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Eficacia antimicrobiana del primer ortodoncico adicionado con nanoparticulas de plata. Estudio transversal in vitro.

Antimicrobial efficacy of orthodontic primer added with silver nanoparticles. Cross-sectional in vitro study.

INTRODUCCION

La desmineralizacion del esmalte es una complicacion comun en el tratamiento ortodoncico con aparatologia fija que provoca lesiones cariosas o "manchas blancas". Prevenir estas es una de las preocupaciones de los ortodoncistas debido a que resultan poco saludables y antiesteticas, asi como potencialmente irreversibles. Las lesiones por desmineralizacion, causadas por los acidos formados por los microrganismos alrededor de la aparatologia ortodoncica fija, se observan como manchas blancas en el esmalte (1-3).

La cavidad oral esta constituida por gran numero de microorganismos que coexisten en simbiosis con el huesped. Un grupo de complejos bacterianos son los principales responsables del inicio y progresion de la desmineralizacion; aunque gran parte de los microorganismos que ingresan en la cavidad bucal se eliminan, un pequeno porcentaje puede adherirse y persistir para organizarse en placas o biopeliculas que desencadenan el inicio de la desmineralizacion del esmalte. La adhesion de la aparatologia ortodontica fija al diente es facilitada mediante el primer. Estudios previos han reportado que estos primer proveen un sitio de facil adhesion y rapido crecimiento de microorganismos, debido a la rugosidad de su superficie (4, 5). Un metodo para prevenir la desmineralizacion del esmalte es utilizar primer ortodoncicos resistentes a la acumulacion y colonizacion bacteriana. Para este proposito, varios agentes antimicrobianos, como fluoruro y clorhexidina se han incorporado en productos ortodoncicos; sin embargo, en la practica, se ha comprobado que no son duraderos y que afectan las propiedades mecanicas de adhesion del material (1-5).El desarrollo cientifico que ha alcanzado la nanotecnologia ha generado una nueva dimension en el desarrollo de materiales o tecnicas odontologicas. La nanotecnologia incluye a la electronica y el magnetismo, para la fabricacion de estructuras de carbon, silicio, materiales inorganicos, metales y materiales semiconductores. El termino nanotecnologia, se refiere a la fabricacion y utilizacion de materiales, dispositivos y sistemas en el rango de dimension de 0,1-100 nm (1 nm = 10-9 m) que permite fabricar materiales a partir del reordenamiento de atomos y moleculas, presentando propiedades diferentes que las normales. En otros estudios, las nanoparticulas de plata (NPsAg) se han incorporado a diversos materiales de adhesion, debido a que presentan en su quimica superficial, propiedades que han demostrado tener un efecto antibacteriano contra la biopelicula de bacterias inoculadas en la superficie de las restauraciones (6-9). Para ser aceptados clinicamente, los nuevos primers deben proveer actividad antimicrobiana superior, disminuir la colonizacion bacteriana y mostrar propiedades fisicas comparables a los primers convencionales (10-13).

El proposito de este estudio in vitro fue evaluar la eficacia antimicrobiana de las NPsAg incorporadas al primer ortodoncico y compararla con la actividad bacteriana del primer convencional.

MATERIAL Y METODOS

La primera fase del estudio comenzo seleccionando y analizando una muestra de 40 premolares; los criterios de inclusion fueron los siguientes: primeros premolares inferiores extraidos de pacientes sanos, sin caries, desmineralizacion, restauraciones, fracturas o fluorosis, los cuales se sometieron a un protocolo de desinfeccion y esterilizacion. Dichos procesos se corroboraron inoculando las muestras en agar soya tripticasa (Difco, BD, Franklin Lakes, NJ, Estados Unidos), incubandolospor 24 horas en horno de incubacion (Felisa, Zapopan, Jalisco, Mexico) a 37[grapos]C; se midio el desarrollo microbiano en escala de McFarland y en siembras en placas de agar soya tripticasa (Difco, BD, Franklin Lakes, NJ, Estados Unidos), en los cuales no se observo crecimiento bacteriano.

