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Effect of ultraviolet B radiation on the production of polyphenols in the marine microalga Chlorella sp./Efecto de la radiacion ultravioleta B en la produccion de polifenoles en la microalga marina Chlorella sp.

INTRODUCCION

La radiacion solar en el rango UV-B (280-315 nm) tiene un alcance a profundidades significativas, dependiendo de la presencia de compuestos luzabsorbentes como materia organica disuelta, organismos fotosinteticos y materia inorganica (Hargreaves, 2003) , produciendo un efecto ecologico en muchos ecosistemas de agua dulce y marinos (Hader et al., 1998). Ha sido muy bien reportado el adelgazamiento de la capa de ozono estratosferico sobre la Antartica y Artico, asi como disminuciones moderadas (20-30%) de este sobre la columna de agua a partir de los 79[grados]N y latitudes medias (a partir de los 27[grados]N) (Hader et al., 1998). Los efectos deletereos del estres producidos por la radiacion UV en microalgas incluyen la inhibicion de la fotosintesis (Hughes, 2006); dano al ADN, proteinas y lipidos (Karentz et al., 1991); generacion de especies reactivas de oxigeno ROS (Estevez et al., 2001) e inhibicion en la asimilacion de nutrientes (Shelly et al., 2006).

El estres oxidativo es definido como la produccion creciente de especies ROS, en cantidades que exceden las defensas antioxidantes celulares (Moskaug et al., 2005). La consecuencia del estres oxidativo puede involucrar dano a lipidos, proteinas y ADN, con el desarrollo de patologias y el envejecimiento subsecuente (Finkel & Holbrook, 2000). Los vegetales sintetizan compuestos bioactivos con caracteristicas antioxidantes, conteniendo diversas estructuras fitoquimicas, cuya mayor fraccion esta conformada por polifenoles (Scalbert & Williamson, 2000), encontrando taninos, lignanos y flavonoides (Kuskoski et al., 2004) . Muchos polifenoles tienen caracteristicas antioxidantes (e.g. reductoras) y pueden reaccionar directamente con las especies reactivas ROS, formando productos menos reactivos (Moskaug et al., 2005). Estos compuestos fitoquimicos son producidos por las plantas como mecanismo de defensa a diversos factores que pueden provocar estres, como herbivoria (Pavia et al., 1997), radiacion ultravioleta (UV) (Malanga et al., 1995, 1997; Cantos et al., 2000; Duval et al., 2000; Zudaire & Roy, 2001; Rijistenbil, 2002; Hernando et al., 2005, 2006; Bouchard et al., 2005; Janknegt et al., 2009) y variaciones de temperatura (Wong et al., 2007).

Muchos organismos producen diferentes sustancias capaces de absorber luz ultravioleta (Cockell & Knowland, 1999; Rozema et al., 2002). Dentro de estos compuestos se encuentran los denominados "pantalla" como las MAAs (Mycosporine-like aminoacids) producidas por muchas algas y algunas cianobacterias (Bjorn, 2007). Estudios en plantas vasculares han demostrado que la RUV-B (280-315 nm) estimula las vias de produccion de algunos metabolitos incluyendo polifenoles y flavonoles (Tevini, 1993) que han demostrado ser compuestos atrapadores de radiacion UV (Reuber et al., 1996), reduciendo al maximo los danos en las funciones fisiologicas normales de sus tejidos. Ademas, existen trabajos que evidencian la presencia de compuestos fotoprotectores de radiacion UV en algas (Garcia-Pichel et al., 1992; Gomez et al., 1998; Hoyer et al., 2001).

Se han realizado diversos estudios en macro y microalgas: Chlamydomona nivalis (Duval et al., 2000), C. augustae, Naviculla incerta (Wong et al., 2007), Chlorella sp. (Estevez et al., 2001; Vimalabai & Kulandaivelu, 2002; Wong et al., 2007), Isochrysis galbana (Vimalabai & Kulandaivelu, 2002), Ascophyllum nodosum (Pavia et al., 1997) y Ulva fasciata (Shiu & Lee, 2005), entre otras, para evaluar la resistencia y el efecto a la exposicion de radiacion UV. Existen evidencias que organismos como las microalgas pueden presentar respuestas adaptativas a la exposicion de radiacion UV, aumentando los niveles de polifenoles a modo de fotoproteccion (Estevez et al., 2001; Duval et al., 2000). Este proceso puede ser utilizado como un mecanismo de gran utilidad para la produccion de antioxidantes de origen natural, la seleccion de organismos vegetales mas adaptados y su exposicion a radiaciones UV controladas para aumentar la produccion de fitocompuestos (polifenoles) a traves de la respuesta fotoprotectora de estas algas. Dada la importancia que revisten las microalgas en los ecosistemas acuaticos en la produccion primaria y tramas troficas, resulta importante conocer la capacidad de respuesta de estos organismos a la RUV-B. Por esta razon, el objetivo de esta investigacion es evaluar la estrategia de adaptacion al efecto de la radiacion ultravioleta B en la microalga marina Chlorella sp. a traves de la produccion de polifenoles y capacidad antioxidante total.

