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El viroide de la mancha del sol (ASBVd) es persistente en cultivos nucelares de aguacate (Persea americana Mill).

Avocado sunblotch viroid (ASBVd) is persistent in nucellar cultures (Persea americana Mill.)

RESUMEN

Con el objetivo de determinar la posibilidad de obtener tejidos sanos a partir de plantas infectadas con ASBVd como una estrategia para recuperar clones de alto valor agronomico, cultivos embriogenicos de aguacate fueron inducidos a partir del nucelo de tres cultivares de aguacate infectados con el viroide de la mancha del sol (ASBVd) en un medio de cultivo con las sales mayores B5, suplementado con las sales menores de Murashige y Skoog (MS) y 0.41 [micron]M de picloram, y (en mg/[L.sup.-1]) tiamina HCl (0.4), mio-inositol (100), sucrosa (30,000) y TC agar (8,000). Los cultivos embriogenicos inducidos fueron mantenidos en medio semisolido MS suplementado con 0.41 [micron]M de picloram y (en mg/[L.sup.-1]) tiamina HCl (0.4), mio-inositol (100), sucrosa (45,000) y TC agar (8,000) y en medio liquido MS modificado con 15 mM N[H.sub.]4N[O.sub.3] y 30 mM KN[O.sub.3], sales menores de MS, picloram 0.41 [micron]M y (en mg/[L.sup.-1]) tiamina HCl (0.4), mio-inositol (100) y sucrosa (45,000). La indexacion usando RT-PCR un ano despues de inducidos los tejidos detecto bandas amplificadas en los electroferogramas y la clonacion comprobo la presencia de 4 clones con mas de un 97% de similitud con la variante J02020 de ASBVd; con la secuencia se corroboro la existencia de las variantes CF3, CF8, CF13. Estos resultados demuestran que aunque ASBVd no es eliminado mediante el uso de embriogenesis somatica, la aplicacion de esta tecnologia permite inducir, proliferar y mantener por largo tiempo tejidos infectados para el estudio de este patogeno.

Palabras clave: ASBVd, embriogenesis somatica, RT-PCR, electroforesis capilar, secuenciamiento

ABSTRACT

Avocado embryogenic cultures were induced from the nucelli of three ASBVd (avocado sunblotch viroid)-infected cultivars to see whether healthy tissues could be obtained from infected plants for providing clones having added agronomic value. Embryogenic cultures were induced from the nucelli of three ASBVd-infected cultivars in B5 medium supplemented with Murashige and Skoog (MS) minor salts, 0.41 [micron]M pycloram and (in mg/[L.sup.-1]) thiamine HCl (0.4), myo-inositol (100), sucrose (30,000) and TC agar (8,000). Embryogenic cultures were kept in semi-solid MS medium with 0.41 [micro]M pycloram and (in mg/[L.sup.-1]) thiamine HCl (0.4), myo-inositol (100), sucrose (45,000) and TC agar (8,000) and in liquid MS3:1N medium supplemented with MS major salts with 15 mM N[H.sub.4]N[O.sub.3] and 30 mM KN[O.sub.3], MS minor salts, 0.41 [micron]M pycloram and (in mg/[L.sup.-1]) thiamine HCl (0.4), myo-inositol (100) and sucrose (45,000). RT-PCR indexing showed that the embryogenic cultures remained ASBVd-infected one year after induction and ASBVd variants were isolated from the cultures. The results proved that ASBVd was not eliminated via nucellus culture, although it showed that somatic embryogenesis can be used as a practical approach to inducing, multiplying and maintaining ASBVd-infected material for extended periods of times for research purposes.

Key words: ASBVd, somatic embryogenesis, RT-PCR, capillary electrophoresis, sequencing.

INTRODUCCION

La mancha del sol es una enfermedad de importancia economica en el cultivo del aguacate (Persea americana Mill.) que se reporto por primera vez en California (Estados Unidos) y descrita inicialmente como un problema fisiologico (Coit, 1928). El agente causal es el viroide de la mancha del sol del aguaca te (ASBVd) (Palukaitis et al., 1971), el cual consiste de una molecula circular de ARN de 246-249 nucleo tidos de tamano (Symons, 1981) perteneciente a la familia Avsunviroidae (Flores et al., 1998). ASBVd se replica en los cloroplastos usando riboenzimas que se encuentran inmersas en su propia secuencia (Na varro et al., 1999; Bonfiglioli et al., 1994).

