion del biodiente en humanos (3,46,52,59).

Una vez que se pruebe su exito en humanos, el biodiente debera aun superar obstaculos inherentes a su complejidad para avanzar hacia su produccion a escala comercial, mediante biorreactores por ejemplo (los cuales permiten alcanzar y mantener condiciones ambientales especificas), y asi llegar a su aplicacion clinica, asegurando que los pacientes se beneficien de los avances cientificos (35). En este contexto, se podria pensar que en un futuro los bancos de celulas alogenicas permitiran acceder a la bioingenieria dental a un costo de fabricacion significativamente mas bajo que la produccion de celulas autologas (27,35).

Un metodo promisorio en rapida evolucion es el modelo de impresion en 3D para generacion de andamios, en la cual se deposita capa por capa el material hasta obtener el tamano y forma deseados (1,44). Aunque este metodo permite conseguir replicas espaciales unicas e incluso posicionamiento celular, todavia tiene retos que superar como su elevado costo, incrementar la resolucion y velocidad de impresion en 3D (60,61).

DISCUSION

La presente revision integrativa de la literatura permitio identificar y describir los diversos enfoques con los que se dispone actualmente para la elaboracion de un diente completo de bioingenieria. Se podria considerar que la identificacion de las celulas madre en pulpa dental humana en el ano 2000 (25), marco el inicio de una serie de estudios dedicados a la bioingenieria de tejidos dentales, algunos de los cuales han sido justamente incluidos en la presente revision y, han ido introduciendo tecnicas cada vez mas complejas, pero que no obstante estan precisamente encaminando las investigaciones hacia a la consecucion final de un biodiente integrado a la boca de un ser humano.

De todos los enfoques antes referidos, al parecer uno de los metodos mas promisorios es el basado en iPSCs, especialmente si se considera que con el se pueden emplear celulas autologas y/o celulas consideradas como "desecho biologico", en tanto que el enfoque de estimulacion de la tercera denticion podria ser el que mas desafios y retos tiene que superar, no obstante, inherentemente todos los enfoques tienen dificultades tecnicas y eticas que deben ser aun solventadas.

En el contexto de busqueda de evidencia para la elaboracion de la presente revision, llama la atencion que en la literatura en espanol existe una carencia de estudios experimentales para la elaboracion de un biodiente, lo cual podria obedecer a las dificultades tecnicas y economicas presentes en Latinoamerica. Uno de los estudios que se puede mencionar es uno realizado con ratas Lewis, con el que se obtuvieron constructos tridimensionales de tejidos semejantes a dientes (62).

Es importante destacar que en el ano el 2006 un equipo de cientificos expertos en el tema se congrego con la vision de idear un plan para la creacion de un biodiente, que crezca independientemente in vivo en un adulto humano. Plantearon que este objetivo podria ser conseguido en un periodo de diez anos, es decir para el ano 2017 (63). Probablemente los desafios antes mencionados son bastante dificiles de superar por completo, por lo que al momento todavia no se ha podido cumplir con aquel reto, pero es increible el avance que la ciencia ha tenido al respecto, por lo que no deberia sorprendernos que se superen estos desafios y que en las proximas generaciones de la Odontologia ya se cuente con dientes de bioingenieria totalmente funcionales e integrados en un entorno oral adulto y con esto reemplazar de forma natural estructuras dentarias perdidas o ausentes.

CONCLUSIONES

El reemplazo biologico de los dientes perdidos por dientes formados por bioingenieria de tejidos permitiria superar las deficiencias de los actuales tratamientos de reemplazo o sustitucion de dientes naturales, como los implantes de titanio de difundido uso en la actualidad. La elaboracion de bio-raices y su posterior rehabilitacion con coronas, es tal vez a un futuro mediato una alternativa mas factible que la elaboracion de un diente entero de bioingenieria, que tiene que superar mayores dificultades en su ejecucion.

Finalmente, pese a los retos y desafios existentes al momento en la elaboracion de un diente de bioingenieria, la ciencia ha tenido grandes progresos en los ultimos anos, que hacen cada vez mas real la posibilidad de la ejecucion de un biodiente humano, completo, funcional y totalmente integrado a los tejidos circundantes. Este concepto representaria la base para las proximas generaciones de la Odontologia, relegando a varias de las terapeuticas tradicionales usadas durante decadas para el mantenimiento o reemplazo dental.