MATERIALES Y METODOS

Obtencion de cultivos

En todos los cultivos, la biomasa inicial fue de 4.150.000 celulas [mL.sup.-1] proveniente de un cultivo madre de Chlorella sp., obtenido en el Laboratorio de Ficologia, Facultad de Ciencias del Mar y Recursos Naturales, Universidad de Valparaiso. A partir de este se inicio un cultivo stock de 50 mL utilizando agua destilada y medio nutritivo, compuesto por cinco soluciones stock, las cuales contenian: micronutrientes, macronutrientes, Fe-EDTA, elementos traza y NaH-C[O.sub.3] (agregado solo en el tiempo inicial) descrito por la Norma Chilena Oficial (NCh 2706.Of2002), bajo luz PAR (Photosnthetically Active Radiation) con una exposicion a luz continua de intensidad 190 [+ o -] 10 [micron]mol [m.sup.-2] [s.sup.-1] de 24 h luz y temperatura ambiente (18-20[grados]C). Los cultivos fueron mantenidos bajo las mismas condiciones que el cultivo stock hasta alcanzar la fase exponencial, determinada a traves de conteos celulares diarios, con un microscopio optico, utilizando una camara de Neubauer, determinandose la fase de crecimiento de los cultivos. La exposicion a luz continua se mantuvo con la sola excepcion del periodo de irradiacion que se detalla en la siguiente seccion.

Irradiacion de cultivos

Para lograr el crecimiento microalgal que permitiera hacer las determinaciones de los parametros medidos, se realizo preliminarmente una experiencia para determinar la intensidad de la radiacion requerida (470 [micro]W [cm.sup.-2]). A partir del cultivo stock de Chlorella sp. se iniciaron cuatro nuevos cultivos, uno denominado "control" (C) (realizado por triplicado para cada uno de los cultivos) y tres "experimentales" (R1, R2 y R3), siendo estos ultimos los que fueron expuestos a diferentes dosis de radiacion UV-B. Por cada tratamiento se consideraron tres replicas. En las etapas 1 a 3, la irradiacion se realizo a partir del 5 dia, durante tres dias consecutivos por periodos de 10, 20 y 30 min respectivamente, correspondiente a dosis de 2820, 5640 y 8460 J [m.sup.-2] respectivamente con agitacion manual cada 1 min. En la cuarta etapa los cultivos (R1, R2 y R3) fueron irradiados igualmente durante tres dias consecutivos, pero 60 min cada dia (16.920 J [m.sup.-2]).

Diseno experimental

A partir del cultivo control y los cultivos experimentales (irradiados) de la primera etapa, al dia siguiente de cada termino de exposicion, se obtuvieron los inoculos para iniciar la nueva etapa de cultivo ([2.sup.a] etapa). Una vez iniciados los nuevos cultivos, se mantuvieron bajo las mismas condiciones que la etapa anterior, hasta alcanzar el crecimiento exponencial. Posteriormente, los tres cultivos experimentales ([R.sub.1], [R.sub.2] y [R.sub.3]) nuevamente fueron expuestos radiacion UV-B (470 [micro]W [cm.sup.2]) durante tres dias consecutivos con dosis de 2.820, 5.640 y 8.460 J [m.sup.-2] con agitacion manual cada 1 min ([2.sup.a] y [3.sup.a] etapa). En la ultima etapa ([4.sup.a] etapa) los cultivos fueron irradiados por tres dias consecutivos 1 h (16.920 J [m.sup.-2]) cada dia, a fin de determinar el efecto deletereo del aumento de la dosis de RUV-B. La determinacion de los parametros de capacidad antioxidante, polifenoles asi como clorofila-a y b fueron determinados al finalizar cada etapa (1a a 4a) experimental.

