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El status epilepticus no modifica la memoria de trabajo en ratas de 21 dias de edad: un estudio preliminar.

Status epilepticus does not modify working memory in twenty one days old rats: A preliminary study

1. Introduction

El SE o estado epileptico es un tipo de actividad no autolimitada, que es caracterizada por crisis epilepticas continuas por un tiempo prolongado o intermitentes sin que el individuo recupere por completo la consciencia entre estas. (1,2) El SE ocurre con mayor frecuencia en ninos que en adultos. (3-5) A nivel experimental, el SE experimental produce alteraciones conductuales a largo plazo cuando se induce durante la etapa posnatal temprana de la rata, (6-7) pero el efecto es diferente dependiendo de la edad del animal a la cual se presenten las convulsiones. (8,9)

El SE inducido con acido kainico en ratas de 14 dias de edad produce deterioro en la memoria y el aprendizaje espacial a corto y largo plazo en la adultez. (8,9) Sin embargo, pocos son los trabajos que han explorado las consecuencias del SE causado en la rata en desarrollo sobre los procesos mnemonicos poco despues de ocurrido el evento convulsivo y sobre otros tipos de memoria a corto plazo, tal es el caso de la memoria de trabajo. Los datos al respecto son de importancia al considerar que en la clinica el SE es mas frecuente en la poblacion pediatrica e infantil. (3)

La memoria de trabajo es una forma de almacenar informacion de manera transitoria (memoria a corto plazo), es limitada en capacidad y requiere de ensayo, (10) pero es de amplia importancia para llevar a cabo las actividades de la vida cotidiana. Esto nos llevo a preguntarnos si el SE que se causa durante etapas tempranas de la vida modifica unicamente la memoria espacial cuando se es adulto o puedo afectar tambien a la memoria de trabajo poco despues del evento convulsivo. Por lo que el proposito del presente estudio fue evaluar si el SE en ratas de 14 dias de edad modifica la memoria de trabajo evaluada durante el dia posnatal 21. Para este fin se utilizo el modelo de litio-pilocarpina para generar las convulsiones y el modelo de memoria de reconocimiento de un objeto nuevo.

2. Material y metodos

Sujetos de estudio

Se utilizaron ratas de la cepa Wistar criadas en el bioterio del Centro de Investigaciones Cerebrales de la Universidad Veracruzana. Las madres gestantes, y despues las madres con sus crias, se mantuvieron a temperatura ambiente, con libre acceso a agua y alimento y con ciclo normal luz-oscuridad de 12 h. Se utilizaron animales de ambos sexos y el dia de nacimiento se considero como el dia posnatal cero (P0). En todos los casos, la induccion del SE se realizo a cabo entre las 0900 y 1000 h del dia posnatal 14. Al finalizar el evento epileptico, las crias se regresaron al nido y permanecieron con sus madres hasta el final de los experimentos. Todos los procedimientos se realizaron bajo la normatividad vigente para el uso y cuidado de animales de investigacion de Mexico (NOM-062-ZOO-1999).

Induccion del status epilepticus

Durante el dia posnatal 13 las ratas se inyectaron con LiCl (3 mEq/Kg, i.p; Sigma) y despues de 20 h, durante el dia postnatal 14, se administro clorhidrato de pilocarpina (100 mg/Kg, s.c.; Sigma) para inducir el SE (11) (n=I0). El grupo de animales control se inyecto unicamente con LiCl y solucion salina (n=8). Todos los animales se rehidrataron con solucion salina glucosada 5% (1 ml, s.c.) 6 h despues de la induccion del SE y se regresaron con sus madres. Se trato de modelar un tipo severo de SE, por lo que las convulsiones no se detuvieron con ningun farmaco antiepileptico.

La manifestacion de la actividad convulsiva se monitoreo al registrar las mioclonias de miembros anteriores y cabeza, crisis generalizadas ya sea con perdida o no de la postura corporal y solo aquellos animales que desarrollaron SE fueron incluidos en el estudio. Se determino la latencia y duracion del SE, asi como el porcentaje de animales que lo presentaron.

