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Effect of the nicotine on actived phagocytes/ Efeito da nicotina sobre fagocitos ativados.

Introducao

A nicotina (NIC); ([3-(1-metil-2-pirrolidinil) piridina; e uma amina terciaria composta pelos aneis piridina e pirrolidina e representa o principal componente farmacologico do tabaco. A atividade farmacologica da NIC deve-se principalmente a sua interacao com receptores colinergicos do tipo nicotinicos, resultando na liberacao de catecolaminas vasoativas e peptideos neuroativos que medeiam sensibilidade e a tolerancia para este composto (BENOWITZ, 2010). Seu metabolismo e hepatico e ocorre em duas etapas (NAKAJIMA et al., 2006): i) mediada pelo sistema citocromo [P.sub.450] formando o ion nicotina-[[DELTA].sup.1'(5')] iminium e ii) mediada pela aldeido oxidase, sendo formada a cotinina, sendo esta ultima, quantitativamente o metabolito mais importante da NIC.

Grande parte dos estudos que envolvem NIC se relaciona com seus efeitos sobre o sistema nervoso central e periferico, pouco se conhecendo sobre seus efeitos em outros tecidos, celulas individuais e sistemas enzimaticos.

Em fagocitos, ha presenca de receptores naocolinergicos especificos para a NIC, principalmente em leucocitos polimorfonucleares (LPMN) (DAVIES et al., 1982), sendo sugerido que alguns dos efeitos adversos do fumo do cigarro, observados nas funcoes dos LPMN, podem estar relacionados a esses receptores, especialmente pelo fato de que fumantes tem maior expressao desses receptores. A NIC exerce efeito citotoxico sobre LPMN naoativados, em concentracoes proximas aquelas encontradas na cavidade oral e no fluido broncoalveolar de fumantes.

A NIC potencializa a producao de anion superoxido ([O.sub.2.sip.*-]) em neutrofilos, induzido por acetato de forbol miristato (PMA), sendo que esse efeito nao foi inibido na presenca de antagonistas de receptores nicotinicos, corroborando com outros dados na existencia da acao nao-colinergica (GILLESPIE et al., 1987; WETSCHER et al., 1995).

Em contrapartida aos estudos anteriores, foi observado que a NIC exerce in vitro alteracoes no metabolismo oxidativo de macrofagos alveolares de cobaias (OGUNBIYI; MISRA, 1989), com reducao dose-dependente da quimiluminescencia dependente do luminol e da producao do [O.sub.2.sup.*-], quando estes foram estimulados por zymosan opsonizado ou PMA. Alem disso, foi demonstrado o efeito adverso da NIC na respiracao (consumo de [O.sub.2]) e no sistema ATPase de macrofagos alveolares, com acao bifasica: estimulante em baixas concentracoes e inibitorio em altas concentracoes (MEYER et al., 1971). Esses estudos demonstram que ainda existem contradicoes sobre o potencial efeito da NIC nos sistemas relacionados ao metabolismo oxidativo de fagocitos, demonstrando a necessidade de mais estudos para melhor observacao nesses modelos.

Tambem, poucos trabalhos avaliaram o efeito da NIC sobre fagocitos ativados, onde ocorre a formacao de especies reativas de oxigenio e liberacao de enzimas proteoliticas. O objetivo deste estudo e verificar o efeito da NIC sobre LPMN e macrofagos quiescentes ou estimulados por zymosan ou PMA, pela medida da viabilidade dessas celulas reveladas pelo teste de exclusao do azul de trypan.

Material e metodos

Reagentes

O tartarato de nicotina, zymosan, PMA e o glicogenio de ostra foram obtidos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Os demais reagentes sao de grau analitico.

Tampao PBS-Dulbecco (PBS-D)

Composicao (g [L.sup.-1]): NaCl 8,0 g [L.sup.-1], KCl 0,2 g [L.sup.-1], [Na.sub.2]HP[O.sub.4] 1,15 g [L.sup.-1], K[H.sub.2]P[O.sub.4] 0,2 g [L.sup.-1], Ca[Cl.sub.2] 0,1 g [L.sup.-1] e Mg[Cl.sub.2]6[H.sub.2]O 0,1 g [L.sup.-1].