Obtencion de extractos

Al termino de cada etapa de irradiacion de cultivo (posterior a las irradiaciones) se tomaron 50 mL de cada cultivo (C, [R.sub.1], [R.sub.2], [R.sub.3]) los cuales fueron centrifugados en tubos tipo Falcon (previamente pesados) a 4.000 rpm durante 15 min a 10[grados]C con una centrifuga Hettich Universal K2S, el sobrenadante fue eliminado por trasvasije y se conservo el precipitado (celulas microalgas). Los tubos fueron pesados nuevamente para determinar la biomasa (peso humedo) de microalgas y luego se agrego 1 mL de etanol p.a. al 99,9% por cada 200 mg de microalgas. Las celulas en etanol fueron sonicadas durante 2 h a temperatura ambiente en un sonicador Elma Transsonic T310. El homogenizado celular (celulas/etanol) obtenido despues de la sonicacion fue centrifugado a 4.000 rpm durante 10 min a 10[grados]C, el precipitado fue descartado y el sobrenadante (extracto) fue guardado en tubos Eppendorf 1,5 mL, almacenados en frio y oscuridad para su posterior analisis. Esto se repitio al termino de cada etapa de irradiacion para las etapas 1, 2 y 3; sin embargo, en la 4a etapa se realizo una extraccion etanolica posterior a cada irradiacion, por lo que el total de extractos algales obtenidos fueron seis (extractos I, II, III, IV(a), IV(b) y IV(c)). Las mediciones se hicieron inmediatamente despues de cada etapa.

Determinacion de la capacidad antioxidante del extracto

Para determinar la capacidad antioxidante del extracto etanolico se utilizo el metodo de atrapamiento del radical libre DPPH (2,2 difenil-1-hidracilo), el cual es estable y presenta una intensa coloracion violeta que absorbe la longitud de onda de 517 nm (Antolovich et al., 2002; Kohler et al., 2007). Los valores obtenidos fueron expresados en porcentaje de DPPH (Kohler et al., 2007).

Se realiza el calculo del porcentaje de inhibicion, RSA, en base a la disminucion de la concentracion en el tiempo considerando el valor de concentracion inicial (Ley de Lambert-Beer) RSA% = [A0-Ac/A0)] x 100. Donde A0 es la medicion de absorbancia a tiempo 0, y Ac la absorbancia al tiempo final.

Determinacion de polifenoles totales

Para la determinacion de polifenoles totales se utilizo el metodo Folin-Ciocalteu (Waterman & Mole, 1994; Kohler et al., 2007). Los resultados obtenidos fueron expresados en equivalentes de acido galico (EGA) (Kohler et al., 2007).

Determinacion de clorofilas-a y b

Para la determinacion de clorofilas-a y b, se usaron los mismos extractos utilizados en los analisis de DPPH y polifenoles totales. Previamente a las mediciones se calibro el equipo utilizando clorofila-a y b (Sigma). El calculo del contenido de los pigmentos se realizo de acuerdo a las ecuaciones descritas por Gonzalez et al. (2001):

Clorofila-a ([micron]g [mL.sup.-1]) = 13,96 * [A.sub.665] -6,88 * [A.sub.649]

Clorofila-b ([micron]g [mL.sup.-1]) = 24,96 * [A.sub.649] -7,32 * [A.sub.665]

Determinacion de la tasa de crecimiento

Se calculo en base a la formula:

[micron] = [ln(Nt) - ln([N.sub.0])] / ln2 (t-[t.sub.0])

donde: t: tiempo transcurrido entre el inicio y fin del prueba, [t.sub.0]: tiempo inicial, [N.sub.0]:densidad celular inicial, [N.sub.t]: densidad celular final.

Analisis estadistico de los resultados

Mediante el programa computacional STATISTICA 7.0 los resultados obtenidos de DPPH, polifenoles totales y clorofilas, para los diferentes extractos, fueron sometidos al cumplimiento de los supuestos estadisticos (independencia, normalidad y homocedasticidad) necesarios para aplicar un ANOVA (analisis de varianza a una via). Dado que los datos no cumplieron con todos los supuestos, se les aplico el test no-parametrico de Kruskal-Wallis, para determinar diferencias estadisticamente significativas entre los extractos.

