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Effect of photoperiodicity in the pregnancy rate of isogenic rats (F344)/ Efeito da fotoperiodicidade na taxa de prenhez em ratos isogenicos (F344).

INTRODUCAO

Animais isogenicos sao uma importante ferramenta na pesquisa cientifica, desde o desenvolvimento das suas primeiras linhagens que datam do principio do seculo XX. O Rato Fischer F344 foi a primeira linhagem isogenica de animais de laboratorio, desenvolvida na Universidade de Columbia em 1918. Desde entao, mantem-se como a principal linhagem isogenica de ratos utilizada em laboratorios ao redor do mundo, tendo sido utilizada em aproximadamente 400 pesquisas de duracao superior a dois anos pelo National Cancer Institute/National Toxicology Program (NCI/NTP) americano. O material resultante dessas pesquisas contem dados sobre mais de 100.000 ratos F344, incluindo oito milhoes de laminas histologicas (FESTING, 1998). O uso de animais isogenicos apresenta grandes vantagens experimentais, como uniformidade fenotipica e genotipica (reduzindo o numero de animais necessarios em experimentos), histocompatibilidade, desenvolvimento de modelos animais; permitindo, assim, o acumulo de informacoes e a repetibilidade de experimentos.

Apesar do imenso conhecimento acumulado sobre a linhagem F344 nos ultimos 90 anos, pouco se sabe sobre as razoes da relativa dificuldade que sua reproducao apresenta. Em geral, o Rattus norvegicus e considerado especie nao fotoperiodica, reproduzindo-se com grande facilidade durante o ano todo (HEIDEMAN & SYLVESTER, 1997). Entretanto, recentemente, alguns estudos apontaram a influencia do fotoperiodo no desenvolvimento sexual da F344. SHOEMAKER & HEIDEMAN (2002) concluiram que a fotoperiodicidade afeta o desenvolvimento reprodutivo da F344, considerando para isso que o tamanho testicular, as vesiculas seminais e o desenvolvimento puberal sao inibidos pelo fotoperiodo de 8 horas (h). Animais fotorresponsivos requerem manejo especifico para reproducao bem sucedida. Dessa forma, o presente estudo tem como objetivo analisar a influencia de diferentes fotoperiodos em machos e femeas F344 sobre o indice de prenhez, de forma a determinar qual o melhor protocolo para um bem sucedido manejo reprodutivo da F344.

MATERIAL E METODOS

Animais

Ratos Fischer F344 foram obtidos e mantidos no bioterio SPF do Instituto de Quimica da USP (IQ--USP). Foram acondicionados em caixas plasticas forradas com maravalha, na qual foram colocadas diariamente 50g de racao e agua ad libitum. A cama foi trocada a cada cinco dias e os ambientes tinham a luminosidade controlada por um timer e lampada fluorescente de 20 watts.

Delineamento experimental

Femeas com idade media de quatro meses foram agrupadas em caixas contendo tres animais cada. Machos com idade entre 6-7 meses foram mantidos em caixas individuais e colocados nas caixas das femeas no fim da tarde para pernoite e retirados na manha seguinte, quando foram realizados os lavados vaginais com o auxilio de pipeta de Pasteur e soro fisiologico. Os lavados foram analisados ao microscopio optico sem corantes para verificacao da presenca de espermatozoides, indicativa de acasalamento. Essas femeas eram monitoradas e as prenhezes eram confirmadas pela presenca de embrioes no utero materno.

As combinacoes de diferentes fotoperiodos aos quais machos e femeas foram submetidos foram testadas em 9 diferentes grupos: grupo 1--machos fotoperiodo 12h e femeas fotoperiodo 12h; grupo 2--machos fotoperiodo 12h e femeas fotoperiodo 14h; grupo 3--machos fotoperiodo 12h e femeas fotoperiodo 16h; grupo 4--machos fotoperiodo 16h e femeas fotoperiodo 12h; grupo 5--machos fotoperiodo 16h e femeas fotoperiodo 16h; grupo 6--machos fotoperiodo 14h e femeas fotoperiodo 16h; grupo 7--machos fotoperiodo 14h e femeas fotoperiodo 12h; grupo 8--machos fotoperiodo 16h e femeas fotoperiodo 14h; e grupo 9--machos fotoperiodo 16h e femeas fotoperiodo 14h.

