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Effect of storage on the stability of proteases of viscera from loricariid catfish (Hypostomus plecostomus)/Efecto del almacenamiento sobre la estabilidad de proteasas de visceras de pez diablo (Hypostomus plecostomus)/ Efeito do armazenamento sobre a estabilidade de proteases de visceras do peixe cascudo (Hypostomus plecostomus).

SUMMARY

The stability of digestive proteases was evaluated in a crude extract obtained from viscera of loricariid catfish. The effect of freezing and freeze-drying were determined on the enzymatic activity. Total proteolytic activity (TPA) was monitored as well as specific proteolytic activity (EPA) for the enzymes trypsin and chymotrypsin. During refrigerated storage the specific activity was measured every 3 days until day 30, while in frozen and freeze-dried samples the enzyme activity was measured at zero time and after one month of storage. The TPA showed increased activity in the alkaline region, thought to be due to the action of trypsin and chymotrypsin enzymes. The activity of the latter showed no significant differences (P [greater than or equal to] 0.05) and it had a higher stability during the first 15 days under refrigeration, while trypsin showed a sharp decrease in activity (P<0.05) on the third day of storage. In frozen and freeze-dried samples, both the TPA and EPA did not show significant changes (P[greater than or equal to]0.05). The viscera from loricariid catfish can be an important source for the preparation of enzyme concentrates as long as handling is in lyophilized or frozen form.

RESUMEN

Se evaluo la estabilidad de proteasas digestivas en un extracto crudo obtenido a partir de visceras de pez diablo. Se determino el efecto de la refrigeracion, congelacion y liofilizacion sobre la actividad enzimatica. Se monitoreo la actividad proteolitica total (APT) y la actividad proteolitica especifica (APE) para las enzimas tripsina y quimotripsina. En refrigeracion dicha actividad se midio cada 3 dias hasta el dia 30, mientras que en congelacion y liofilizacion la actividad enzimatica se midio al tiempo cero y despues de un mes de almacenamiento. La APT mostro una mayor actividad en la region alcalina, atribuven dose esto a la accion de las enzimas tripsina y quimotripsina. Esta ultima presento mayor estabilidad al no presentar cambios significativos (P[menor que or igual a]0,05) en su actividad durante los primeros 15 dias en refrigeracion, mientras que la tripsina mostro un agudo decrecimiento en su actividad (P<0,05) al tercer dia de almacenamiento. En congelacion y liofilizacion, tanto la APT como la APE no mostraron cambios significativos (P[menor que or igual a]0,05). Las visceras de pez diablo pueden ser una fuente importante en la elaboracion de un concentrado enzimatico siempre y cuando este se maneje liofilizado o congelado.

PALABRAS CLAVE / Actividad Proteolitica / Hypostomus plecostomus / Pez Diablo / Quimotripsina / Tripsina /

RESUMO

Avaliou-se a estabilidade de proteases digestivas em um extrato cru obtido a partir de visceras do peixe cascudo. Determinou-se o efeito da refrigeracao, congelamento e liofilizacao sobre a atividade enzimatica. Monitorou-se a atividade proteolitica total (APT) e atividade proteolitica especifica (APE) para as enzimas tripsina e quimotripsina. Em refrigeracao dita atividade se mediu cada 3 dias ate o dia 30, enquanto que em congelamento e liofilizacao a atividade enzimatica se mediu ao tempo zero e depois de um mes de armazenamento. A APT mostrou uma maior atividade na regiao alcalina, atribuindo-se isto a acao das enzimas tripsina e quimotripsina. Esta ultima apresentou maior estabilidade ao nao apresentar mudancas significativas (P[mayor que o igual a]0,05) em sua atividade durante os primeiros 15 dias em refrigeracao, enquanto que a tripsina mostrou um agudo decrescimento em sua atividade (P<0,05) ao terceiro dia de armazenamento. Em congelamento e liofilizacao, tanto a APT como a APE nao mostraram mudancas significativas (P[mayor que o igual a]0,05). As visceras de peixe cascudo podem ser uma fonte importante na elaboracao de um concentrado enzimatico sempre e quando este esteja liofilizado ou congelado.