La mancha del sol afecta por igual a todos los cultivares de aguacate, se transmite a traves de semilla, partes vegetativas, polen y herramientas contaminadas, y la erradicacion de las plantas afectadas es el unico medio de control disponible para prevenir su diseminacion (Wallace y Drake, 1962; Horne y Parker, 1931; Desjardins et al., 1979; Desjardins et al., 1980; Stevens y Piper, 1941). Evaluaciones de productividad han demostrado que las plantas de aguacate infectadas con ASBVd pueden presentar una reduccion de 27.3% en el rendimiento total de fruta y producir un incremento del 52.7% en frutos con baja calidad por la presencia de manchas en el fruto (Da Graca et al., 1983). De manera adicional, la amenaza de ASBVd se extiende a los bancos de germoplasma. Un programa generalizado de indexacion realizado en el Repositorio Nacional de Ger moplasma en Miami, basado en RT-PCR (Schnell et al., 1997), demostro que un 20% del total de la coleccion de aguacate estaba infectada con ASBVd, lo cual propicio la suspension en la distribucion de ma terial de propagacion a los productores y viveristas.

Aunque utilizando una tecnologia diferente para la indexacion de las plantas, el cultivo de tejido nucelar via embriogenesis somatica ha sido reportado como una forma de recuperar individuos sanos a partir de plantas adultas infectadas con virus y viroi des (Weathers y Calavan, 1959; Rangan et al.,1968; Bitters et al., 1972), y mas recientemente, usando RT-PCR como metodo de indexacion, el uso de termoterapia junto con el cultivo de meristemos ha permitido obtener plantas sanas a partir de arboles infectados (Postman y Hadidi, 1995; Howell et al., 1998). Con base en lo anterior y aplicando las tecnicas de embriogenesis somatica en aguacate se ha disenado el presente trabajo que tiene como objetivo utilizar embriogenesis somatica para inducir y proliferar tejidos embriogenicos a partir del nucelo de plantas infectadas con ASBVd en un intento por recuperar clones sanos a partir de cultivares contaminados con ASBVd.

MATERIALES Y METODOS

Material vegetal

Frutos inmaduros ([menor que o iqual a] 0.5 cm diam.) de los cultivares Vero Beach' SE2, Vero Beach' 1 y 'Yama' 381 plantados en el Repositorio Nacional de Germoplasma del Departamento de Agricultura de EE.UU. en Mia mi, Florida (USDA-ARS), previamente indexados y encontrados infectados con ASBVd basados en la tecnica de RT-PCR (Schnell et al., 1997), se utilizaron como fuente de explantes nucelares para la in duccion de cultivos embriogenicos.

Induccion y mantenimiento de cultivos embriogenicos en medio semisolido

Los petalos y los sepalos se removieron y los frutos se enjuagaron con agua corriente a temperatura am biente durante 1 hora. Despues del enjuague, los fru tos se desinfectaron superficialmente por 20 min en una solucion al 1.25% (v/v) de hipoclorito de sodio con 5 gotas de Tween 20[R] y se enjuagaron tres ve ces con agua destilada y esterilizada. Seguidamen te, los frutos se bisecaron longitudinalmente dentro de una camara de flujo laminar y, con la ayuda de un microscopio de diseccion, el embrion zigotico y el tejido endospermico de cada fruto se removieron y descartaron, mientras que el nucelo adherido a los integumentos se aislo e inoculo en medio semisolido para induccion de cultivos embriogenicos de aguacate (MIA), previamente descrito por Witjaksono y Litz (1999). El MIA contenia las sales mayores B5 (Gamborg et al.,1968) y se suplemento con las sales menores de Murashige y Skoog (MS) (1962), 0.41 [micro]M de picloram y (en mg/[L.sup.-1]) tiamina HCI (0.4), mio-inositol (100), sucrosa (30,000) y TC agar (8,000) (Carolina Biological Supply). El medio de cul tivo se esterilizo y distribuyo en porciones de 10 ml en platos de Petri plasticos (60 x 15 mm). Cuatro ex plantes, una mitad de nucelo cada uno, se inocularon en cada plato; los platos se sellaron con Parafilm[R] y se mantuvieron en la oscuridad a una temperatura de 25 [grados]C durante 4 a 5 semanas. De cada material se tomo el mayor numero posible de estructuras florales para la obtencion de explantes, lo que permitio establecer un total de 464 explantes de Vero Beach' SE2, 80 de Vero Beach' 1 y 296 de 'Yama' 381. Se registro el numero de cultivos embriogenicos inducidos y se calcularon los porcenta jes de induccion.

Los cultivos embriogenicos que se desarrollaron de los nucelos inoculados en MIA, se transfirieron individualmente a medio de mantenimiento semisolido (Witjaksono y Litz, 1999) donde proliferaron. El medio semisolido consistio de las sales ma yores y menores de MS suplementado con 0.41 [micron]M de picloram y (en mg/[L.sup.-1]) tiamina HCI (0.4), mio-inositol (100), sucrosa (45,000) y TC agar (8,000). El medio se esterilizo y distribuyo similarmente a lo indicado para MIA. Los cultivos se transfirieron a medio de cultivo fresco de la misma composicion cada cuatro semanas.