Analise estatistica

Para analise estatistica, por tratar-se de variavel qualitativa dicotomica nominal, comparamos as proporcoes de taxas de prenhez entre cada grupo individualmente em relacao a cada um dos outros grupos (duas proporcoes), mediante o teste do quiquadrado (P<0,05).

RESULTADOS

As combinacoes de diferentes fotoperiodos aos quais machos e femeas foram submetidos foram testadas. Abaixo, encontram-se os dados sumarizados ("N" refere-se as possibilidades de acasalamento de cada grupo, ou seja, numero de femeas expostas a machos): Grupo 1 (N=67): femeas em fotoperiodo de 12h x machos em fotoperiodo de 12h:

3 prenhezes (4,5%); grupo 2 (N=27): femeas em fotoperiodo de 14h x machos em fotoperiodo de 12h: 4 prenhezes (14,8%); grupo 3 (N=31): femeas em fotoperiodo de 16h x machos em fotoperiodo de 12h: 7 prenhezes (22,6%); grupo 4 (N=27): femeas em fotoperiodo de 12h x machos em fotoperiodo de 14h: 4 prenhezes (14,8%); grupo 5 (N=28): femeas em fotoperiodo de 14h x machos em fotoperiodo de 14h: 3 prenhezes (10,7%); grupo 6 (N=27): femeas em fotoperiodo de 16h x machos em fotoperiodo de 14h: 11 prenhezes (40,7%); Grupo 7 (N=28): femeas em fotoperiodo de 12h x machos em fotoperiodo de 16h: 3 prenhezes (10,7%); grupo 8 (N=28): femeas em fotoperiodo de 14h x machos em fotoperiodo de 16h: 3 prenhezes (10,7%); e grupo 9 (N=27): femeas em fotoperiodo de 16h x machos em fotoperiodo de 16h: 2 prenhezes (7,4%). N total=290.

Os indices de prenhezes obtidos pelos diferentes grupos (porcentagem de prenhez x possibilidade de acasalamento) estao representados abaixo (Figura 1).

Encontramos diferencas significativas (P<0,05) entre o grupo 1 "machos e femeas submetidos ao fotoperiodo de 12h" e o Grupo 3 "machos sob fotoperiodo de 12h e femeas sob fotoperiodo de 16h", sendo maior o indice de prenhez no grupo 3.

O grupo 6 "machos sob fotoperiodo de 14h e femeas sob fotoperiodo de 16h" apresentou diferenca significativa com todos os outros grupos estudados, sendo o grupo que apresentou a maior taxa de prenhez. Os demais grupos: 2, 4, 5, 7, 8 e 9 nao apresentaram diferencas significativas entre si e entre os grupos 1 e 3.

[FIGURE 1 OMITTED]

DISCUSSAO

Animais sao expostos as variacoes ambientais como oferta de alimento, agua, abrigo, que sao dependentes do clima das diversas estacoes do ano, principalmente aqueles que vivem em zonas temperadas. Animais fotorresponsivos se adaptam melhor a essas variacoes, alterando seu comportamento, morfologia e fisiologia de acordo com a luminosidade (NELSON et al., 1990).

A glandula pineal e responsavel por secretar a melatonina, durante a noite, e indicar ao organismo a atual estacao do ano, sendo a secrecao menor durante o verao (dias longos) e maior durante o inverno (dias curtos). Sua acao na reproducao varia de acordo com a especie, ou seja, em uma especie de dias curtos, como ovelhas, a melatonina estimula a secrecao de gonadotrofinas e LH (hormonio luteinizante) aumentando a frequencia de sua secrecao pulsatil (KARSCH et al., 1984). Ja em especies de dias longos, como hamsters sirios, a melatonina inibe a secrecao de FSH (hormonio foliculo estimulante), LH e gonadotrofinas (TAMARKIN et al., 1976).