RESULTADOS

La etapa inicial de cultivo denominada tambien "1a etapa", fue aquella donde por primera vez las microalgas fueron expuestas a radiacion UV-B. En esta etapa los cultivos mantuvieron un comportamiento similar al control hasta el 5 dia (inicio irradiacion); sin embargo, posterior a este dia se observo un marcado decaimiento en la densidad celular de los cultivos expuestos (irradiados), en comparacion el cultivo control (C) (Fig. 1). A partir del 5 dia de cultivo, la densidad celular en los cultivos experimentales disminuyo en comparacion al control con excepcion de la 4a etapa y al noveno dia todos presentaron una disminucion significativa en su densidad celular en comparacion al cultivo control (P < 0,05) (Fig. 1).

La segunda fase experimental ([2.sup.a] etapa), podria ser considerada como etapa intermedia o de transicion, ya que, si bien los cultivos hasta el 5[degress] dia mantuvieron la misma tendencia que en la [1.sup.a] etapa, posteriormente los cultivos expuestos (irradiados) presentaron una estabilizacion en la densidad celular (Fig. 1). No obstante, la densidad maxima obtenida por el control fue superior al promedio obtenido por los experimentales, como se aclara en el comentario de la Tabla 1.

En la tercera fase experimental (3a etapa), se observo un aumento en la densidad de los cultivos experimentales (irradiados) a la exposicion de radiacion UV-B, los cultivos nuevamente mantuvieron la misma tendencia hasta el 5 dia y a partir del 6 dia la densidad fue mas baja que la del cultivo control, pero en ningun momento dejo de aumentar. La densidad celular de los cultivos aumento lentamente con valores promedio de 2.033.333, 3.133.333 y 3.500.000 cel [mL.sup.-1] para los dias 7, 8 y 9 respectivamente, pero siempre inferior al cultivo control que alcanzo densidades celulares de 3.343.750, 4.768.750 y 5.650.000 cel [mL.sup.-1] para los mismos dias (Fig. 1).

En la Tabla 1, se observaron diferencias significativas tanto entre las etapas, como entre los dias y la interaccion de estos factores (P < 0,000001 para cada caso). En general, la prueba a posteriori mostro que entre las etapas, la 4a y el control no difieren significativamente (P = 0,297). Sin embargo, si existen diferencias significativas entre estas y las etapas 1, 2 y 3 (P < 0,0005). El control mostro ser diferente a las etapas 1, 2 y 3, desde el dia 5 de tratamiento al 9 (P < 0,005) y diferente a la etapa 4 solo el 9 dia de exposicion a RUV (P = 0,007). La 4a etapa mostro diferencias significativas con las etapas 1, 2 y 3 desde el 5 al 8 dia (P < 0,0005), observandose una caida en la densidad celular en el 9 dia de tratamiento, lo que produjo que no existieran diferencias en ese dia (P = 0,357) (Tabla 1).

La tasa de crecimiento muestra similar comportamiento que la densidad celular, con excepcion del dia 3 de tratamiento, donde se observaron diferencias significativas entre el control y las etapas 1, 2 y 3 (P < 0,05) (Tabla 2).

Los resultados de DPPH medidos en los extractos microalgales indicaron una leve capacidad antioxidante, obteniendo valores promedios de 0,9 a 5,6% (con sumo de DPPH), siendo los mas altos 3,9; 5,3 y 5,7%, para los extractos "C" (Control), "IV(b)" y "IV(a)" (cultivos irradiados) respectivamente (Fig. 3).

[FIGURA 1 OMITIR]

Los resultados de "polifenoles totales" obtenidos de los extractos microalgales van desde 0,12 a 0,39 [micro]g [mg.sup.-1] de celulas, siendo los valores mas altos 0,25; 0,27; 0,30; y 0,39 [microN] g [mg.sup.-1] de celulas para los extractos "C" (Control) "IV(b)", "III" y "IV(a)" (cultivos irradiados) respectivamente (Fig. 4).

Los resultados obtenidos en ambas clorofilas-a y b presentan tendencias muy similares presentando una alta correlacion ([R.sup.2 = 0,92) estadisticamente significativa (P < 0,05). El efecto negativo de la radiacion UV-B se observo al final de la primera fase de irradiacion, disminuyendo ambos tipos de clorofilas Sin embargo, a partir de la segunda fase (Etapa 2) las concentraciones tanto de clorofila-a como b comenzaron a aumentar hasta llegar a un nivel maximo alcanzado en la cuarta fase (extracto IV(b)), inmediatamente despues de esta los extractos no presentaron diferencias significativas (Figs. 5 y 6).