Mantenimiento de cultivos en medio liquido

Los cultivos en suspension se establecieron con aproximadamente 200 mg de tejido embriogenico de dos semanas de edad que se inocularon en erlen meyers de 125 mL que contenian 40 mL de medio liquido MS3:1 N (Witjaksono y Litz, 1999). MS3:1N consistio de MS modificado con 15 mM de N[H.sub.4]N[O.sub.3] y 30 mM de KN[O.sub.3], sales menores de MS, 0.41 [micron]iM de 2,4-D y (en mg/[L.sup.-1]), tiamina HCI (0.4), mio-inositol (100) y sucrosa (45, 000). Los recipientes se cubrieron con papel aluminio, se sellaron con Parafilm[R] y se mantuvieron en semioscuridad a 25 [grados]C en un agi tador orbital a 120 rpm. Los cultivos se transfirieron cada dos semanas a medio fresco de la misma formulacion.

Con el fin de caracterizar el comportamiento de los tejidos inducidos a partir de plantas infectadas con ASBVd, despues de tres subcultivos en medio fresco, el crecimiento de los cultivos en suspension se analizo y comparo con los de la linea embriogeni ca 'Hass'11.4.3 libre de ASBVd, inducida de embriones zigoticos obtenidos de la coleccion de germoplasma de la Universidad de California, Riverside, CA, y mantenida en medio liquido MS3:1N por 18 meses al momento de la evaluacion. Para la evaluacion, los cultivos en suspension de dos semanas de edad se homogenizaron a traves de un filtro esteril de 1.8 mm de diametro y la fraccion mas pequena se colecto. El inoculo consistente de 1 mi- de tejido embriogenico se obtuvo decantando los cultivos en cilindros graduados de 50 mi- e inoculandolo en erlenmeyers de 125 mi- de capacidad a los cuales se les adiciono medio MS3:1 N hasta alcanzar un volumen final de 40 mL. Los tejidos se cultivaron como se indico anteriormente y el incremento de volumen se registro a los 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27 y 30 dias despues de la inoculacion. Las muestras se distribuyeron en un diseno completamente al azar con cuatro genotipos y cinco replicas por cada genotipo, para un total de 20 unidades experimentales. Los datos obtenidos se estudiaron con analisis de varianza usando el modelo estadistico [Y.sub.i] = [micron]] + i + [e.sub.i], donde Y fue el volumen, i fue el cultivar y e el error experimental. Los promedios se compararon usan do la prueba de rangos multiples de Duncan con un nivel de significancia de [alfa] = 0.05.

Esterilizacion de medios de cultivo

El pH de todos los medios se ajusto a 5,7 - 5,8 con KOH o HCI antes de la adicion del agente solidifican te; posteriormente el medio se esterilizo en un auto clave a 121 [grados]C a 1.1 kg [cm.sup.-2] por 15 min y finalmente se dispenso como se indico para cada uno de los casos.

RT-PCR

Extraccion de ARN. Se extrajo ARN usando el metodo de Ainsworth (1995) modificado por Schnell et al. (1997) a partir de 100 mg de tejidos, se disolvio en 20 [micron]L de agua tratada con DEPC (dietil pirocarba mato) y se almaceno a -20 [grados]C.

Sintesis de la primera cadena complemen taria de ADN. La primera cadena complementaria de ADN (cADN) se sintetizo usando 10 pL de ARN mezclado con 3 [micron]L de 5X buffer (Gibco BRL) (50 mM Tris HCI (pH 8,3), 75 mM KCI y 3 mM Mg[Cl.sub.2]), 0.1 M DTT y 0.5 [micron]g del primer (5'-AAGTCGAAACTCAGAGTCGG-3) complementario a los nucleotidos 68-87 de la region conservada de la molecula de ASBVd (Bar-Joseph et al., 1985). La mezcla se incubo a 100 [grados]C por 5 minutos, luego se enfrio en hielo por 2 minutos y despues se coloco a temperatura ambiente por 1 hora para permitir la adhesion del primer. Posteriormente, los siguientes componentes se adicionaron: 2 [micron]L de 5X buffer, 25 mM de cada dinucleotide (ATP, CTP, GTP, TTP), 500 [micron]M de [beta]-mercaptoetanol, 20 unidades de RNAsin (inhibidor de RNAsa) (Promega) y 200 unidades de transcriptasa reversa M-MLV (Gibco BRL). El volumen se ajusto a un total de 25 [micron]L con agua esterilizada y la mezcla se incubo por 150 minutos a 42 [grados]C.

