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Efectos Morfologicos y Mecanicos en Ratas Sprague Dawley Sometidas a Ciclos de Hipoxia/Morphological and Mechanical Effects in Sprague Dawley Rats Subjected to Hypoxia Cycles.

INTRODUCCION

La necesidad del intercambio gaseoso se genera a partir del gasto metabolico que le implica al organismo mantenerse en equilibrio. Este proceso, a su vez, establece el nivel de ventilacion pulmonar necesaria para cubrir esta demanda (Mortola. 2019). Este hecho ocurre a nivel del mar, sin embargo, al aumentar la altitud disminuye la presion atmosferica, por tanto, cuando respiramos la presion del aire al interior de los pulmones con Pa[O.sub.2] son menores, cae el aporte de oxigeno a la sangre y a los tejidos. Esto se conoce como hipoxia (Steva et al., 2009).

En este contexto, se hace necesario el correcto funcionamiento del sistema respiratorio. El cual contempla un aumento de la contraccion de los musculos inspiratorios, los que generan gradientes de presion, y el intercambio de gases en los alveolos (Adaos et al., 2017). Complementariamente, las respuestas vasculares pulmonares aseguran la oxigenacion adecuada de la sangre en respuesta a las bajas tensiones de oxigeno, respuestas que, a su vez son iniciadas en procesos agudos de hipoxia (Mortola).

La hipoxia puede ser intermitente (HI) en el caso de trabajadores andinos, siendo un modelo unico en donde los periodos de exposicion a bajas concentraciones de [O.sub.2] se intercalan con estadias a nivel del mar. Situacion distinta a la ocurrida en eventos agudos (turismo y apnea del sueno) o cronicos como la residencia en altura, donde la hipoxia puede ser acotada o permanente, respectivamente (Herrera et al., 2016).

Frente a esta situacion, existe un mecanismo fisiologico denominado vasoconstriccion pulmonar hipoxica, el cual restringe el flujo sanguineo a los alveolos menos oxigenados y lo redirige hacia los mejor oxigenados. Sin embargo, cuando esta respuesta se mantiene por un largo tiempo genera cambios morfofuncionales, dentro de los que destacan un aumento de la vascularizacion pulmonar y en ocasiones una disminucion del numero de alveolos (Urrutia & Aragones, 2018).

Paralelamente, como todo musculo estriado, el diafragma puede verse modificado frente a factores de estres fisiologicos y/o fisiopatologicos, con el proposito de mantener la homeostasis respiratoria (Lewis & O'Halloran, 2016). Considerando que el diafragma esta sometido a cargas ciclicas producidas por la respiracion, es relevante estudiar el efecto de los ciclos de hipoxia en el. Es comun que bajo diferentes condiciones de hipoxia el diafragma tienda a disminuir su fuerza, pero aumente su resistencia (McMorrow et al., 2011). Esto involucra adaptaciones estructurales y funcionales, las cuales incluyen, disminucion de la respiracion mitocondrial, activacion de la senalizacion de atrofia muscular y aumento de la proteolisis (Lewis & O'Halloran; Panisello et al., 2008).

El musculo esqueletico esta compuesto por agua, colageno y tejido adiposo, cubierto por tejido conectivo otorgandole propiedades viscoelasticas derivadas de su estructura. Debido a su importancia, se han implementado variados modelos para la comprension del sistema musculoesqueletico. Asi, la prueba de estres por estiramiento aportaria informacion de la capacidad de la capacidad tensil del musculo (Kuthe & Uddanwadiker, 2014), informacion que en este caso seria relevante considerando los danos estructurales que se han reportado en el diafragma sometido a HI.

El objetivo de esta comunicacion fue comprobar los efectos morfologicos y mecanicos en diafragma y pulmones de ratas sometidas a HI.

MATERIAL Y METODO

Se utilizaron 4 ratas Sprague Dawley de 6 meses de edad. Dos ratas fueron sometidas a 10 ciclos de hipoxia hipobarica intermitente (HHI) de 96 h (~428 torr; P[O.sub.2] 90 mm Hg), seguidos de 96 h de normoxia normobarica, durante 80 dias. Las dos ratas en normoxia, se mantuvieron a 22[grados] C con ciclo de luz/oscuridad de 12 h cada uno. Ambos grupos recibieron la misma cantidad de alimento y agua a diario (15 g de comida estandar en pellets; agua ad libitum). Despues de los ciclos de exposicion, se realizo eutanasia con pentobarbital (50 mg/[kg.sup.-1] intraperitoneal). Se extrajeron segmentos de tejido pulmonar y diafragma, a los cuales, se les realizo pruebas de traccion uniaxial, tincion con Hematoxilina-Eosina y Picrosirius red de Junqueira.