Modelo de reconocimiento de un objeto nuevo

El modelo consistio en someter a la rata a una sesion de entrenamiento y posteriormente retarla para evaluar su capacidad para reconocer un objeto nuevo (memoria de trabajo). Previo al experimento, los animales fueron habituados a la camara de acrilico (40 X 40 cm) durante 5 min por cuatro sesiones (P16-P19) (Figura 1). Al dia siguiente (P20), las ratas se sometieron a una sesion de pre-prueba, durante la cual se expusieron en la misma camara a dos objetos identicos (cilindros de plastico de 4.5 cm de diametro X 3.7 cm de alto) durante 5 min; veinticuatro h despues (P21), los animales se colocaron en el mismo compartimento por 5 min, pero en este caso uno de los objetos fue nuevo para las ratas, i.e. no presentado antes (figura en forma de cruz de plastico de 4.7 cm de longitud X 3.7 cm de alto) y el otro fue el mismo de la sesion de entrenamiento (objeto familiar).

Las sesiones se videograbaron y se analizo la exploracion que la rata hizo a los objetos tanto familiar como nuevo. La exploracion se definio como el olfateo o el contacto que la rata realizo sobre el objeto con la nariz o las extremidades delanteras. (12) El tiempo total que cada animal exploro los objetos nuevo y familiar se determino con el Programa de Observacion de Comportamiento, (BOP por sus siglas en ingles; Steve Cabilio, 1998). A partir de los tiempos de exploracion registrados se calculo el indice de discriminacion (ID) para establecer la preferencia de la rata a la exploracion del objeto nuevo. (12)

Los experimentos se realizaron entre las 1200 y las 1400 h. La camara y los objetos utilizados en las pruebas se limpiaron con etanol al 70% y se dejaron secar antes de la prueba y entre cada rata para eliminar residuos y olores que pudieran interferir con el estudio.

Analisis estadistico

Se verifico que los datos cumplieran los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianzas (para no cometer error tipo II) realizando las pruebas de Kolmogorov-Smirnov y Levene, respectivamente. El tiempo de exploracion del objeto nuevo y del objeto familiar, asi como los valores de ID del grupo control y del grupo con SE se compararon utilizando una prueba de t de Student y se presentan como la media el error estandar de la media (E.E.M.).

El numero de animales que presentaron un ID negativo en cada grupo experimental se comparo utilizando la prueba exacta de Fisher. Los analisis se realizaron con el programa Sigma Stat version 3.5 y para evaluar la existencia de diferencias estadisticamente significativas entre los grupos experimentales se considero un nivel alfa de p< 0.05.

[FIGURA 1 OMITIR]

3. Resultados

Induccion del SE

El total de los animales tratados con pilocarpina presentaron SE con un tiempo de latencia de 9.3 [+ o -] 0.5 min y una duracion de 4.7 [+ o -] 0.03 h. Las conductas que se observaron en todos los animales fueron en orden de aparicion: temblor, mioclonias de cabeza, mioclonias de miembros anteriores y crisis generalizadas caracterizadas por las conductas antes mencionadas y el erguimiento del animal en sus extremidades traseras con perdida de la postura.

SE y memoria de trabajo

El tiempo de exploracion del objeto nuevo (13.3 [+ o -] 2.7 s, 57% del tiempo total de exploracion) y el objeto familiar (11.7 [+ o -] 1.7s, 46% del tiempo total de exploracion) por las ratas que presentaron SE fue similar al de los sujetos control [13.3 [+ o -] 2.6 s (57% del tiempo total de exploracion) y 12.0 [+ o -] 2.5 s (43% del tiempo total de exploracion), respectivamente] (objeto nuevo: t=0.123, gl=16, p=0.990; objeto familiar t=0.898, gl=16, p=0.930) (figura 2).

El valor de ID promedio del grupo de ratas con SE (3.6 [+ o -] 11.0 s) no resulto estadisticamente diferente al valor obtenido por los animales del grupo control (13.8 [+ o -] 14.2 s), aunque se observo una ligera disminucion de este parametro en los sujetos con SE (t=0.578, gl=16, p=0.571, figura 3).

[FIGURA 2 OMITIR]

El analisis del ID individual de los animales del grupo SE y del grupo control, mostro que 60% (6/10) de las ratas que tuvieron crisis mostraron un valor negativo de ID, i.e., exploraron mas el objeto familiar, mientras que solo el 25% (2/8) de los animales control presentaron este comportamiento, aunque no resulto ser estadisticamente significativo (p=0.692) (Tabla 1).

[FIGURA 3 OMITIR]

No se detectaron diferencias en el numero de animales con ID negativo entre los grupos experimentales (prueba exacta de Fisher, p=0.692).

4. Discusion

Los hallazgos del estudio muestran que los animales que tuvieron SE convulsivo durante la segunda semana de vida, no muestran diferencias en la memoria de trabajo evaluada durante el dia posnatal (21), en comparacion con los sujetos control.