Introduccion

El pez diablo (Hypostomus plecostomus) es una especie originaria de Sudamerica. Sin embargo, de forma accidental ahora se lo puede encontrar en el Embalse Adolfo Lopez Mateos, Michoacan, Mexico. La proliferacion de este pez en el embalse se ha convertido en un problema de invasion y sustitucion, ya que por cada 200kg de tilapia capturadas, se capturan 800kg de pez diablo, el cual es ya considerado como una plaga. Todos esos peces, terminan tirados en la orilla de la presa, ya que no son aprovechables para comercializacion, constituyendo una fuente de contaminacion. Por ello, se ha propuesto la posibilidad de utilizarlo para producir harina de pescado u otros productos tales como alimentos balanceados para ganado. Sin embargo, hasta ahora esto no ha tenido exito debido a la falta de recursos economicos para ello (Villalba-Villalba et al., 2011).

El pez puede ser utilizado de manera integra, ya sea para consumo humano directo o indirecto, o bien extrayendose componentes bioactivos como lo pueden ser las enzimas digestivas de su tracto intestinal. Tomando en cuenta el amplio espacio visceral de este organismo, resulta interesante estudiar las enzimas digestivas de este pez con la finalidad de generar conocimiento basico que pueda ser utilizado por empresarios en el ramo de la tecnologia de enzimas.

Un uso comun de las visceras es su utilizacion como materia prima en la elaboracion de concentrados enzimaticos, los cuales pueden ser utilizados en una gran variedad de procesos industriales. Las proteasas tienen un uso muy amplio en el sector alimentario, farmaceutico, y en la industria de los detergentes, entre otros (Castillo-Yanez et al., 2006).

Actualmente una gran cantidad de recursos se destinan al estudio de proteasas marinas debido a caracteristicas muy particulares, que hacen a estas biomoleculas atractivas de estudiar. Una de estas caracteristicas es que las proteasas de origen marino poseen mayor actividad que su contraparte terrestre aun a bajas temperaturas, ya que los peces son organismos de sangre fria y en consecuencia sus enzimas deben poseer buena actividad aun a bajas temperaturas, tal como sucede en las estaciones de otono e invierno (Castillo-Yanez et al., 2009). Otra caracteristica sobresaliente es que pueden inactivarse muy rapidamente cuando se eleva la temperatura por encima de los 55[grados]C. Aunado a esto, estas enzimas poseen una excelente estabilidad en funcion del pH (Mathews y Van-Holde, 1998). Sin embargo poco se ha estudiado sobre la estabilidad de estas enzimas durante su almacenamiento. Es por ello que el presente trabajo se centra en el estudio de la estabilidad enzimatica durante la refrigeracion, congelacion y liofilizacion de un extracto crudo de visceras de pez diablo. Se monitoreo la actividad proteolitica total, asi como la actividad tipo tripsina y quimotripsina, con la finalidad de observar cual es el efecto de estos procesos sobre la actividad enzimatica de un extracto crudo.

Materiales y Metodos

Obtencion de muestras

El muestreo de pez diablo se realizo en el Embalse Adolfo Lopez Mateo en el Estado de Michoacan, Mexico. Las muestras se obtuvieron con ayuda de pescadores domesticos con una red agallera de monofilamento. Los especimenes vivos se enhielaron totalmente en una hielera, colocando capas alternadas de hielo-pescado-hielo, y se trasladaron inmediatamente a las instalaciones de la Universidad Michoacana de San Nicolas de Hidalgo, en donde se procedio a la evisceracion. Se obtuvieron cuidadosamente las visceras y se enhielaron apropiadamente, para posteriormente ser trasladadas via aerea al Centro de Investigacion en Alimentacion y Desarrollo (CIAD), Hermosillo, Sonora, Mexico.

Preparacion del extracto crudo

El extracto crudo se obtuvo homogeneizando 50g de visceras con tres volumenes de agua fria (0-3[grados]C) durante 1min, luego se centrifugo a 15,000g durante 30min. Despues de separar la grasa se recogio el sobrenadante, donde se encuentran las enzimas digestivas (Martinez y Serra, 1989). Una vez obtenidos los extractos crudos, estos fueron almacenados mediante refrigeracion (30 dias, evaluandose la actividad enzimatica cada 3 dias), congelacion (1 mes) y liofilizacion (1 mes). Se determino la actividad proteolitica total (APT) y la actividad proteolitica especifica (APE) tipo tripsina y quimotripsina.