Preparo do Zymosan 10 mg [mL.sup.-1]

Para a preparacao do Zymosan, 100 mg do mesmo foram adicionados em 10 mL de agua ultrapura, ferveu-se por 10 min., aproximadamente, ate ficar com consistencia pastosa, centrifugou-se a 200 x g por 5 min. e lavou-se uma vez com PBS-D sem [Ca.sup.++]. Ressuspendeu-se em 10 mL de PBS-D, os quais foram divididos em aliquotas de 1 mL e conservados a -20[degrees]C.

Acetato de forbol miristato-PMA (1 x [10.sup.-5] M)

Dissolveram-se 5 mg de PMA em 8 mL de dimetilsulfoxido (DMSO) obtendo-se uma solucao a 1 x [10.sup.-3] M. A partir dessa solucao diluiu-se em DMSO para a concentracao 1 x [10.sup.-5] M, sendo essas solucoes divididas e estocadas -20[degrees]C em dessecador sob vacuo. Na hora do uso, diluiu-se com PBS-D para concentracao 1 x [10.sup.-6] M.

Solucao Azul de Trypan 0,5%

A solucao de azul de Trypan 0,5% foi preparada em solucao de NaCl 0,85%.

Obtencao dos fagocitos de exsudato peritoneal de ratos (Rattus albinus norvegicus)

Em cada animal (machos, entre 100-160 g), foram injetados intraperitonealmente 10 mL de solucao de glicogenio de ostra a 0,5% em NaCl a 0,85%. Apos 12h (para a obtencao de neutrofilos) ou 72h (para a obtencao de macrofagos) o animal foi sacrificado e a cavidade abdominal foi lavada injetando-se 5 mL de tampao PBS-D, contendo 10 UI de heparina [mL.sup.-1]; o lavado peritoneal foi colhido em tampao PBS-D sem calcio, por meio de succao com seringa e agulha. Apos, transferido para um tubo conico siliconizado e centrifugado a 200 x g, por 3 min. As celulas sedimentadas foram lavadas duas vezes com PBS-D sem calcio. Apos, as celulas foram centrifugadas por 5 min. a 1.000 x g. As celulas foram novamente lavadas em PBS-D sem calcio e contadas em camara de Newbauer. Durante os experimentos, essas celulas permaneceram em banho de gelo. Os procedimentos experimentais foram aprovados por Comite de Etica em Pesquisa Animal.

Avaliacao da citotoxicidade

Para essa avaliacao, utilizou-se o metodo do corante azul de trypan. O principio desse teste e a nao-incorporacao do corante pelas celulas viaveis. Os ensaios foram realizados em tampao PBS-D a 37[degrees]C, volume final de 0,1 mL. As celulas (LPMN ou macrofagos; 1 x 106 0,1 [mL.sup.-1]) foram incubadas na ausencia ou presenca de diferentes concentracoes de NIC e de estimulo (PMA ou zymosan) por 30 min. Apos, foram adicionados 0.1 mL do azul de trypan, e apos 5 min., as celulas (viaveis ou nao) foram contadas em camara de Newbauer (200 celulas).

Analise estatistica

Os resultados foram expressos como media [+ or -] desvio-padrao. A interpretacao dos resultados foi realizada por meio de analise de variancia (ANOVA), sendo 0,05 o nivel de significancia.

Resultados e discussao

Foram realizados ensaios de citotoxicidade sobre LPMN e macrofagos obtidos por exsudato peritoneal de ratos, pelo metodo da exclusao pelo azul de trypan. Esses ensaios foram realizados na ausencia ou presenca de diferentes concentracoes de NIC e tambem de zymosan ou PMA (esses ultimos estimuladores do surto oxidativo de fagocitos). O zymosan e um antigeno que ativa a celula exercendo o processo de fagocitose, e o PMA e um antigeno soluvel, ativando a cascata de reacoes do fagocito diretamente no citossol.

Pode-se observar pelas Tabelas 1, 2, 3 e 4 que a NIC na presenca das celulas exerce efeito citotoxico, em comparacao com o controle (5% para LPMN e 6% para os macrofagos), sobre LPMN e macrofagos. Mas, esse efeito e sempre inferior_quando comparado com o sistema celulas e estimulo (zymosan: 76% sobre os macrofagos e 17% sobre os LPMN ou PMA: 17% sobre os LPMN e macrofagos). No sistema com a presenca dos LPMN + estimulo + NIC, e perceptivel a ampla diminuicao da citotoxicidade (LPMN + zymosan + NIC: de 6 a 15% e LPMN + PMA + NIC: de 2 a 5% dependendo da concentracao de NIC) comparando com os outros sistemas (LPMN + estimulo e LPMN + nicotina). Ja em relacao aos macrofagos tambem e evidenciado um efeito citoprotetor da NIC sobre o sistema macrofagos + estimulo (LPMN + macrofagos + NIC: de 5 a 8% e macrofagos + PMA + NIC: de 7 a 12% dependendo da concentracao de NIC) embora esse efeito seja bem menos pronunciado (em termos de % de celulas naoviaveis) quando comparado com os LPMN.