Amplificacion de la primera cadena de ADN. La primera cadena de ADN se amplifico por PCR usando el primer hacia delante 5'-(AAGTCGAAACTCAGAGTCGG-3, marcado con 6-FAM) y el primer de reversa 5'-(GTGAGAGAAGGAGGAGT-3, marcado con HEX) (Integrated DNA Technology-IDT). La reaccion de amplificacion consistio en 2.5 [micron]L de la reaccion cADN y 22.5 [micron]L de una mezcla compuesta de 2.5 [micron]L de 10X buffer de RCP, 25 mM de cada dinucleotido, 1.25 unidades de Amplitaq DNA polimerase (Perkin Elmer), 10 [micron]g de cada primer y agua esterilizada para ajustar el volumen. Las amplificaciones se efectuaron en un termociclador PTC 100 (MJ Research) con 30 ciclos a las siguientes condiciones: 30 segun dos a 94 [grados]C, 30 segundos a 55 [grados]C y 30 segundos a 72 [grados]C, con una extension final de 7 minutos a 72 [grados]C.

Electroforesis capilar. Los productos amplificados se analizaron usando electroforesis capilar en un analizador genetico ABI Prism[R] 3100 (Applied Biosystems) usando un polimero optimizado de 4% (POP 4), buffer de electroforesis con EDTA y un mar cador estandar interno de 500 bases (500 ROX). Los datos obtenidos se analizaron usando el software GeneScan (Applied Biosystems).

Clonacion y secuencia de fragmentos amplificados en uno de los cultivares

Con el fin de determinar si las bandas amplificadas correspondian a moleculas de ASBVd, se tomaron al azar los fragmentos amplificados de una muestra del cultivar 'Vero Beach' 1, los cuales se clonaron usando el kit TOPO[R] cloning (Invitrogen), de acuerdo con las especificaciones del fabricante, en bacterias E. coli competentes y estas se inocularon en me dio LB suplementado con 100 m[L.sup.-1] de ampicilina. Las colonias putativamente resistentes a ampicilina se inocularon en 100 [micron]L de medio de cultivo liquido S.O.C. [2% bactotriptona, 0.5% extracto de levadura, 10 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 20 MM (Mg[Cl.sub.2] 6[H.sub.2]O + MgS[O.sub.4] 7 [H.sub.2]O), 20 mM sucrosa] suplementado con ampicilina y se cultivaron en un agitador orbital por 20 horas a 37 [grados]C. Los cultivos se centrifugaron a 10,000 rpm durante 20 min, el sobrenadante se descarto y las bacterias peletizadas se resuspendieron en 50 [micron]L de 10 mM Tris-HCL (pH 8,0); esta sus pension se utilizo como templete para la amplificacion de los fragmentos clonados. Los pro ductos insertados se amplificaron usando los pri mers M13 (Promega). Los fragmentos amplificados se secuenciaron con la version 3 del ciclo de termi nacion en un analizador genetico ABI Prism 3100 usando el software de secuencia de ABI Prism. Los datos de las secuencias se alinearon manualmente utilizando el software Sequencer 4.1[R] (Gene Codes) y se compararon con variantes de ASBVd reportadas previamente.

RESULTADOS Y DISCUSION

Induccion y mantenimiento de cultivos embriogenicos en medio semisolido

Los cultivos embriogenicos se indujeron entre la segunda y la sexta semanas despues de la inoculacion en MIA. Los tejidos proliferaron directamente de celulas presentes en los explantes sin la formacion de un crecimiento intermedio de callo (figura 1A). Las frecuencias de induccion fueron de 1.5% para 'Vero Beach' SE2, 6.25% para 'Yama' 381 y 6.25% para 'Vero Beach' 1. Como resultado de los bajos indices de induccion no fue posible inferir ningun efecto es tadistico. Las estructuras inducidas consistieron de proembriones, embriones somaticos en estado globular y masas proembriogenicas (MPEs) (datos no mostrados). Previamente, cultivos embriogenicos nucelares han sido inducidos en especies de citricos (Weathers y Calavan, 1959; Rangan et al., 1968); Mangifera indica (Litz, 1984; Litz et al., 1982), Carica pentagona (Vega de Rojas y Kitto, 1991) y Persea americana Mil!. (Witjaksono et al., 1999). Aunque las frecuencias de induccion observadas fueron relativamente bajas (1.5 - 6.5%) si se comparan con cultivos nucelares de citricos (>10%) (Weathers y Calavan, 1959; Rangan et al., 1968) o Carica pentagona (>40%) (Vega de Rojas y Kitto, 1991), los niveles de induccion obtenidos en este estudio estan en corres pondencia con los porcentajes de induccion previa mente reportados para explantes nucelares de agua cate donde los porcentajes de induccion han estado entre 1 - 5% (Witjaksono et al., 1999).