Actividad proteolitica total

Se determino la actividad proteolitica a diferentes pH de acuerdo a Simpson y Haard (1988) en el intervalo acido (Glicina-HC1 0,1M a valores de pH de 2,0; 2,5 y 3,0) y alcalino (Trizma base 0,1M a pH 8,0; 8,5 y 9,0). Se mezclaron 20[micron]l de extracto crudo con 1000[micron]l de sustrato disuelto en el buffer correspondiente (hemoglobina 1% a pH acidos y caseina 1% a pH alcalinos). La mezcla se incubo durante 20min a 25[grados]C y la reaccion se detuvo con 500p.1 de acido tricloroacetico (TCA) 20%. La actividad proteolitica se cuantifico por medio del aumento en la absorbancia de la mezcla a 280nm en el sobrenadante obtenido despues de haber sido centrifugado a 6,500g durante 5min. La actividad se expreso en terminos de unidades de actividad (U), la cual en este caso corresponde al incremento en absorbancia (280nm) en 20min, por mg de proteina, bajo las condiciones del ensayo. El contenido de proteina se cuantifico de acuerdo a la metodologia descrita por Bradford (1976).

Actividad tipo tripsina

Se utilizo la metodologia descrita por Erlanger et al. (1961) con pequenas modificaciones en donde una alicuota de 10[micron]l de extracto crudo se mezclo con 990p.1 de sustrato especifico BAPNA 1mM disuelto en TRIS.HC1 50mM pH 8,0 y Ca[Cl.sub.2] 10mM a 25[grados]C, en una celda de cuarzo. Se registro la produccion de [rho]-nitroanilina (producto de la hidrolisis de BAPNA) monitoreando el incremento en la absorbancia a 410nm durante 10min. La actividad enzimaticase calculo mediante la formula Unidades BAPNA= A(410)/(10min x 1000 x 1/8800 x mg enzima), donde 8800 es el coeficiente de extincion molar de la [rho]-nitroanilina.

Actividad tipo quimotripsina

Se realizo segun la tecnica descrita por Tsai et al. (1986), en donde una alicuota de 10[micron]l de extracto crudo se mezclo con 990[micron]l de SAAPNA 0,1mM disuelto en amortiguador Trizma base 50mM pH 8,0 y CaC12 10mM a 25[grados]C. Se registro la produccion de p-nitroanilina (producto de la hidrolisis de SAAPNA), monitoreando el incremento en la absorbancia a 410nm durante 10min. La actividad enzimaticase calculo mediante la formula Unidades SAAPNA= [A.sub.(410)]/(10min x 1000 x 1/8800 x mg enzima) donde 8800 es el coeficiente de extincion molar de la p-nitroanilina.

Analisis estadistico

Se hicieron tres replicas para cada tratamiento, realizandose por duplicado cada uno de los analisis. Los datos fueron analizados mediante analisis de varianza de una via utilizando el paquete estadistico JMP version 5.0.1. La comparacion de medias fue realizada mediante rangos multiples de Tukey-Kramer utilizando un nivel de significancia del 5%.

[FIGURA 1 OMITTED]

Resultados y Discusion

Actividad proteolitica total

En la Figura 1 se muestran los resultados obtenidos en el analisis de actividad proteolitica total. La mayor actividad en la region acida se registro a pH 2.0, lo cual puede ser atribuido a la accion de la pepsina, que es la principal enzima que actua a pH acido (de Ona et al., 2002). En la region alcalina el pH de optima actividad fue de 8,0. Lo anterior puede deberse principalmente a la accion de tripsina y quimotripsina, las cuales tienen un pH optimo de 7,5 a 8,0 (Martinez y Serra, 1989). Resultados similares han sido reportados por Castillo-Yanez et al. (2004), asi como tambien por Hideki et al. (2005), quienes trabajaron con visceras de sardina Monterey (Sardinops sagax caerulea) y atun de cola amarilla (Seriola quinqueradiata), respectivamente. La actividad proteolitica total del pez diablo en la region alcalina fue de 122U/rol, la cual se halla dentro del intervalo normal, ya que especies como la sardina monterey y atun cola amarilla presentan 108U/ mi y 150U/ml, respectivamente (Castillo Yanez et al., 2004; Hideki et al., 2005). Debido a que los mayores registros de actividad en las regiones acidas y alcalinas se obtuvieron a pH de 2,0 y 8,0 respectivamente, estos fueron los pH utilizados para evaluar la estabilidad en refrigeracion, congelacion y liofilizacion.