DISCUSION

La dosis de radiacion utilizada es similar a la utilizada en otros ensayos con distintas especies (Duval et al., 2000; Estevez et al., 2001; Vimalabai & Kulandaivelu, 2002; Wong et al., 2007), en ensayos previos se determino la dosis que no produjera una eliminacion importante de microalgas.

Las respuestas de las microalgas (irradiadas) frente a la radiacion UV-B determinadas en las distintas fases de cultivo pueden ser clasificadas en dos grupos. La primera comprende la 1a y 4a etapa, donde hay un efecto negativo sobre las microalgas, reflejado en la baja de la densidad y crecimiento celular a partir del octavo dia. En estudios similares se ha atribuido dicho efecto a dano a proteinas y ADN, efecto descrito por Xiong (2001), inhibicion en la absorcion de nutrientes (Guan, 2008) y la inhibicion fotosintetica (Aguilera et al., 2008). Sin embargo en la 3a etapa la densidad y el crecimiento celular se recuperaron despues de la 1a y [2.sup.a] etapa indicando que las microalgas lograron alcanzar una "respuesta adaptativa". Este acondicionamiento ha sido descrito por otros autores como un mecanismo de sobrevivencia. Helbling et al. (1992) indican que el fitoplancton de bajas latitudes no exhibe una disminucion en la capacidad fotosintetica frente a los altos niveles de radiacion UV a que esta expuesto, dando lugar a la hipotesis de que estaria adaptado evolutivamente en comparacion al fitoplancton de zonas polares.

Algunos autores indican que las microalgas muestran tasas de crecimiento mayores frente a la radiacion UV-B (Vimalabai & Kulandaivelu, 2002), mientras que otros autores indican que la fotoadaptacion de las microalgas se puede conseguir inclusive en menos de 24 h (Prezelin & Matlik, 1980). Estudios recientes (Wong et al., 2007; Guan et al., 2011) senalan que la sensibilidad de las microalgas a la RUV-B, es especie-especifica y depende de la region biogeografica. En el primer trabajo se compararon nueve microalgas, Chlorella antartica fue la mas tolerante a la radiacion, lo que resulto sorprendente, puesto que se esperaba que la Chlorella tropical fuese mas adaptada a altos niveles de radiacion en los tropicos, que la especie antartica. Una posible explicacion seria su eficiencia para defenderse de los radicales libres a traves de la produccion de antioxidantes, tales como [alpha]-tocoferol, [beta]-caroteno y tioles como lo senala por Estevez et al. (2001). El Guan et al., (2008) muestran que C. curvisetus es sensible a la RUV pero es capaz de aclimatarse rapidamente (aprox. seis dias), sintetizando compuestos que absorben la radiacion UV y aumentando la velocidad de procesos de reparacion de proteina D1 en el PSII. En nuestro caso, la produccion de polifenoles y el aumento de la capacidad antioxidante de Chlorella sp., seria la respuesta al estres oxidativo inducido por RUV-B.

Los valores de capacidad antioxidante total, medidos por el metodo DPPH, podrian ser considerados bajos comparados con los obtenidos por otros autores en diversas algas. Vidal et al. (2006), determinaron en extractos acuosos de Bryothamnion triquetrum porcentajes de consumo de DPPH del 50%. Yan et al. (1998), en un screening realizado en 27 algas determinaron valores que van desde 69% hasta 90% en Desmarestia viridis, 755% en Polysiphonia urceolata, 83% en Rhodomela teres y 87% en Gelidium amansii, lo que concuerda con que la respuesta es especie-dependiente. La misma explicacion es valida para los resultados de fenoles totales que son relativamente mas bajos que los obtenidos por Duval et al. (2000) para Chlamydomona nivalis, que fluctuaron entre 0,5 y 0,8 [microN]g [mg.sup.-1] de celulas.