[FIGURA 1 OMITIR]

Una vez transferidos a medio de manteni miento semisolido, los cultivos embriogenicos que proliferaron en MPEs mantuvieron esta caracteristica despues de varias transferencias a medio fresco, mientras que los que fueron inducidos inicialmente como proembriones se tornaron mas pequenos a medida que proliferaron y finalmente quedaron compuestos por MPEs despues de va rios subcultivos (figura 1B); los tejidos que iniciaron como embriones somaticos globulares se tornaron hiperhidricos y se deterioraron. A pesar que los datos de induccion y las caracteristicas de los cultivos en el medio de mantenimiento no permiten realizar ninguna correlacion con su origen a partir de plantas infectadas con ASBVd, al comparar los resultados obtenidos con los reportados para cultivos inducidos a partir de plantas sanas (Witjaksono y Linz, 1999; Pliego-Alfaro y Murashige, 1988), se observa claramente que la infeccion de ASBVd en la planta que provee los explantes no es una limitante para la induccion y multiplicacion de cultivos embriogenicos a partir de esta.

Mantenimiento de cultivos nucelares en medio liquido

Las masas proembriogenicas establecidas en el medio de cultivo liquido mantuvieron esta caracteristica despues de varios subcultivos (figura 1 C). La figura 2 muestra el comportamiento de los cultivos en medio liquido y la prueba de Duncan (tabla 1) muestra que el cultivar Vero Beach' SE2 obtuvo el mayor volumen de precipitado de celulas desde el tercer dia despues de la inoculacion y mantuvo esta tendencia. Al final del periodo de cultivo, Vero Beach' SE2 alcanzo el mayor volumen, seguido por el cultivar "11ass" 11.4.3 y los cultivares Vero Beach' 1 y 'Yama' 381, en su orden. Todos los cultivares alcanzaron el mayor volumen a los 24 dias despues de inoculados y la mayor tasa de crecimiento ocurrio entre los 15 y los 18 dias para Vero Beach' SE2, "Hass" 11.4.3 y Vero Beach' 1, mientras que para 'Yama' 381 esta se dio entre los dias 9 y 12 despues de la inoculacion.

[FIGURA 2 OMITIR]

El analisis del incremento de volumen a traves del tiempo demostro que todos los cultivos presentaron un crecimiento tipico de una suspension celular observado en estudios realizados con material sano (Witjaksono y Litz,1999), con una fase inicial de bajo crecimiento durante la primera semana, seguida por una de crecimiento mas activo en la segunda semana, decreciendo un poco hacia el final de la tercera semana y terminando con una fase de cese del cre cimiento al finalizar la cuarta semana de cultivo (figura 2). Este comportamiento de los tejidos indica que, independientemente de la condicion patologica de la planta de origen, los tejidos pueden proliferar en medio de cultivo liquido en un comportamiento similar al de un cultivo sano, demostrando que cultivos embriogenicos de plantas infectadas pueden desarrollarse en medio liquido para efectos de estudio de ASBVd en condiciones in vitro.

RT-PCR

La indexacion con RT-PCR efectuada en los cultivos nucelares a los 6, 9 y 12 meses despues de haber sido inducidos mostro que estos permanecieron infectados con ASBVd.

Electroforesis capilar

El electroferograma (figura 3) muestra que los tejidos embriogenicos consistentes de MPEs mantenidos un ano despues de inducidas de los cultivares Vero Beach' SE2, Vero Beach' 1 y 'Yama' 381 amplificaron fragmentos similares en tamano (aprox. 250 bp) a los del control positivo (tejido floral de Vero Beach' SE2), mientras que ningun tipo de amplificacion se observo en las MPEs de la linea embriogenica 'Hass' 11.4.3 utilizada como control negativo libre de ASBVd. Resultados similares se observaron a los 6 y 9 meses despues de la induccion (datos no mostrados). Bitters et al. (1972), con base en pruebas realizadas con plantas indicadoras, informaron la recuperacion de plantas citricas sanas regeneradas a partir de tejido nucelar de plantas infectadas con el viroide de exocortis de los citricos (CEVd). Recientemente, Postman y Hadidi (1995), aplicando termoterapia y cultivo de meristemos, y aplicando RT-PCR, obtuvieron un 86% de plantas de pera sanas a partir de tejidos vegetales aislados de arboles infectados con el viroide de la mancha de la piel del peral (ASSVd); igualmente, Howell et al. (1998) reportaron la eliminacion de ASSVd de plantas de manzana despues de usar termoterapia y cultivo de meristemos y realizar indexacion con RT-PCR. Los resultados obtenidos en el presente estudio demuestran que ASBVd no se elimina mediante el cultivo de tejidos embriogenicos inducidos a partir de celulas nucelares y, mas importante aun, que permanece por tiempo indefinido replicandose en la medida en que los cultivos embriogenicos proli feran. Aunque no se conoce el mecanismo exacto por el cual CEVd es eliminado mediante el cultivo de tejidos nucelares, se cree que esto es resultado de la ausencia de vasos vasculares en este tejido (Rangaswami, 1981), lo cual es soportado por el hecho de que CEVd y otros miembros de la familia Pospiviroidae se localizan y replican en el floema, conducto que igualmente utilizan para desplazarse dentro de la planta (Momma y Takahashi, 1983; Bonfiglioli et al., 1996). ASBVd y los otros miembros de la familia Avsunviroidae tienen marcadas diferencias estructu rales y moleculares con respecto a los viroides de la familia Pospiviroidae. Los primeros no tienen una region central conservada de nucleotidos (RCC), se localizan y replican en los cloroplastos y tienen la capacidad de autofragmentarse durante el proceso de replicacion usando solamente riboenzimas presentes en su estructura. Contrariamente, los segundos se caracterizan por tener una RCC, replicarse en el nucleo de la celula y utilizar enzimas del hospedero para separarse en moleculas singulares durante la replicacion (Flores et al., 1998). Aunque el mecanismo que los viroides de la familia Avsunviroidae utilizan para desplazarse dentro de la planta no se ha descubierto, los resultados de la presente investigacion indican que este seguramente es diferente al movimiento vascular a traves del floema, utilizado por los viroides de la familia Pospiviroidae, ya que solo de esta manera se explicaria el hecho de que ASBVd puede infectar un tejido sin conexiones vasculares como es el nucelo. Recientemente, indicadores como la conformacion de la estructura secundaria y la secuencia de nucleotidos de la molecula (Fadda et al., 2003a, b) se consideran como base para diferencias taxonomicas.