[FIGURA 2 OMITTED]

Al almacenar el extracto crudo en refrigeracion (Figura 2) se observo un decaimiento significativo (p<0,05) durante el tiempo de almacenamiento en la actividad proteolitica de aquellas enzimas cuya actividad optima es en medio acido. Tal reduccion siguio un comportamiento lineal (y = -7,44x + 96,36, [r.sup.2] = 0,953). Bajo las condiciones experimentales utilizadas en este estudio, este comportamiento ayuda a predecir de forma facil y precisa la actividad proteolitica remanente en cualquier dia del almacenamiento. La reduccion en actividad hace suponer que la enzima pepsina de pez diablo posee baja estabilidad durante el almacenamiento en refrigeracion bajo las condiciones de trabajo utilizadas en este estudio. La anterior presuncion se basa en el supuesto de que la pepsina es una de las principales enzimas responsables de la actividad en la region acida (de Orla et al., 2002). No existen reportes en donde se evalue la estabilidad de enzimas acidas en un extracto crudo almacenado en refrigeracion, y en consecuencia resulta dificil comparar los presentes resultados con estudios previos. No obstante esta reduccion abrupta de su actividad puede atribuirse a las condiciones del almacenamiento, es decir, al pH del mismo extracto crudo, el cual fue ligeramente alcalino (7,2). En la mayoria de los casos reportados el pH de mayor estabilidad de una enzima es aquel cercano a su actividad optima (Mathews y Van Holde, 1998), es decir, si el pH del extracto crudo fuera cercano a 2,0 probablemente la estabilidad de las enzimas acidas de las visceras del pez diablo presentaran una mejor estabilidad en el almacenamiento en refrigeracion. Por otra parte, existe la posibilidad de que las proteasas alcalinas, quimotripsina y tripsina, hubiesen digerido a las otras proteasas extraidas. La baja estabilidad de proteasas acidas durante su almacenamiento en refrigeracion marca la pauta respecto a formas o estrategias de manejo para un extracto crudo en donde el interes sea la accion de estas proteasas. En consecuencia, un extracto crudo obtenido de visceras de pez diablo debe ser utilizado inmediatamente si se desea mantener una alta actividad de proteasas acidas, o bien almacenar el extracto crudo a pH bajo.

Por otra parte, al evaluar la actividad proteolitica en la region alcalina se encontraron mejores resultados con respecto a la actividad proteolitica acida, ya que se registro mayor estabilidad. E1 comportamiento de la actividad proteolitica alcalina en un extracto crudo sometido a refrigeracion disminuyo de forma lineal (y = -7,007x + 89,37, [R.sup.2] = 0,88) respecto al tiempo de almacenamiento, tal como se muestra en la Figura 3. Nuevamente, bajo las condiciones del presente estudio se pone de manifiesto la pobre estabilidad de un extracto crudo de visceras de pez diablo sobre la actividad proteolitica, pero ahora en la region alcalina. Los resultados senalan la importancia de la rapida utilizacion de un extracto crudo una vez elaborado si se desea explotar al maximo su potencial proteolitico. Sin embargo, es necesario realizar mas estudios con la finalidad de darle mayor estabilidad al extracto enzimatico obtenido.

[FIGURA 3 OMITTED]

La evaluacion de la actividad proteolitica acida y alcalina por efecto de la congelacion y liofilizacion se muestran en la Figura 4, donde se aprecia que tanto la congelacion como la liofilizacion pueden ser buenas alternativas en la preservacion de la actividad proteolitica de un extracto crudo a partir de visceras de pez diablo. No se encontraron diferencias significati vas (P[mayor que o igual a]0,05) al evaluar la actividad proteolitica (pH 2 y 8) de un extracto crudo recien elaborado y extractos crudos almacenados durante un mes en congelacion y liofilizacion. En un extracto crudo, tanto enzimas acidas como alcalinas pueden ser preservadas por cualquiera de ambos metodos sin modificar en gran medida sus caracteristicas proteoliticas, sin embargo cuando se trata de almacenamiento en refrigeracion su actividad enzimatica se ve seriamente afectada.

[FIGURA 4 OMITTED]

[FIGURA 5 OMITTED]

Actividad proteolitica especifica

La Figura 5 muestra los resultados obtenidos en relacion a la actividad especifica tipo tripsina y quimotripsina durante el almacenamiento en refrigeracion. En lo que respecta a la actividad tipo tripsina se aprecia una disminucion drastica, cercana al 80%, de actividad durante los primeros tres dias de almacenamiento, para despues disminuir su actividad lentamente en el periodo restante. Por otra parte, la actividad especifica tipo quimotripsina mostro buena estabilidad durante 21 dias de almacenamiento, para despues disminuir marcadamente su actividad durante el almacenamiento. Este experimento demuestra que la reduccion de actividad proteolitica en la region alcalina se debio principalmente a la pobre estabilidad de la tripsina durante el almacenamiento en refrigeracion. Los resultados resaltan la gran estabilidad de quimotripsina en un extracto crudo, caracteristica que podria ser sumamente util si lo que se desea es explotar la actividad de esta enzima.