De acordo com os resultados, a NIC promove aumento na viabilidade de LPMN e macrofagos estimulados, podendo favorecer a exacerbacao dos efeitos deleterios dessas celulas, especialmente quando ativadas, pelo aumento da producao de especies reativas de oxigenio e/ou enzimas proteoliticas. Outros autores citam que a NIC promove aumento da sobrevida de LPMN por supressao da sua apoptose e por ser um fator de quimiotaxia dessas celulas nos pulmoes (AOSHIBA et al., 1996).

Individuos fumantes apresentam neutrofilia (TERASHIMA et al., 1999), aterosclerose (kOUGIAS et al., 2005) e periodontite (PALMER et al., 2005), entre outras causas, por influxo e degranulacao de LPMN. Em individuos fumantes ha aumento na proporcao de LPMN no tecido pulmonar, podendo haver aumento nos niveis de enzimas proteoliticas e especies oxidantes, ocasionando efeito destrutivo na matriz celular (DOMAGALA-KULAWIK, 2008) e influenciando na progressao da doenca pulmonar (REPINE et al., 1997), alem de que o cigarro favorece o aparecimento de infeccoes microbianas, que determinam que as celulas fagociticas estejam em frequente estado de ativacao. Biopsias de pulmoes realizadas de pacientes com doenca pulmonar obstrutiva cronica (DPOC) demonstraram um aumento de LPMN nas vias aereas, mecanismo esse que pode envolver desde a deformabilidade dessas celulas como o aumento de interleucinas (KEATINGS et al., 1996). Oxidantes com o O2" estao relacionados com o desenvolvimento da DPOC, e a sua producao nos pulmoes e devida especialmente aos LPMN. Um dos principais fatores para o desenvolvimento de doencas agudas do pulmao e a producao de especies reativas de oxigenio e/ou nitrogenio, fatores pro-inflamatorios e enzimas proteoliticas, todos relacionados a presenca de LPMN e macrofagos, especialmente ativados (CHOW et al., 2003). Nesses contextos, a NIC pode favorecer ainda mais a presenca de celulas fagociticas no tecido pulmonar.

O possivel mecanismo envolvido na diferenca entre LPMN e macrofagos e a atividade da enzima mieloperoxidase (MPO). A MPO representa mais de 5% do conteudo proteico total da celula em neutrofilos e 1% nos monocitos [macrofagos.sup.-1] (HANSSON et al., 2006). Essa enzima e a responsavel pela formacao de HOCl, um potente oxidante gerado no surto oxidativo, que e responsavel tanto pela morte de microorganismos como tambem da propria celula. O HOCl pode causar diversos efeitos deleterios as celulas e biomoleculas, como halogenacao do DNA, entre outros (KAWAI et al., 2004; MALLE et al., 2007). Os LPMN possuem quantidades bem superiores de MPO em relacao aos macrofagos. Estudos mostram que a NIC possui interacao com o HOCl, modelos quimicos e enzimaticos, levando a formacao do ion cloramonium, podendo ampliar o dano causado pelo HOCl (MASUDA et al., 2001; SUZUKI; OHSHIMA, 2002). Por outro lado, a cotinina, o principal metabolito da NIC, nao possui efeito sobre especies reativas de oxigenio (como o HOCl) (VELLOSA et al., 2007). Esses estudos baseiam-se, na sua maioria, em ensaios in vitro ou enzimaticos, condicao diferente do sistema celular completo, no qual o sistema fagocitico ativo interage com diversas especies reativas de oxigenio em um mesmo momento (HOCl, [O.sub.2.sup.*-] e [H.sub.2][O.sub.2]) alem de todo o sistema lipidico e proteico celular, o que altera a interacao da NIC com esses agentes oxidantes, como tambem possivelmente os seus efeitos. Os sistemas celulares completos sao mais fidedignos de apresentar um modelo relacionado aos agentes oxidantes produzidos no nosso organismo.