Los ensayos de traccion fueron realizados en una maquina de ensayos universal (Instron 3342[R]), las muestras fueron cortadas en forma rectangular, se registro el area y espesor, con el proposito estimar carga y estiramiento. Posteriormente, los tejidos se posicionaron en un sistema de montaje para tejidos blandos, donde estuvieron sumergida en Krebs a una temperatura de 37[grados] C durante todo el ensayo. La traccion se realizo con una velocidad de 1 mm/min, la informacion de carga y desplazamiento se obtuvo con una precision de 0,01 N y 1 [micro]m, respectivamente.

Se realizaron 20 cortes transversales de 5 [micro]m de espesor con microtomo Leica (RM2255) y se montaron en portaobjetos xilanizados. Posteriormente, se realizo tincion con H-E y Picrosirius red de Junqueira para la marcacion de colageno. Las muestras fueron fotografiadas con un microscopio de luz Leica (DM750) con camara digital HD Leica (ICC50 HD) con el objetivo 100x. Se analizaron 5 campos al azar de cada corte histologico. Las imagenes fueron analizadas con el programa ImageJ 1.8.0 (NIH, E.E.U.U.), utilizando la herramienta Threshold, se cuantificaron las fracciones de area de: espacios alveolares, celularidad y colageno presente en alveolos; miocitos y colageno en diafragma.

RESULTADOS

Ensayos de traccion. En las Figs. 1 y 2, se observa que a bajas deformaciones el comportamiento presenta minima desviacion, sin embargo, a medida que aumenta la deformacion, la dispersion aumenta. Al comparar las curvas de los diafragmas, los sometidos a hipoxia reducen levemente su esfuerzo respecto a la condicion de normoxia. En contraste a estos resultados, en el tejido pulmonar se observa que la hipoxia afecta negativamente su resistencia, estas muestran una pendiente menor respecto a las normoxicas. Comparando las muestras de tejidos pulmonares respecto a las de diafragma se observa que estas ultimas son mas resistentes que las de pulmon, debido a que su magnitud de esfuerzo esta sobre los 500 mega pascales (MPa), versus la del tejido pulmonar que llega a los 50 MPa, sin embargo, este ultimo es mas deformable que los diafragmas analizados.

Analisis histologico. En el parenquima pulmonar del grupo normoxia se observo una mayor cantidad de vasos sanguineos en comparacion al grupo HHI. La fraccion de area de los espacios alveolares fue de 28,76[+ o -]0,69 % para el grupo normoxia y de 32,13[+ o -]0,58 % para grupo HHI. La cuantificacion de celulas totales a nivel alveolar fue mayor en el grupo normoxia (84,46[+ o -]2,18 %) en relacion al grupo de HHI (75,53[+ o -]1,92 %) (Fig. 3A y 3C). La distribucion de colageno tipo I y III fue diferente, el grupo normoxia presento 0,37[+ o -]0,12 % de fibras colagenas y el grupo HHI 1,56[+ o -]0,41 % (Fig. 3E y 3G). En el diafragma la cantidad relativa de miocitos por campo en el grupo normoxia fue de 84,37[+ o -]1,84 % y de 75,25[+ o -]2,80 % en el grupo HHI (Fig. 3B y 3D). Este ultimo presento una distribucion irregular de las fibras musculares. Respecto al colageno, el grupo normoxia presento un 14,19[+ o -]2,36 % de fibras por campo, en comparacion al 8,31[+ o -]1,72 % del grupo HHI (Fig. 3F y 3H).

DISCUSION

El objetivo de esta comunicacion fue comprobar los cambios asociados a la HHI en el diafragma y tejido pulmonar de ratas. Los hallazgos indican que ambos sufren cambios estructurales, los que se traducen en una disminucion en su capacidad de resistir tension. Situacion no menor, debido a que el sistema respiratorio tiene una funcion vital de aqui su funcionamiento ritmico y continuo a lo largo de la vida (Adaos et al.).

En un ensayo de Zhu et al. (2005), la funcion expresada a traves de la relacion fuerza-frecuencia (in vitro), disminuyo significativamente (p< 0,001) en ratas sometidas a 60 min de hipoxia versus ratas sometidas a 60 min de hiperoxia. Paralelamente, la resistencia a la fatiga tambien fue significativa-mente menor en las ratas sometidas a hipoxia (p< 0,05). Los datos de tension obtenidos en el estudio pueden contribuir a complementar lo conocido, dado que el diafragma del grupo con HHI, con menos carga alcanzo menos tension, en cambio, el grupo en normoxia con una carga mayor alcanzo una mayor tension.