Aunque los niveles obtenidos de DPPH y polifenoles totales fueron relativamente bajos, se pudo apreciar una recuperacion durante el transcurso del experimento. Sin embargo, a pesar que presentaron entre ambos una correlacion alta ([R.sup.2] = 0,73), esta no fue significativa (P > 0,05). El metodo DPPH evalua capacidad antioxidante de cualquier compuesto capaz de atrapar radicales libres, no solamente compuestos fenolicos, lo que podria explicar que la correlacion no fue significativa. En las primeras horas de exposicion al factor estresante (RUV-B), las microalgas mostraron un efecto negativo, disminuyendo densidad, crecimiento celular, capacidad antioxidante y compuestos fenolicos (Figs. 1 a 4). Sin embargo, a partir de la segunda etapa, los cultivos comenzaron a mostrar una aclimatacion a la irradiacion, aunque los valores de densidad-crecimiento celular, capacidad antioxidante y compuestos fenolicos fueron mas bajos que el cultivo control, estos comenzaron a mostrar una tendencia al alza (Figs. 1 a 4). La tendencia mostrada en la [2.sup.a] etapa del cultivo se mantuvo en la [3.sup.a] y [4.sup.a] hasta llegar a un punto critico, donde los efectos negativos sobrepasaron la capacidad de respuesta, observandose una considerable disminucion en los factores medidos (Figs. 1 y 2). Havelkova-Dousova et al. (2004) estudiaron la aclimatacion de D. tertiolecta, a regimenes de irradiancia simulando condiciones de turbidez de aguas estuarinas o lagos, encontrando que los mecanismos operan a escalas cortas de tiempo manteniendo la capacidad de disipacion no fotoquimica de la energia, que no interfiere con la sintesis de pigmentos. Bhandari & Sharma (2011) evaluaron el efecto de la RUV-B y RUV-B suplementada con luz PAR de baja intensidad sobre la fotosintesis, pigmentos fotosinteticos, fosfogliolipidos, dano oxidativo, enzimas antioxidantes y compuestos filtros de RUV-B en la microalga Phormidium tenue, encontrando que la fotosintesis fue afectada y que el principal sistema protector fue la sintesis de aminoacidos tipo micosporina y compuestos tipo escitonemina, mas que enzimas antioxidantes como la superoxido dismutasa.

[FIGURA 2 OMITIR]

[FIGURA 3 OMITIR]

La respuesta de las microalgas que se aprecio durante el experimento puede ser asociada a un fenomeno llamado "Hormesis", que se define como la relacion entre dosis y la respuesta, caracterizada por estimulacion a bajas dosis e inhibicion a altas dosis. Cuando los niveles de irradiancia son bajos o cuando la velocidad de mezcla, dentro de la capa superior de mezcla, es relativamente rapida, las longitudes mayores de la RUV pueden favorecer la fotosintesis en el fitoplancton (Barbieri et al., 2002; Helbling et al., 2003). Aunque en este trabajo no se midio la fotosintesis, el hecho que a partir de la [2.sup.a] etapa las concentraciones tanto de clorofila-a como b comenzaron a aumentar hasta llegar a un nivel maximo en la [4.sup.a] etapa, seria indicativo de un aumento de la fotosintesis. Las clorofilas son los pigmentos fotosinteticos mas importantes para los vegetales, de ahi es la necesidad y prioridad de ser protegidos por estos organismos. Dentro de los mecanismos descritos para evitar o disminuir el dano por exceso de energia, se encuentran aquellos que disipan este exceso de energia. Dodd et al. (1998) describieron a los antocianos (polifenoles) como compuestos "pantalla" que reducirian la cantidad de luz absorbida por las clorofilas. Garcia-Pichell (1994) propuso un modelo teorico para evaluar el efecto de materiales celulares en la eficiencia de los compuestos que actuan como pantallas solares (fenomeno conocido como "autosombreado" o self-shading), y que es dependiente del tamano y forma del organismo. Considerando que el alga utilizada en este estudio tiene un tamano entre 2 y 6 [micron]m, clasificada como nanoplacton, este efecto podria estar presente y explicar la baja produccion de compuestos fenolicos debido a la amortizacion en la intensidad de la RUV incidente debido a la elevada biomasa fitoplanctonica, por tanto, la baja produccion no implicaria ineficiencia en el mecanismo de proteccion. El aumento en la produccion de polifenoles totales a partir del extracto "II" conduciria a un aumento de las clorofilas, ya que habrian actuado como pantalla absorbiendo el exceso de energia luminica. La densidad celular se observa muy afectada en la 4a etapa (muestra de la cual se obtuvo el extracto IV(c), luego de tres dias consecutivos de 1 h de exposicion a la RUV-B (Fig. 1). Sin embargo, este resultado no concuerda con los valores de clorofila-a y b donde los valores no disminuyen significativamente al compararlos con la 4a etapa (muestra de la cual se obtuvo el extracto IV(b) (Figs. 5 y 6). Esto sugiere un mecanismo compensatorio aumentando la produccion de clorofila por muerte celular.