El modelo de reconocimiento de un objeto nuevo se implemento inicialmente para valorar la capacidad de la rata para reconocer un objeto familiar con el paso del tiempo, habilidad que se ha denominado memoria de reconocimiento. (11) Este modelo aprovecha la naturaleza intrinseca de exploracion de las ratas y se considera prometedor para detectar alteraciones mnemonicas pediatricas y de la adolescencia. (14) Este modelo contempla dos funciones, la capacidad de detectar lo conocido (familiarity detection) y la capacidad de expresar esa funcion (recollection). (15,16) Asi, si los animales muestran una mayor interaccion con el objeto novedoso durante la prueba (>50%), se puede presumir que han recordado el objeto muestra o familiar, lo que se considera como un indicativo de memoria. (17) Por tal motivo este modelo explora posibles modificaciones en la memoria de trabajo (memoria a corto plazo).

Los resultados del presente proyecto, muestran que el tiempo de exploracion del objeto nuevo y del objeto familiar de ratas que presentaron SE durante el dia posnatal 14 es similar al de los animales que no convulsionaron o control. Este hecho tambien se refleja en el valor promedio del ID, ya que no fue diferente entre los grupos experimentales. Sin embargo, se registro la tendencia de valores de ID bajos en las ratas con SE respecto al grupo control, pero al realizar el contraste los resultados mostraron que aunque un mayor numero de ratas del grupo SE presentaron un ID negativo, este no resulto ser diferente al comprarse con el grupo control. La ausencia de diferencias estadisticamente significativas entre los tratamientos puede atribuirse a varios aspectos. Inicialmente, un hecho que podria enmascarar el efecto del SE en la memoria de trabajo podria estar relacionado con la baja capacidad de discriminacion de objetos de las ratas proximas al destete (20 23 dias de edad), segun se propuso en un estudio previo. (14) La explicacion podria ser que si bien es cierto que los sujetos control exploran mas el objeto nuevo que el objeto familiar (57% vs 43%, respectivamente), la diferencia es de menos de 2 s en promedio, i.e. el tiempo de exploracion es cercano al 50:50. Se conoce que existen diferencias debido a la ontogenia en la capacidad de reconocer el objeto nuevo en este modelo experimental, al realizar la prueba 24 h despues del periodo de entrenamiento, (14) tal y como se realizo en este proyecto; en este reporte las ratas de tres semanas de edad presentaron un porcentaje de exploracion del objeto nuevo por debajo del 50%. (14) Por lo que es indispensable realizar un protocolo experimental similar al que se empleo en este trabajo, aunque analizando la memoria de trabajo a periodos mas cortos despues del SE, considerando que en este estudio el modelo de memoria se realizo 7 dias despues del SE. Debe recalcarse que se siguio este esquema experimental debido a que durante las primeras 48 h posteriores al SE los animales no se desenvuelven normalmente (algunas horas posteriores al SE los animales se encuentran hipoactivos, debido al desgaste que resulta de presentar convulsiones durante aproximadamente 5 h y al dia siguiente se muestran hiperexcitables con una susceptibilidad aumentada a presentar una crisis convulsiva ante estimulos que originalmente no la desencadenarian) y a que requirieron de al menos cuatro sesiones diarias de habituacion en la camara de prueba (datos no mostrados de un estudio piloto). Asimismo, seria importante realizar la prueba maximo 1 h despues de la pre-prueba o sesion de familiarizacion, con la finalidad de confirmar/descartar que el SE produce un efecto en la memoria indetectable a tiempos mayores, considerando lo observado por Reger y colaboradores. (14) Como ya se menciono anteriormente, el modelo de reconocimiento de un objeto nuevo resulta atractivo a la investigacion porque no requiere una motivacion externa o reforzamiento, ademas de que demanda periodos cortos de habituacion y entrenamiento. Sin embargo, algunas de sus limitantes pueden ser los niveles bajos de exploracion, el aumento de la actividad exploratoria al incrementar el tamano de la arena, la preferencia hacia ciertos objetos que determinen la exploracion que el roedor despliega hacia estos, cambios en la respuesta debido a diferentes intervalos o duracion de las fases del modelo (i.e. habituacion, familiarizacion (pre-pueba) y prueba), asi como efecto del medio ambiente en la preferencia hacia uno de los objetos. (18) Las consideraciones anteriores explicarian, en parte, la falta de evidencia experimental respecto a este tema en ratas en desarrollo. Por lo tanto, una perspectiva derivada de este trabajo, seria emplear modelos experimentales de memoria alternos, tal es el caso del laberinto acuatico de Morris (LAM). Este modelo se ha empleado ampliamente para el estudio de las consecuencias de la epilepsia en procesos mnemonicos durante la etapa adulta. (7-9) El LAM proporcionaria informacion sobre deterioro de la memoria y el aprendizaje sobretodo espacial, aunque la memoria de trabajo tambien podria ser explorada.