[FIGURA 3 OMITIR]

Clonacion, secuencia y analisis de variantes

Los fragmentos amplificados de la muestra del cultivar Vero Beach' 1 fueron seleccionados, clonados y secuenciados. Cuando las secuencias obtenidas se compararon en la base de datos del banco de genes del National Center for Biotechnology Information (NCBI), la busqueda revelo que cinco clones contenian secuencias con mas de un 97% de similari dad con variantes de ASBVd previamente reporta das. La alineacion de las secuencias de los clones seleccionados permitio establecer que la poblacion clonada estaba compuesta por tres variantes de ASBVd, como se detalla a continuacion: un clon contenia la variante CF3, uno contenia la variante CF8, dos clones contenian la variante CF13 y uno mas tenia insertada la variante CF24, todas previamente clonadas de plantas establecidas en el National Germoplasm Repository (NGR, Miami, FL). Estos resultados demuestran que los fragmentos amplificados en el proceso de RT-PCR fueron en efecto moleculas de ASBVd. La presencia de variabilidad en la secuencia de las moleculas de ASBVd afectando a un solo individuo ha sido previamente reportada (Semancik y Szychowsky, 1994; Schnell et al., 20001 a, b), fenomeno que ha sido relacionado con una variacion del concepto de cuasiespecies (Duarte et al., 1994; Ambros et al., 1999; Schnell et al., 2001a). Los resultados de las secuencias obtenidas demuestran la persistencia de ASBVd en plantas recuperadas a partir de tejidos similares a los aqui inducidos, lo cual indica que el cultivo nucelar no es un mecanismo efectivo para obtener plantas de agua cate sanas a partir del cultivo de nucelos obtenidos de cultivares infectados con ASBVd.

CONCLUSIONES

En el presente estudio, a pesar de no lograr la eliminacion de ASBVd mediante el procedimiento utilizado, el uso de la embriogenesis somatica ha permitido la induccion, multiplicacion y mantenimiento de material de aguacate infectado con ASBVd en condiciones in vitro, y aunque se ha demostrado que ASBVd persiste en los cultivos inducidos a partir de plantas infectadas, los resultados indican que existe la posibilidad de realizar estudios de analisis de variabilidad genetica en tejidos embriogenicos de aguacate para profundizar en el conocimiento de este particular patogeno.

AGRADECIMIENTOS

Los autores desean agradecer el apoyo de la Univer sidad de Cordoba, Colciencias, la Comision Ful bright, University of Florida--Tropical Research and Education Center, California Avocado Commission, Pamela Moon y Cecile T. Olano.

Recibido: Junio 30 de 2004

Aceptado: Mayo 26 de 2005

BIBLIOGRAFIA

Ainsworth, C. 1995. Isolation of RNA from floral tissue of Ru mexacetosa (Sorrel). PIantMol. Biol. Rep. 12:198-203.

Ambros, S.; Hernandez, C.; Flores, R. 1999. Rapid generation of genetic heterogeneity in progenies from individual cDNA clones of peach latent mosaic viroid in its natural host. Gen. Virol. 80: 2239-2252.

Bar-Joseph, M.; Segev, D.; Twizer, S.; Rosner, A. 1985. Detection of avocado sunblotch viroid by hybridization with synthetic oligonucleotide probes. J. Virol. Meth. 10: 69-73.