Durante la segunda fase del estudio, la muestra se dividio en 2 grupos: grupo control (n= 20) y grupo de tratamiento con NAg (n= 20). En el grupo control, se procedio a realizar el protocolo de cementado con aparatologia ortodoncica fija Flexx MBT (Ah-Kim-Pech, D.F., Mexico) mediante Transbond XT Primer (3M[R] Minnesota Mining and Manufacturing Company, Estados Unidos). Para el grupo con NAg, se uso tambien Transbond XT Primer pero adicionando nanoparticulas de plata al material ortodontico. Para tales efectos se uso una mezcla de NPsAg en polvo elaborada en un cuarto oscuro de laboratorio, con una concentracion de 600 ppm, pH 7 y un tamano aproximadamente de 50 nm, previamente evaluado por un equipo Malvern Co. MOd. NanoziserTecnica DLS; el tamano y la distribucion de las NPsAg, la cristalinidad y el grado de dispersion dependieron de la cinetica de la reaccion. Para la sintesis de las NPsAg se utilizo NaBH4 como agente reductor. La relacion molar Ag+ a reductor fue mayor a uno. Se adicionaron agentes estabilizantes (aminas primarias con relacion molar metal-estabilizante) para controlar el tamano y uniformidad. Se realizo el protocolo de grabado mediante acido fosforico al 37 % Scotchbond (3M, Monrovia, CA, Estados Unidos), el cual se aplico por 30 segundos, se enjuago por 30 segundos y se procedio a secar con aire a presion. El primer fue entonces aplicado en la superficie vestibular grabada del diente, se procedio a colocar resina Transbond XT (3M[R] Minnesota Mining and Manufacturing Company, Estados Unidos) en la base del bracket, colocandolo en el diente con una presion constante, retirando el exceso de resina y se fotopolimerizo (Demetron VCL 401, Kerr, Orange, CA, Estados Unidos) por 40 segundos en total (10 segundos por cada cara de la aparatologia fija).

Para la inoculacion bacteriana de los premolares se tomaron muestras a 4 pacientes. Los criterios de exclusion fueron los siguientes: caries activa, bolsas periodontales, habitos perniciosos o haber sido tratado con antibioticos en los ultimos 3 meses. La toma de muestra se realizo mediante la colocacion de una punta de papel esteril (Hygenic, Akron, OH, Estados Unidos) en la cara vestibular del incisivo central inferior; posteriormente se colocaron en un contenedor cerrado y fueron transportados inmediatamente al laboratorio para cultivo de S mutans (14). Las muestras obtenidas se sembraron en agar mitis-salivarious (Difco, BD, Franklin Lakes, NJ, Estados Unidos), agar lactobacillus (Difco, BD, Franklin Lakes, NJ, Estados Unidos) y agar extracto de levadura sucrosa-bacitracina (Difco, BD, Franklin Lakes, NJ, Estados Unidos). Para corroborar la presencia de las bacterias de interes del estudio, se realizaron pruebas preliminares de morfologia macroscopica y microscopica. Una vez obtenidos los cultivos se realizaron pruebas de identificacion bioquimica API20s-trep (bioMerieux Mexico, D.F., Mexico). Se identifico la presencia de S. mutans, S. mitis, S. salivarious, S. sanguis y Lactobacillus. Se aislaron los microorganismos en tubos de ensaye con 10 ml de Brain-HeartInfusion (BHI) (Lansing, MI, Estados Unidos) y se mantuvieron a 37[grapos]C en horno de incubacion (Felisa, Zapopan, Jalisco, Mexico). Se dividieron las muestras de ambos grupos de manera aleatoria en tubos de ensaye con 20 ml de BHI que contenian las muestras bacterianas obtenidas previamente. Se incubaron a 37[grapos]C y se realizaron se realizaron recambios de BHI cada 48 horas para que las bacterias siguieran en un medio apto con nutrientes que las mantuvieran activas el tiempo de duracion del estudio. Las tomas de muestras microbiologicas de cada uno de los premolares se llevaron a cabo en dos intervalos de tiempo, a los 15 y 30 dias. Dichas muestras fueron tomadas con 3 puntas de papel esteril (Hygenic, Akron, OH, Estados Unidos) a cada diente, con una duracion de toma de muestra de 1 minuto. Se depositaron en tubos de ensayo con 10 ml de caldo soya tripticasa, se incubaron por 2 horas en horno de incubacion a 37[grados]C y se hizo dilucion seriada [10.sup.-1] a [10.sup.-3]. Posteriormente, se sembraron todas las diluciones en placas agar soya tripticasa, se etiquetaron y sellaron las muestras y se incubaron durante 24 horas en horno de incubacion a 37[grados]C. Posteriormente, se contaron las unidades formadoras de colonias (UFC) usando un lapiz digital contador de colonias (modelo 1002, Labtron, Tehran, Iran) y se tomaron en cuenta las muestras que tuvieran entre 25-250 UFC con la finalidad de permitir la observacion de las caracteristicas morfologicas de las bacterias, asi como el conteo por dispersion adecuada de las UFC (15). Para el analisis estadistico se utilizo el software MINITAB (Version 17, State College, PA, Estados Unidos), se analizo la normalidad de las variables y se realizo comparaciones entre las muestras con la prueba t de student para determinar la significancia. Para reducir el sesgo de las medidas se calculo el coeficiente de confiabilidad (95%) y con una significancia estadistica de p < 0,05.