Em geral, o Rattus norvegicus e considerado uma especie reprodutivamente nao fotoperiodica, reproduzindo-se com grande facilidade durante o ano todo. Pouca atencao, ate a ultima decada, foi dada ao fato de que diferentes linhagens apresentam significativas variacoes em seus indices reprodutivos (LORINCZ et al., 2001), dentre elas a linhagem F344, utilizada no presente projeto. Essa linhagem apresenta baixos indices reprodutivos (SHOEMAKER & HEIDEMAN, 2002), pelo menos em fotoperiodo convencionalmente utilizado em bioterios (ciclo de luz/ sombra de 12 horas), fato esse observado em nosso estudo.

Visto isso, alguns estudos apontaram a influencia do fotoperiodo no desenvolvimento sexual da F344. SHOEMAKER & HEIDEMAN (2002) concluiram que a fotoperiodicidade afeta o desenvolvimento reprodutivo da F344, considerando para isso que o volume testicular, o das vesiculas seminais e o desenvolvimento puberal sao inibidos pelo fotoperiodo de 8h. Ja o fotoperiodo de 16h aumenta o volume testicular em comparacao com o fotoperiodo normalmente utilizado em bioterios (12h). Apesar dos resultados obtidos em tal experimento, nenhuma pesquisa sobre a influencia do fotoperiodismo nos indices reprodutivos foi realizada.

Estudos em hamsters sirios, considerados fotoperiodicos, expostos a curto fotoperiodo (10h de luz e 14 de escuro) demonstram uma diminuicao da secrecao de gonadotrofinas e androgenos testiculares, regressao dos testiculos e eventual perda de comportamento copulatorio em machos (PRENDERGAST et al., 2002) e aciclicidade em femeas, indicando mudancas gonadais fotoderivadas (SEEGAL & GOLDMAN, 1975; HAUSER & BENSON, 1986). Outro experimento com hamsters sirios demonstrou que, ao serem expostos a curtos fotoperiodos, a expressao de receptores androgenos e SRC-1 (receptor coactivator-1), um coativador nuclear de testosterona, diminui em determinadas areas do cerebro, alterando assim a sensibilidade a testosterona, o que pode contribuir para as alteracoes sazonais na resposta aos esteroides (TETEL et al., 2004).

O curto fotoperiodo tambem diminui as concentracoes plasmaticas de LH e FSH, um evento que e independente de esteroides (BITTMAN et al., 1996), mas potencializado pela testosterona, que assume um efeito supressor do LH e FSH serico em animais submetidos a dias curtos, alem de perder sua potencia como ativador da libido e da espermatogenese (MIERNICKI et al., 1990).

Apesar de essas pesquisas demonstrarem que a baixa exposicao a luz diminui os indices reprodutivos em algumas especies, nenhum estudo mostra qual seria o fotoperiodo ideal para melhorar os indices reprodutivos dos animais. Sendo assim, tambem nao existem pesquisas que indiquem qual fotoperiodo seria o otimo para a reproducao da linhagem F344, linhagem essa de grande importancia em experimentos que requerem homogeneidade entre os especimes ou naqueles que se procura a compatibilidade imunologica entre eles.

No presente estudo, obtivemos baixos indices de prenhezes quando machos e femeas foram submetidos ao fotoperiodo de 12h (4,5%), o padronizado pelos bioterios. Ao se aumentar o fotoperiodo ao qual as femeas eram normalmente submetidas, foram aumentados tambem os indices de prenhezes. Ao se aumentar o fotoperiodo ao qual os machos eram submetidos para 14h, mantendo as femeas em 12h, tambem houve um aumento do numero de prenhez (14,8%). Entretanto, observou-se um decrescimo acentuado quando os machos foram submetidos a luminosidade de 16h (7,1%), sugerindo uma limitacao reprodutiva do macho submetido a dias muito longos. Entretanto, as femeas submetidas ao fotoperiodo de 16h apresentaram os melhores indices reprodutivos (22,6% e 40,7% respectivamente, para machos com 12 e 14h). O dimorfismo sexual na resposta ao aumento de fotoperiodo pode estar relacionado as diferentes respostas neuroendocrinas a estimulos em cada genero (ANISHCHENKO et al., 1988).