Conclusao

A NIC promoveu significativa diminuicao da citotoxicidade de LPMN e macrofagos estimulados, sendo que esse efeito foi mais pronunciado nos LPMN. A reducao na citotoxicidade favorece a sobrevida da celula e a possivel exacerbacao de seus efeitos deleterios, pelo maior tempo de liberacao de especies reativas de oxigenio e enzimas proteoliticas, que podem amplificar os efeitos desses sistemas na celula, especialmente se os fagocitos estiverem ativados. Mais estudos sao necessarios para melhor compreensao dos resultados obtidos e das possiveis interacoes analisadas.

Doi: 10.4025/actascihealthsci.v35i1.11129

Agradecimentos

A Fundacao Araucaria, pelo financiamento do trabalho por meio do Programa de Infraestrutura para Jovens Pesquisadores-Programa Primeiros Projetos--PPP/2006.

Referencias

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CHOW, C.-W.; HERRERA, M. T.; SUZUKI, T.; DOWNEY, G. P. Oxidative stress and acute lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, v. 29, n. 4, p. 427-431, 2003.

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DOMAGALA-KULAWIK, J. Effects of cigarette smoke on the lung and systemic immunity. Journal of Physiology and Pharmacology, v. 59, suppl. 6, p. 19-34, 2008.

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KEATINGS, V. M.; COLLINS, P. D.; SCOTT, D. M.; BARNES, P. J. Differences in interleukin-8 and tumor necrosis factor-alpha in induced sputum from patients with chronic obstructive pulmonary disease or asthma. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, v. 153, n. 2, p. 530-534, 1996.

KOUGIAS, P.; CHAI, H.; LIN, P. H.; YAO, Q.; LUMSDEN, A. B.; CHEN, C. Defensins and cathelicidins: neutrophil peptides with roles in inflammation, hyperlipidemia and atherosclerosis. Journal of Cellular and Molecular Medicine, v. 9, n. 1, p. 3-10, 2005.

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VELLOSA, J. C. R.; KHALIL, N. M.; FONSECA, L. M.; BRUNETTI, I. L.; OLIVEIRA, O. M. M. F. Does cotinine act upon reactive oxygen species and peroxidases? Ecletica Quimica, v. 32, n. 1, p. 65-70, 2007.

WETSCHER, G. J.; BAGCHI, M.; BAGCHI, D.; PERDIKIS, G.; HINDER, P. R.; GLASER, K.; HUNDER, R. A. Free radical production in nicotine treated pancreatic tissue. Free Radical Biology and Medicine, v. 18, n. 5, p. 877-882, 1995.

Received on September 9, 2010.

Accepted on April 5, 2011.

Andreza Urba de Quadros, Loriangela Marceli Dalposso, Thaysa Ksiaskiewcz Karam, Rubiana Mara Mainardes e Najeh Maissar Khalil *

Departamento de Farmacia, Universidade Estadual do Centro-Oeste, Rua Simeao Camargo Varela de Sa, 3, 85040-080, Guarapuava, Parana, Brasil. * Autorpara correspondencia. E-mail: najeh@unicentro.br
Tabela 1. Efeito da NIC sobre LPMN (1 x [10.sup.6] 0,1 [mL.sup.-1])
estimulados por zymosan (0,05 mg 0,1 [mL.sup.-1]) ou quiescentes. Os
resultados estao expressos em % de celulas que incorporaram o
corante azul de trypan (celulas nao-viaveis) na ausencia ou presenca
de NIC (molar) em tampao PBS-D a 37[degrees]C incubados por 30 min.

Sistema                                % celulas nao-viaveis

Somente celulas                           5 [+ or -] 0,7
celulas + Estimulo                       76 [+ or -] 0,3 *
celulas + NIC [10.sup.-3]               10 [+ or -] 5,6 **
celulas + NIC [10.sup.-4]               18 [+ or -] 0,7 **
celulas + NIC [10.sup.-5]               12 [+ or -] 0,7 **
celulas + NIC [10.sup.-3] + Estimulo    6 [+ or -] 1,7 ***
celulas + NIC [10.sup.-4] + Estimulo    9 [+ or -] 1,0 ***
celulas + NIC [10.sup.-5] + Estimulo    15 [+ or -] 4,6 ***

* p < 0,05 quando comparado somente celulas com celulas + Estimulo.
** p < 0,05 quando comparado somente celulas com celulas + NIC. ***
p < 0,05 quando comparado celulas + NIC + Estimulo com celulas +
Estimulo.