Se hizo la transformacion de los datos del numero de UFC a datos exponenciales para su analisis estadistico con la siguiente formula:

No. de colonias en placa x Factor de dilucion / 0,1 mL = No. de colonias por mililitro

Posteriormente se expreso el numero de UFC en [log.sub.10] para los tiempos de toma de muestra en los grupos de estudio.

El presente fue un estudio in vitro con manejo de residuos con desarrollo microbiano, cuyo protocolo fue autorizado por el honorable comite de etica en investigacion de la Facultad de Estomatologia de la Universidad Autonoma de San Luis Potosi asignado con la clave CEIFE034-014, se siguieron los lineamientos de acuerdo a la norma oficial mexicana NOM-087ECOL-SSA1-2002 de proteccion ambiental, salud ambiental, residuos peligrosos biologico infecciosos, de clasificacion y especificaciones del manejo.

RESULTADOS

Se identifico la carga bacteriana en los dos grupos de estudio a los dias 1, 15 y 30 para cada una de las muestras. Se realizo la estadistica descriptiva que incluye la media, error estandar, desviacion estandar, valor minimo y maximo para cada variable. En ambos grupos se obtuvo una toma basal con carga bacteriana en el dia 0; en el dia 15 se identificaron las diferencias entre los grupos de control y de tratamiento encontrandose una media de 9,6 UFC[log.sub.10] con una desviacion estandar de 1,4 para el grupo de tratamiento (adicionado con NPsAg), y de 10,8 UFC[log.sub.10] con una desviacion estandar de 0,8 en el grupo control, lo que indico una disminucion significativa de UFC en el grupo de tratamiento (p= 0,02).Al realizarse el recuento en el dia 30, que han empleado las NPsAg como agente antimicrobiano. Asi Silva Benitez y col. (25) observaron que al colocar adhesivo sobre el esmalte dental, aumentaba la presencia de S. mutans y disminuia con la agregacion de NPsAg, siendo esta una buena opcion para prevenir la desmineralizacion del esmalte alrededor de la aparatologia ortodoncica (25). En este estudio se observo una reduccion del efecto de las NPsAg en la toma de muestras en el dia 30, lo cual pudo deberse a la adhesion que se establece entre los microorganismos y los tejidos del hospedero, microorganismos que se agregan entre si para organizarse en placas o biopeliculas que son comunidades complejas de microorganismos recubiertas de un polimero extracelular que les ayuda a retener el alimento y protegerse de los agentes toxicos.