Bitters, W. P.; Murashige, T.; Rangan, T. S.; Nauer, E. 1972. Investigation on establishing virus free citrus plants through citrus culture. In: Proceedings of International Organization of Citrus Virologists. Gainesville: University of Florida Press, pp. 267-271.

Bonfiglioli, R. G.; Webb, D. R.; Symons, R. H. 1996. Tissue and intra-cellular distribution of coconut cadang cadang viroid and citrus exocortis viroid determined by in situ hybridization and confocal laser scanning and transmission electron microscopy. Plant J. 9: 457-465.

Bonfiglioli, R. G.; McFadden, G. I.; Symons, R. H. 1994. In situ hybridization localizes avocado sunblotch viroid on chloroplast thylakoid membranes and coconut cadang cadang viroid in the nucleus. Plant J. 6: 99-103.

Coit, E. 1928. Sunblotch of the avocado. A serious physiological disease. Cal. Avo. Soc. Yrb. 14: 27-32.

Da Graca, J. V.; Mason, T. E.; Antel, H. J. 1983. Effect of avocado sunblotch disease on fruit yield. S. Afr. Avo. Grow. Assoc. Yrb. 6:86-87.

Desjardins, P. R. 1958. Callus tissue growth on avocado stem segments cultured on artificial media. Cal. Avo. Soc. Yrb. 42: 99-101.

Desjardins, P. R.; Drake, R. J.; Atkins, E. L.; Bergh, B. O. 1979. Pollen transmission of avocado sunblotch virus experimentally demonstrated. Cal. Agric. 33: 14-15.

Desjardins, P. R.; Drake, R. J.; Swiecki, S. A. 1980. Infectivity studies of avocado sunblotch disease causal agent, possibly a viroid rather than a virus. Plant. Dis. 64: 313-315.

Duarte, E. A.; Novella, I. S.; Weaver, S. C.; Domingo, E.; Wain-Hobson, S; Clark, D. K.; Moya, A.; Elena, S. F.; de la Torre, J. C.; Holland, J. J. 1994. RNA virus quasispe cies: significance for viral disease and epidemiology. Infec. Agents Dis. 3: 201-214.

Fadda, Z.; Daros, J. A.; Flores, R.; Duran-Vila, N. 2003a. Eggplant latent viroid, the candidate type species for a new genus within the Avsunviroidae family (hammmer head viroids). J. Virol. 67: 6528-6532.

Fadda, Z.; Daros, J. A.; Flores, R.; Duran-Vila, N. 2003b. Identification in eggplant of a variant of citrus exocortis viroid (CEVd) with a 95 nucleotide duplication on the right terminal region of the rod-like secondary structure. Virus Res. 97: 145-149.

Flores, R.; Randles, J. W.; Bar-Josep, M.; Diener, T. O. 1998. A proposed scheme for viroid classification and nomenclature. Arch. Virol. 143: 623-639.

Gamborg, O. L.; Miller, R. A.; Ojima, K. 1968. Plant cell cultures. I. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Ce// Res. 50: 151-158.

Horne, W. T.; Parker, E. R. 1931. The avocado disease called sunblotch. Phytopathology. 21: 235-238.

Howell, W. E.; Burgess, J.; Mink, G. I.; Skrzcczkowsky, L. J.; Zhang, Y. P. 1998. Elimination of apple fruit and bark deforming agents by heat therapy. Acta Hortic. 472: 641-646.

Litz, R. E. 1984. In vitro somatic embryogenesis from nucellar callus of monoembnyonic Mangifera indica L. HortScience. 19: 715-717.

Litz, R. E.; Knight, R. J. Jr.; Gazit, S. 1982. Somatic embryos from cultured ovules of Mangifena indica L. Plant Cell Rep. 1: 264-266.

Momma, T.; Takahashi, T. 1983. Cytopathology of shoot api cal meristem of hop plants infected with hop stunt viroid. Phytopathology. 106: 272-289.

Murashige, T.; Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth of and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497.

Navarro, J. A.; Daros, J. A.; Flores, R. 1999. Complexes containing both strands of avocado sunblotch: identification in chlonoplasts and characterization. Virology. 253: 77-85.

Palukaitis, P.; Hatta, T.; Alexander, D.; Symons, R. 1971. Characterization of a viroid associated with avocado sunblotch disease. Virology. 99:145-151.

Pliego-Alfaro, F.; Munashige, T. 1988. Somatic embryogenesis in avocado (Persea americana Mill.). Plant Cell Tiss. Org. Cuit. 12: 61-66.

Postman, J. D.; Hadidi, A. 1995. Elimination of apple scar skin viroid from pears by in vitro termo-therapy and apical meristem culture. Acta Hortic. 386: 536-543.