RECOMENDACIONES

Se debe seguir explorando la identificacion de celulas madre epiteliales y mesenquimales que puedan ser mantenidas y expandidas en cultivos in vitro, con el fin de proveer suficientes fuentes para la elaboracion de dientes de bioingenieria.

La comprension de la senalizacion biomolecular y expresion genica facilitaria en gran medida la reproduccion de todos los eventos de la odontogenesis, para conseguir la formacion de tejidos y organos dentarios enteros de bioingenieria. Este conocimiento podria ademas ir mejorando o complementando las diferentes tecnicas disponibles, por lo que se recomienda se realicen estudios en esta tematica.

A pesar de los avances de la terapia genica in vivo, que podria enriquecer las tecnicas de bioingenieria dental e incluso estimular la formacion de una tercera denticion, se requiere mas investigaciones al respecto.

El desarrollo de biomateriales de andamio optimos para modular adecuadamente el proceso de la odontogenesis es esencial en el campo de la medicina regenerativa, siendo una opcion atractiva ampliar las investigaciones respecto a los andamios descelularizados por sus caracteristicas superiores en relacion a los otros andamios. Ademas, el diseno de andamios en micro y nanoescala es prometedor y requiere estudios adicionales.

Es necesario que se realicen estudios adicionales en modelos animales y de esta manera dar el paso a la realizacion de ensayos clinicos en humanos, en los que se utilice celulas autologas o alogenicas, o incluso dar paso al empleo clinico del diente quimerico.

Una vez que se solventen las desventajas concernientes al uso de las iPSCs, estas celulas podrian ser idoneas para la elaboracion de un biodiente, ante la carencia de ESC en personas adultas y considerando todas las ventajas y caracteristicas de las iPSCs.

Incentivar la ejecucion de estudios de bioingenieria de tejidos basados en el concepto de "medicina del desecho", sobre todo considerando el hecho de que esta representa una fuente celular muy asequible y que se desperdicia a diario.

doi: https://doi.org/10.11144/Javeriana.uo37-79.ebea

Fecha de recepcion: 16-04-2018 | Fecha de aceptacion: 17-11-2018

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Ruth Viviana Intriago Morales

Universidad de Cuenca. Cuenca, Ecuador. vivianaintriago 83@hotmail.com.

https://orcid.org/0000-0002-4396-5617

Jose Luis Alvarez VASQUEZ (a)

Universidad de Cuenca. Cuenca, Ecuador. jose.alvarezv@ucuenca.edu.ec. https://orcid.org/00000003-0381-2402

* Investigacion original, revision integrativa de la literatura.

(a) orrespondencia: jose.alvarezv@ucuenca.edu.ec

Leyenda: FIGURA 1 Biodientes formados en 3 semanas bajo la capsula renal de raton: A) a partir de celulas epiteliales y mesenquima de raton y, B) a partir de celulas iPSCs obtenidas de orina humana y, mesenquima de raton. En las dos columnas de la derecha se observan imagenes de los biodientes mediante microscopio de contraste de fase (MCF), fuera y bajo la capsula renal. En las tres columnas de la izquierda se presentan cortes histologicos con tincion de hematoxilinaeosina (HE) y de inmunohistoquimica (IHC): pulpa dental (dp), dentina (d), espacio del esmalte (es), Amel (ameloblastina); en el recuadro azul de observan los ameloblastos

Leyenda: FIGURA 2 REPRESENTACION ESQUEMATICA A. METODO BASADO EN ANDAMIOS, B. METODO DE AGREGACION CELULAR.

Leyenda: FIGURA 3 REPRESENTACION ESQUEMATICA DEL METODO BASADO EN EL EMPLEO DE IPSCS

Leyenda: FIGURA 4 REPRESENTACION ESQUEMATICA DEL METODO DE GERMEN DE ORGANOS

Leyenda: FIGURA 5 REPRESENTACION ESQUEMATICA DEL DIENTE QUIMERICO

Leyenda: FIGURA 6 REPRESENTACION ESQUEMATICA DEL METODO DE ESTIMULACION DE LA TERCERA DENTICION.
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Author:Intriago Morales, Ruth Viviana; Alvarez Vasquez, Jose Luis
Publication:Universitas Odontologica
Date:Jul 1, 2018
Words:9423
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