Al ser un estudio in vitro, estas capas de biofilm no pueden ser removidas mecanicamente por el cepillado dental, por lo que permiten una continua agregacion bacteriana, y junto con su materia de desecho pueden afectar el efecto antimicrobiano de las NPsAg que se encuentran en la superficie del esmalte adyacente a los brackets. Aunque los resultados del estudio fueron no significativos a los 30 dias, representan un valioso aporte ya que sugieren que el cepillado juega un papel importante en la prevencion se observo una marcada disminucion del efecto de las NPsAg con una media de 11,6 UFC[log.sub.10] y desviacion estandar de 1,7 para el grupo de tratamiento (adicionado con NPsAg) y una media de 11,5 UFC[log.sub.10] con desviacion estandar de 1,6 para el grupo control, no encontrandose diferencia significativa entre ambos grupos. Se determino la significancia entre los grupos al dia 15, no asi en la toma basal y al dia 30. (Tabla I).

DISCUSION

Actualmente, gran parte de la poblacion recurre a tratamientos ortodoncicos con el fin de conseguir mayor estetica dental, para lo cual es necesario el uso de brackets. Los tratamientos de ortodoncia con aparatologia fija tienen un gran efecto sobre la desmineralizacion del esmalte ya que estos crean, debido a la rugosidad de su superficie, un ambiente favorable para la acumulacion de microorganismos (10). La desmineralizacion durante el tratamiento es la complicacion mas frecuente y se hace evidente en el primer mes de la colocacion de la aparatologia de ortodoncia (11).

A pesar de la disponibilidad de diversos protocolos para el uso de fluoruros en pacientes con tratamiento de ortodoncia, estos materiales no han demostrado un efecto inhibitorio en la desmineralizacion del esmalte dental (1-5). Son muchos los estudios en distintos campos de la medicina que han utilizado NPsAg y reportan su eficacia antimicrobiana (7-23).

En el 2005, Elechiguerra y col.demostraron el efecto bactericida de las NPsAg (1 y 10 nm) sobre E.coli, P aeruginosa, V cholerae y S. typhus. El efecto bactericida de las NPsAg ha sido demostrado en diversos microorganismos como P aeruginosa, S. aureus, E coli, S. typhi y V cholerae observandose una inhibicion en la reproduccion bacteriana, penetracion de las NPsAg al nucleo y destruccion de DNA (14). En el presente estudio se propuso el uso de NPsAg para reducir la carga bacteriana presente en el esmalte adyacente a la aparatologia de ortodoncia, por ello se sintetizaron y adicionaron a un medio adhesivo de uso diario para el ortodoncista, en el cual mediante el cementado normal de brackets y sin repercusiones en el nivel de adhesion al esmalte pudiera tener un efecto positivo en la reduccion de las bacterias formadoras de manchas blancas como S. mutans, S. mitis, S. salivaiious. S. sanguis y Lactobacillus. El diseno de este estudio permitio tener un mayor control en el laboratorio para identificar y aislar las bacterias involucradas en el desarrollo de manchas blancas en el esmalte dental, y el aislamiento de cepas de las bacterias estudiadas, que permitieron imitar en gran medida las condiciones existentes en la boca. En el laboratorio se pudieron manejar los mas altos estandares de asepsia; el estudio fue realizado por un solo operador entrenado asegurando una toma basal con cero carga bacteriana, trabajando en un ambiente esteril como el que brinda la campana de flujo laminar, evitando que los resultados del mismo se debieran a un factor externo. En cuanto a la seleccion de los organos dentarios de interes, se tuvo cuidado de que cumplieran con los criterios de inclusion, y fueron asignados en los grupos control y de tratamiento (con NPsAg) de manera aleatoria para tener la seguridad de que tuvieran caracteristicas similares y asi evitar que los resultados fueran alterados por algun factor externo.

El conteo de UFC en placas de agar es una tecnica validada por Gaitan-Fonseca y col. (24); es una tecnica fidedigna, reproducible, facil de realizar y mas economica que otras tecnicas usadas; por tales ventajas se eligio esta tecnica, la cual arrojo resultados que entraron en los rangos establecidos 25-250, tal como otros autores han reportado (24).

Los resultados obtenidos en este estudio en la toma a los 15 dias, tuvieron valor significativo (p= 0,02) y son corroborados por estudios de la desmineralizacion del esmalte adyacente a la aparatologia fija.