La evaluacion de la actividad especifca tipo tripsina y quimotripsina como resultado del almacenamiento en congelacion y liofilizacion se muestran en la Figura 6. La tripsina es altamente inestable si se mantiene en refrigeracion; sin embargo una buena alternativa para preservar o conservar su actividad enzimatica es mediante la congelacion o liofilizacion ya que ambos procesos practicamente mantienen intactas sus propiedades cataliticas; es decir, no hubo diferencias significativas (P[mayor que o igual a]0,05) en la actividad de un extracto crudo recien elaborado y aquellos extractos crudos que se sometieron a almacenamiento en congelacion y liofilizacion durante un mes. Por otra parte, la quimotripsina presenta muy buena estabilidad durante la refrigeracion; sin embargo, si el extracto enzimatico es sometido a congelacion o liofilizacion su actividad enzimatica se reduce significativamente (P<0,05). Por lo tanto, si se desea explotar la actividad tipo quimotripsina de un extracto de visceras de pez diablo, este puede refrigerarse hasta por 21 dias manteniendo una buena actividad, y despues podria ser congelado o liofilizado, dependiendo de las necesidades o capacidad de la industria. No obstante, como ya se menciono anteriormente, es necesario realizar nuevos estudios encaminados a obtener una mayor estabilidad de las proteasas presentes en el extracto enzimatico. E1 almacenamiento de dicho extracto a distintos pH, fuerza ionica, concentracion de proteinas, etc., probablemente mejoren la estabilidad de las enzimas proteoliticas del extracto obtenido del pez diablo. Por otra parte, los resultados obtenidos en el presente estudio indican que las visceras del pez diablo son una buena fuente de enzimas proteoliticas acidas y alcalinas, las cuales podrian ser de gran utilidad en procesos industriales, principalmente en la industria alimentaria o bien en el tratamiento de aguas residuales con alta carga organica.

[FIGURA 6 OMITTED]

Conclusiones

Bajo las condiciones experimentales del presente estudio, la conservacion de un extracto crudo mediante refrigeracion no parece ser la metodologia mas viable para preservar la actividad catalitica de las proteasas presentes en el. Solo en el caso de quimotripsina la refrigeracion es una alternativa viable hasta por un periodo de tres semanas; no obstante, el pH de almacenamiento pudo haber jugado un papel fundamental. Por otra parte, tanto la congelacion como la liofilizacion parecen ser tecnologias adecuadas para la preservacion de las propiedades cataliticas de proteasas presentes en un extracto, sin embargo ambos procesos reducen significativamente la actividad especifica tipo quimotripsina. Se requiere de estudios adicionales enfocados al mantenimiento de las buenas propiedades proteoliticas de proteasas presentes en un extracto crudo sometido a refrigeracion, asi como estudios de congelacion y liofilizacion cuyo tiempo de almacenamiento sea mas prolongado que el explorado, todo ello acompanado del uso de distintos estabilizantes.

Recibido: 15/12/2010. Modificado: 25/07/2011. Aceptado: 26/07/2011.

REFERENCIAS

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Alvaro Galvez-Rongel. Licenciado en Quimica de Alimentos y estudiante de postgrado, Universidad de Sonora (USon), Mexico.

Victor Manuel Ocano-Higuera. Doctor en Ciencias, Centro de Investigacion en Alimentacion y Desarrollo (CIAD), Mexico. Profesor, USon, Mexico.

Ramon Pacheco-Aguilar. Ph.D. en Ciencias y Tecnologia de Alimentos, Oregon State University. Investigador, CIAD, Hermosillo Mexico.

Francisco Javier Castillo-Yanez. Doctor en Ciencias, CIAD, Mexico. Profesor-Investigador, USon, Mexico.

Maria Elena Lugo-Sanchez. Maestra en Ciencias, CIAD, Mexico. Investigadora, CIAD, Hermosillo, Mexico.

Santiago Valdez-Hurtado. Doctor en Ciencias, CIAD, Mexico. Investigador, CIAD, Las Delicias, Chihuahua, Mexico.

Enrique Marquez-Rios. Doctor en Ciencias, CIAD, Mexico. Investigador, USon, Mexico. Direccion: Departamento de Investigacion y Posgrado en Alimentos. Universidad de Sonora, Encinas y Rosales s/n. Hermosillo, Sonora, 83000. Mexico. e-mail: emarquez@ guayacan.uson.mx
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Author:Galvez-Rongel, Alvaro; Ocano-Higuera, Victor Manuel; Pacheco-Aguilar, Ramon; Castillo-Yanez, Francis
Publication:Interciencia
Date:Aug 1, 2011
Words:3659
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