Rangan, T. S.; Murashige, T.; Bitters, W. P. 1968. In vitro initiation of nucellan embryos in monoembryonic citrus. Hort Science. 3: 226-227.

Rangaswami, N. S. 1981. Nucellus as an experimental system in basic and applied tissue culture research. In: Rao, A. N. (ed.). Tissue Culture of Economically Important Plants. Singapore: COSTED and ANBS, pp. 269-286.

Schnell, R. J.; Kuhn, D. N.; Ronning, C. M.; Harkin, D. 1997. Application of RT-PCR for indexing avocado sunblotch viroid. Plant Dis. 81: 1023-1026.

Schnell, R. J.; Kuhn, D. N.; Olano, C. T.; Quintanilla, W. E. 2001a. Sequence diversity among avocado sunblotch viroids isolated from single avocado trees. Phytoparasitica. 29: 451-460.

Schnell, R. J.; Olano, C. T.; Kuhn, D. N. 2001b. Detection of avocado sunblotch viroid variants using fluorescent single-strand conformation polymorphism analysis. Elec trophoresis. 22: 427-432.

Semancik, J. S.; Szychowsky, J. A. 1994. Avocado sunblotch: a persistent viroid infection in which variants are associated with differential symptoms. J. Gen. Viroi. 75: 1543-1549.

Stevens, H. E.; Piper, R. B. 1941. Sunblotch in avocado diseases in Florida. USDA. Washington DC, pp. 40-46.

Symons, R. H. 1981. Avocado sunblotch viroid: primary sequence and proposed secondary structure. Nuc. Acids Res. 9: 6527-6537.

Vega de Rojas, R.; Kitto, S. L. 1991. Regeneration of babaco (Canica pentagona) from ovular callus. J. Amen. Soc. Hort. Sci. 116: 747-752.

Wallace, J. M.; Drake, R. J. 1962. A high rate of seed transmis sion of avocado sunblotch from symptomless trees and the origin of such trees. Phytopathology. 52: 237-241.

Weathers, L. G.; Calavan, E. C. 1959. Nucellar embryony as a means of fneeing citrus clones of viruses In: Wallace, J. M (ed.). Citrus Virus Diseases, Berkeley: University of California Division of Agnicultural Sciences, pp. 197-200.

Witjaksono; Litz, R. E. 1999. Induction and growth characteristics of embnyogenic avocado cultures. Plant. Cell Tiss. Org. Cuit. 59:19-29.

Witjaksono; Litz, R. E.; Pliego-Alfaro, F. 1999. Somatic embryogenesis of avocado. In: Jain, S. M.; Gupta P. K.; Newton, R. J. (eds.). Somatic Embryogenesis of Woody Plants, vol. 5. Dordrecht: Kluwer, pp. 197-214.

Isidro E. Suarez*, Richard E. Litz**, Raymond J. Schnell***, David N. Kuhn****

* Ph. D. Departamento de Agronomia, Universidad de Cordoba. Carrera 6 No. 76- 103. Monteria, Colombia. Correo electronico: isuarez@sinu.unicordoba.edu.co

** Ph. D. University of Florida, Trec 18905 SW 280 St. Homestead, FL 33031.

*** Ph. D. USDA-ARS, 13601 Old Cutter Road, Miami, FL 33158.

**** Ph. D. Department of Biological Sciences, Florida International University, Miami, FL 33199.
Tabla 1. Volumen de precipitado de celulas en medio de cultivo
liquido y significancia con base en la prueba de Duncan
([alfa] = 0.05)

                    Dias en cultivo

Cultivar      3       6       9      12      15

'Vero       1.75    3.42    5.57     8.4    12.8
Beach'        a       a       a       a       a
SE2

'Hass'      1.06    1.76    2.36    4.16     6.7
11.4.3        b       b       b       b       b

'Vero       1.14    1.86    2.52    3.88     4.8
Beach' 1      b       b       b       b       c

'Yama'      1.14    1.82    2.12     3.2    4.22
381           b       b       b       b       c

                    Dias en cultivo

Cultivar     18      21      24      27      30

'Vero       20.4    25.4     27     25.8    25.2
Beach'        a       a       a       a       a
SE2

'Hass'       9.5    10.6     11     10.6    10.2
11.4.3        b       b       b       b       b

'Vero       6.44    6.81    7.85    7.52    7.64
Beach' 1      c       c       c       c       c

'Yama'      5.14    5.29    5.35    5.34    5.34
381           c       c       d       d       d

Valores con diferentes letras son significativamente
diferentes al 0.05%.
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Author:Suarez, Isidro E.; Litz, Richard E.; Schnell, Raymond J.; Kuhn, David N.
Publication:Revista Colombiana de Biotecnologia
Date:Dec 1, 2005
Words:5871
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