En la literatura no se encontraron estudios similares que permitan establecer el efecto de las NPsAg al ser combinadas con el cepillado dental por periodos mayores de tiempo, y con la concentracion exacta de bacterias en el medio oral, asi como las diversas especies que coexisten en ella, por lo que es necesario que se realicen estudios in vivo que aporten mas informacion sobre la eficacia de las NPsAg.

De acuerdo a nuestros resultados, la adicion de NPsAg al primer de ortodoncia es eficaz en la disminucion de carga bacteriana causante de la desmineralizacion y formacion de manchas blancas y caries.

La actividad antimicrobiana de las NPsAg se vio disminuida con respecto al tiempo de la toma de muestra de los 15 dias a los 30 dias; esto puede ser debido a la falta de una accion de limpieza mecanica como la que confiere el cepillado dental que remueve los restos de desecho de los microorganismos, pudiendo esto cubrir las NPsAg en el esmalte adyacente a la aparatologia de ortodoncia disminuyendo su efectividad antimicrobiana, se necesitan estudios clinicos in vivo que permitan evaluar el poder de las NPsAg actuando en un medio bucal vivo con todos sus componentes. Las NPsAg tienden a inhibir selectivamente a las bacterias sin causar toxicidad en celulas de mamiferos. Algunos estudios han puesto de manifiesto la correlacion positiva entre la concentracion de NPsAg y efectos citotoxicos. Sin embargo, la ausencia de citotoxicidad contra celulas humanas se demostro cuando concentraciones de NPsAg de 0,05-0,70% fueron incorporados (26,27). La toxicidad por la exposicion aguda a iones de plata es relativamente baja; las principales vias de exposicion reportadas comprenden la inhalacion, ingestion, topica dermica, urologica y hematogena. La exposicion cronica puede llevar al deposito de particulas en la piel (argiria), ojos (argirosis) y otros organos (28).

De acuerdo a nuestros resultados, la adicion de NAg al prime rortodoncico es eficaz en la disminucion de carga bacteriana causante de la desmineralizacion formando manchas blancas y caries. En virtud de los resultados de este estudio, se concluye que la adicion de NAg al primer ortodoncico es eficaz en la disminucion de carga bacteriana causante de la desmineralizacion formando manchas blancas y caries.

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Humberto Mariel Murga, Rene Centeno Sanchez, Wulfrano Sanchez Meraz, Ana Maria Gonzalez Amaro, Raymundo Arredondo Hernandez, Jairo Mariel Cardenas y Francisco Javier Gutierrez Cantu.

Facultad de Estomatologia, Universidad Autonoma de San Luis Potosi. San Luis de Potosi, Mexico. Recibido: 01-02-2016. Aceptado: 30-06-2016

Autor de correspondencia: Francisco Javier Gutierrez Cantu. Facultad de Estomatologia, Universidad Autonoma de San Luis Potosi. Av. Dr. Manuel Nava #2, Zona Universitaria, C.P. 78290; San Luis Potosi, Mexico. Telefono: 52 (444) 826 23 57 ext.5122. Fax: 52 (444) 826 23 57. Correo electronico: pacogtz@uaslp.mx
CARGA BACTERIANA EN [LOG.sub.10] UFC EN LOS GRUPOS EN ESTUDIO EN LOS
DIAS 1,15 Y 30 DESPUES DE APLICADO EL TRATAMIENTO

               Dia 1                               Dia 15

Control n= 20      NPSAg n= 20       Control n= 20      NPSAg n= 20

0                      0           10,8[+ o -] 0,8   9,6 [+ o -] 1,4*
                                      (9,1-12,1)         (6,5-12,2)

               Dia

 Control n= 20       NPSAg n= 20

11,5 [+ o -] 1,6   11,6[+ o -]1,7**
   (8,4-14,6)         (7,8-14,4)

Las cifras representan el promedio [+ o -] desviacion estandar
(minimo-maximo)

* p < 0,02 en comparacion con el control

** p = 0,82 en comparacion con el control
NPSAg: nanoparticulas de plata
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Author:Murga, Humberto Mariel; Centeno Sanchez, Rene; Sanchez Meraz, Wulfrano; Gonzalez Amaro, Ana Maria; A
Publication:Investigacion Clinica
Date:Dec 1, 2016
Words:4208
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