[FIGURA 4 OMITIR]

[FIGURA 5 OMITIR]

[FIGURA 6 OMITIR]

Estos resultados podrian atribuirse a que la RUV podria afectar de diferente manera los dos principales blancos (la molecula de ADN y los fotosistemas), como fue sugerido en estudios desarrollados por Buma et al. (2001) y Helbling et al. (2001) en ecosistemas acuaticos templados.

El dano generado por la radiacion UV sobre los organismos marinos ha sido documentado desde las primeras investigaciones marinas que se han llevado a cabo (Steemann, 1964). Estos organismos han desarrollado una serie de respuestas fotoprotectoras para evitar o disminuir al maximo este dano (Wong et al., 2007). En el caso que se haya generado dano, existen mecanismos encargados de repararlo. Asociado a esta capacidad reparadora esta el rendimiento cuantico del fotosistema II (PSII) (Neale et al., 2000; Guan et al., 2011). Dicho fotosistema es el principal danado por dosis elevadas de radiacion y es de gran importancia pues en el se inicia el proceso de fotosintesis. Cuando este factor logra el equilibrio indica que existe una fotoadaptacion del sistema, lo cual explicaria la disminucion significativa tanto en la clorofila-a como b, despues del maximo observado en la 4a etapa, extracto IV(b) (Figs. 5 y 6).

Finalmente, con dosis UV-B controladas, consecutivas y ascendentes en el tiempo, es posible lograr una respuesta en la microalga Chlorella sp. expresada en los niveles de fenoles totales alcanzados en la 4a etapa de cultivo irradiado que supero significativamente a los alcanzados por el cultivo control, lo que constituye un mecanismo de proteccion en estos organismos.

DOI: 10.3856/vol40-issue1-fulltext-11

AGRADECIMIENTOS

Al Laboratorio de Ficologia, Facultad de Ciencias del Mar y Recursos Naturales de la Universidad de Valparaiso, que facilitaron los cultivos del Chlorella sp.

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Received: 24 January 2011; Accepted: 9 January 2012

Jaime Copia (1), Hernan Gaete (2,3), Gustavo Zuniga (4), Maria Hidalgo (1) & Enrique Cabrera (1)

(1) Facultad de Ciencias, Universidad de Valparaiso, Av. Gran Bretana 1111, Playa Ancha, Valparaiso, Chile

(2) Departamento Biologia y Ciencias Ambientales, Universidad de Valparaiso, Av. Gran Bretana 1111 Playa Ancha, Valparaiso, Chile

(3) Centro de Investigacion y Gestion de Recursos Naturales CIGREN, Universidad de Valparaiso Av. Gran Bretana 1111, Playa Ancha, Valparaiso, Chile

(4) Facultad de Quimica y Biologia, Universidad de Santiago de Chile, Avenida Bernardo O'Higgins 3363 Santiago de Chile, Chile

Corresponding author: Maria E. Hidalgo (maria.hidalgo@uv.cl)
Tabla 1. Resultados analisis de varianza ANOVA de dos vias para los
datos de densidad celular por dia y etapa de irradiacion.

Table 1. Two-way ANOVA for the analysis of cellular biomass data
for day and stage of irradiation.

                  SS       gl        MS          F         P

Etapa + Dia   2,66E + 14    1    2,66E + 14   702,583   0,00000
Etapa         1,91E + 13    4    4,77E + 12   12,602    0,00000
Dia           2,44E + 14    8    3,05E + 13   80,635    0,00000
Error         4,96E + 13   131   3,79E + 11

Tabla 2. Resultados analisis de varianza ANOVA de dos vias para los
datos de crecimiento celular por dia y etapa de irradiacion.

Table 2. Two-way ANOVA for the analysis of data cell growth for
day and stage of irradiation.

                  SS     gl       MS         F          P

Etapa + Dia   3,208211    1    3,208211   1861,152   0,000000

Etapa         0,107042    4    0,026761   15,524     0,000000

Dia           1,697337    8    0,212167   123,083    0,000000

Error         0,225815   131   0,001724
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Title Annotation:microalga marina Chlorella sp
Author:Copia, Jaime; Gaete, Hernan; Zuniga, Gustavo; Hidalgo, Maria; Cabrera, Enrique
Publication:Latin American Journal of Aquatic Research
Date:Mar 1, 2012
Words:5858
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