Desde el punto de vista neuroanatomico, el modelo de reconocimiento de un objeto nuevo involucra al lobulo temporal importantemente, (19,20) entre ellos al hipocampo (21-24) y a la corteza perirrinal. (25-27) Se sabe que el SE producido en ratas de 14 dias de edad causa muerte neuronal extensa en el hipocampo, el talamo y la amigdala, (11, 28, 22) todas estas regiones ubicadas en el lobulo temporal. Dado este efecto, hipotetizamos que el SE podria modificar la memoria de trabajo evaluada en el modelo de reconocimiento de un objeto nuevo. Sin embargo, los resultados senalan que el SE no causo deterioro en este proceso mnemonico a pesar de presentar una tendencia a hacerlo. Esto puede asociarse con la plasticidad cerebral/neuronal amplia que posee el cerebro en desarrollo, (30) lo cual permite a las neuronas restantes suplir funcionalmente a las que se perdieron o que incluso otras regiones cerebrales del lobulo temporal pudieran ejecutar las funciones que dejan de realizar las areas que sufrieron muerte neuronal, en contraste con individuos adultos.

En resumen, un mayor numero de ratas del grupo SE presentaron un ID negativo con respecto al grupo control, aunque la diferencia no fue estadisticamente significativa. Sin embargo, este resultado implicaria que el SE produce un deterioro en el reconocimiento de los objetos ya que la rata parece no recordar al objeto familiar. Considerando lo anterior, no podemos descartar que la ausencia de cambios puede deberse a que la muestra analizada no es suficiente para identificar el fenomeno.

5. Conclusion

El SE inducido a ratas de 14 dias de edad no modifica la memoria de trabajo evaluada durante el dia posnatal 21.

Recibido: 12 de enero de 2013 Aceptado: 21 de febrero de 2013

6. Agradecimientos

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia por el donativo de Investigacion Basica otorgado a MLLM (numero 106402) y la beca para la realizacion de estudios de doctorado otorgada a JSMM (numero 223546).

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Jesus Servando Medel-Matus [1,4], Rosa Angelica Medel-Matus [1], Joel Martinez-Quiroz [3], Deysi Y. Bermudez-Ocana [5], Cesar A. Perez-Estudillo [1,2], Luis I. Garcia [1,2], Genaro A. Coria Avila [1,2], Maria-Leonor Lopez-Meraz [1,2] *

[1] Centro de investigaciones Cerebrales, Universidad Veracruzana. [2] Facultad de Medicina, Universidad Veracruzana. [3] Facultad de Quimica Farmaceutica Biologica, Universidad Veracruzana y Escuela Nacional de Ciencias Biologicas, instituto Politecnico Nacional. [4] Doctorado en Neuroetoiogia, Universidad Veracruzana. [5] Division Academica Muitidiscipiinaria de Comalcalco, Universidad Juarez Autonoma de Tabasco.

* Correspondencia: Centro de Investigaciones Cerebrales, Universidad Veracruzana Av. Dr. Luis Castelazo s/n, Col. Industrial Las Animas Xalapa, Ver. C.P. 91190. Telefono: (228) 8418900. Ext. 13609 Fax: (228) 8418900. Ext. 13611 Email: leonorlopez@uv.mx
Tabla 1. Indice de discriminacion (ID)
individual de cada uno de los animales de los
grupos control y SE en la prueba de
reconocimiento de un objeto nuevo realizada
durante el dia posnatal 21.

Grupo control

Rata     ID (%)

A4       76.923
A5      -54.286
A13       8.108
A14      40.123
A15      -0.319
A16     -19.298
A17      41.026
A18      18.719

Animales con ID
negativo = 3/8

Grupo SE

Rata     ID (%)
AI        8.743
A2       64.303
A3       -1.435
A6      -36.641
A7       -7.353
A8      -10.836
A9       -2.251
A10     -49.123
A11      20.27
A12      50.515

Animales con ID
negativo = 6/10
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Author:Servando Medel-Matus, Jesus; Angelica Medel-Matus, Rosa; Martinez-Quiroz, Joel; Bermudez-Ocana, Deys
Publication:eNeurobiologia
Date:Jun 1, 2013
Words:3783
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