SHOEMAKER & HEIDEMAN (2002) demonstraram que o volume testicular de ratos F344 submetidos a baixo fotoperiodo (8h) e menor quando comparado aos ratos sob fotoperiodo convencional (12h), e que ratos sob fotoperiodo de 16h tem o volume testicular aumentado. Apesar de os autores nao testarem a implicacao da variacao do volume testicular nos indices reprodutivos desses machos, provavelmente haja uma relacao positiva. Eles tambem relataram que as diferencas encontradas no volume testicular vao diminuindo com o aumento da idade do animal. Sendo que, com aproximadamente 16 semanas, essa diferenca inexiste para os fotoperiodos testados (8, 12 e 16h de luz) pelos autores.

Em nosso experimento, verificamos maior eficiencia reprodutiva em machos F344 sob fotoperiodo de 14h, fotoperiodo esse nao avaliado por SHOEMAKER & HEIDEMAN (2002), mas que possivelmente levaria a um aumento do volume testicular. Nossos resultados tambem demonstram que ha fotorresponsividade em ratos machos F344 adultos, pelo menos em fotoperiodo de 14h, uma vez que os ratos utilizados em nosso experimento podem ser considerados adultos (tinham entre 24-28 semanas). Esse resultado entra em desacordo com os obtidos por SHOEMAKER & HEIDEMAN (2002). Os autores citados rejeitam que haja fotorresponsividade em ratos F344 adultos.

Dessa forma, o presente estudo demonstrou que a linhagem de ratos Fischer F344 e fotorresponsiva quanto a reproducao, tendo seus indices de prenhezes acrescidos com o aumento do fotoperiodo, pelo menos no que concerne as femeas, uma vez que a taxa de prenhez, quando os machos foram submetidos a fotoperiodo de 16h, diminuiu. Essa fotorresponsividade da F344 se deve, provavelmente, a uma selecao acidental de animais mais fotorresponsivos durante a criacao dessa linhagem, ja que o R. norvegiccus apresenta uma variacao individual a resposta ao fotoperiodo, ou devido a alguma mutacao genica que restaurou parcialmente tal caracteristica (LORINCZ et al., 2001). O estudo tambem indicou que a otimizacao dos indices de prenhezes foi obtida utilizando-se machos submetidos a 14 horas de luz e femeas a 16h de luz, indicando dimorfismo sexual na fotorresponsividade. Concluimos, assim, que os ratos isogenicos Fischer 344 sao fotorresponsivos. No presente estudo, foram observados melhores indices reprodutivos quando femeas eram submetidas a um fotoperiodo de 16h e machos a um fotoperiodo de 14h.

AGRADECIMENTOS

A Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPEPS), pelo apoio financeiro (processo n. 2008/ 00051-6).

COMITE DE ETICA

Projeto aprovado pela Comissao de Bioetica da Faculdade de Medicina Veterinaria e Zootecnia da Universidade de Sao Paulo (USP) sob protocolo n. 1377/2008, em 23 de abril de 2008.

REFERENCIAS

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Alexandre Bastos Baptista (I) * Erika Lissa Morita (I) Cristiane Carlin Passos (I) Amanda Olivotti Ferreira (I) Flavio Ribeiro Alves (II) Alexandre Jose Alves (III) Maria Angelica Miglino (I) Ricardo Romao Guerra (III)

(I) Departamento de Cirurgia, Faculdade de Medicina Veterinaria e Zootecnia (FMVZ), Universidade de Sao Paulo (USP), Sao Paulo, SP, Brasil. E-mail: alexbbap@gmail.com. * Autor para correspondencia.

(II) Curso de Medicina Veterinaria, Campus Cinobelina Elvas, Universidade Federal da Paraiba (UFPI), Bom Jesus, PI, Brasil.

(III) Departamento de Ciencias Veterinarias, Centro de Ciencias Agrarias, Universidade Federal da Paraiba (UFPB), Areia, PB, Brasil.

Recebido para publicacao 17.04.10 Aprovado em 22.10.10 Devolvido pelo autor 05.12.10
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Author:Baptista, Alexandre Bastos; Morita, Erika Lissa; Passos, Cristiane Carlin; Ferreira, Amanda Olivotti
Publication:Ciencia Rural
Date:Jan 1, 2011
Words:2860
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