Tabela 2. Efeito da NIC sobre macrofagos (1 x [10.sup.6] 0,1
[mL.sup.-1]) estimulados por zymosan (0,05 mg 0,1 [mL.sup.-1]) ou
quiescentes. Os resultados estao expressos em % de celulas que
incorporaram o corante azul de trypan (celulas nao-viaveis) na
ausencia ou presenca de NIC (molar) em tampao PBS-D a 37[degrees]C
incubados por 30 min.

Sistema                                % celulas nao-viaveis

Somente celulas                           6 [+ or -] 0,3
celulas + Estimulo                       17 [+ or -] 0,7 *
celulas + NIC [10.sup.-3]               15 [+ or -] 5,6 **
celulas + NIC [10.sup.-4]                 9 [+ or -] 3,2
celulas + NIC [10.sup.-5]                 9 [+ or -] 0 **
celulas + NIC [10.sup.-3] + Estimulo    8 [+ or -] 0,7 ***
celulas + NIC [10.sup.-4] + Estimulo    8 [+ or -] 3,5 ***
celulas + NIC [10.sup.-5] + Estimulo    5 [+ or -] 4,6 ***

* p < 0,05 quando comparado somente celulas com celulas + Estimulo.
** p < 0,05 quando comparado somente celulas com celulas + NIC. ***
p < 0,05 quando comparado celulas + NIC + Estimulo com celulas +
Estimulo.

Tabela 3. Efeito da NIC sobre LPMN (1 x [10.sup.6] 0,1 [mL.sup.-1])
estimulados por PMA ([10.sup.-7]M) ou quiescentes. Os resultados
estao expressos em % de celulas que incorporaram o corante azul de
trypan (celulas nao-viaveis) na ausencia ou presenca de NIC (molar)
em tampao PBS-D a 37[degrees]C incubados por 30 min.

Sistema                                % celulas nao-viaveis

Somente celulas                           5 [+ or -] 0,3
celulas + Estimulo                       17 [+ or -] 4,9 *
celulas + NIC [10.sup.-3]                 9 [+ or -] 0 *
celulas + NIC [10.sup.-4]                 8 [+ or -] 5,1
celulas + NIC [10.sup.-5]                 7 [+ or -] 5,3
celulas + NIC [10.sup.-3] + Estimulo    5 [+ or -] 0,3 ***
celulas + NIC [10.sup.-4] + Estimulo    3 [+ or -] 0,3 ***
celulas + NIC [10.sup.-5] + Estimulo    2 [+ or -] 0,3 ***

* p < 0,05 quando comparado somente celulas com celulas + Estimulo.
** p < 0,05 quando comparado somente celulas com celulas + NIC. ***
p < 0,05 quando comparado celulas + NIC + Estimulo com celulas +
Estimulo.

Tabela 4. Efeito da NIC sobre macrofagos (1 x [10.sup.6] 0,1
[mL.sup.-1]) estimulados por PMA ([10.sup.-7]M) ou quiescentes. Os
resultados estao expressos em % de celulas que incorporaram o
corante azul de trypan (celulas nao-viaveis) na ausencia ou presenca
de NIC (molar) em tampao PBS-D a 37[degrees]C incubados por 30 min.

Sistema                                % celulas nao-viaveis

Somente celulas                         6 [+ or -] 0,3
celulas + Estimulo                      17 [+ or -] 0,7 *
celulas + NIC [10.sup.-3]               15 [+ or -] 5,6 **
celulas + NIC [10.sup.-4]               10 [+ or -] 3,1
celulas + NIC [10.sup.-5]               10 [+ or -] 6,7
celulas + NIC [10.sup.-3] + Estimulo    11 [+ or -] 3,2 ***
celulas + NIC [10.sup.-4] + Estimulo    7 [+ or -] 0,3 ***
celulas + NIC [10.sup.-5] + Estimulo    12 [+ or -] 1,1 ***

* p < 0,05 quando comparado somente celulas com celulas + Estimulo.
** p < 0,05 quando comparado somente celulas com celulas + NIC. ***
p < 0,05 quando comparado celulas + NIC + Estimulo com celulas +
Estimulo.
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Author:de Quadros, Andreza Urba; Dalposso, Loriangela Marceli; Karam, Thaysa Ksiaskiewcz; Mainardes, Rubian
Publication:Acta Scientiarum. Health Sciences (UEM)
Date:Jan 1, 2013
Words:3339
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