Panisello et al. (2008) sometieron a ratas a HHI (22 dias; 4h/dia, 5 dias/semana) y observaron un aumento significativo en la densidad capilar de las ratas con HHI (736 capilares/[mm.sup.2]) versus el grupo control (610 capilares/[mm.sup.2]). Ademas, estos mismos autores, observaron una reduccion del 13 % y 7 % en el area y perimetro, respectivamente, de fibras lentas de las ratas con HHI en relacion al control. Esto indicaria que las fibras lentas serian mas sensibles a HHI que los dos tipos de fibras rapidas. Los resultados encontrados en esta comunicacion concuerdan con los valores reportados por Panisello et al., especificamente la cantidad de miocitos relativa por campo fue de 84,37[+ o -]1,84 % en el grupo normoxia y de 75,25[+ o -]2,80 % en el grupo HHI, ademas este ultimo presento una distribucion irregular de las fibras musculares. El diafragma del grupo HHI soporto menos carga en relacion al grupo con normoxia, se deberia tal vez a un mayor volumen celular (miocitos) y mayor sosten (colageno) del diafragma en normoxia.

Ademas de esto, el pulmon sometido a HHI, llego a su deformacion maxima con una menor tension respecto al grupo control (Fig. 3). Este fenomeno se explicaria porque la hipoxia genera un edema pulmonar (Shukla et al., 2011). El engrasamiento de la pared arterial y su deterioro en el lecho vascular pulmonar, ocasionan que el parenquima pulmonar hipoxico pierda su punto de tension maximo, provocando la acumulacion de liquido extra en los espacios alveolares (Stenmark et al., 2006). Tambien se ha determinado que el estres inducido por hipoxia facilita el ascenso del tono vasomotor y favorece a la vasoconstriccion pulmonar. Ayudado por el aumento de moleculas que inducen cambios en el tono vascular, como factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), eritropoyetina (EPO) y endotelina-1 (ET-1) (Nehra et al., 2016). En relacion ET-1, se ha visto como agente causal de las lesiones pulmonar, provocando dano patologico en el parenquima pulmonar a traves de la modificacion del tejido conectivo, y el resultante estado fibrotico (Ivy et al., 2001). En resumen, la evidencia presentada respalda la disminucion en la deformacion encontrada en ratas sometidas a HHI en este estudio.

Es importante destacar que los resultados encontrados estan enmarcados en una experiencia previa, con un numero pequeno de animales. Asi, los principales hallazgos indican que el diafragma y el tejido pulmonar sometido a HHI sufren cambios estructurales en terminos de tendencia, que se traducen en una disminucion en su capacidad de resistir tension.

AGRADECIMIENTOS. Los autores agradecen a CONICYT el soporte brindado por el proyecto Fondecyt 1170608 y a la DICYT de la Universidad de Santiago de Chile

CONEI, D.; DEL SOL, M.; MUNOZ, R.; ESCOBAR, C. M.; SAAVEDRA, H.; HERRERA, E. A. & GARCIA-HERRERA, C. M. Morphological and mechanical effects in Sprague Dawley rats subjected to hypoxia cycles. Int. J. Morphol, 37(3):908-911, 2019.

SUMMARY: Extensive periods of hypoxic cause adaptive changes that make it possible to respond to the demands imposed by the environment. However, there are cases where this exposure is intermittent, as is the case of workers in andean areas. The objective of this communication was to verify the morphological and mechanical effects on diaphragm and lungs of rats subjected to intermittent hypoxic. Four 6-month-old Sprague Dawley rats were used. Two rats were subjected to 10 cycles of intermittent hypobaric hypoxic (IHH) of 96 h (~428 torr, P[O.sub.2] 90 mm Hg), followed by 96 h of normobaric normoxia, for 80 days. Uniaxial traction and staining tests were performed with Hematoxylin-Eosin and Picrosirius red de Junqueira. When comparing the curves of the diaphragms, those subjected to hypoxic slightly reduce their effort with respect to the condition of normoxia, in the lung tissue the hypoxic negatively affects its resistance, these show a lower slope with respect to the normoxics. In the histological analysis, the pulmonary parenchyma had a lower number of blood vessels and cellularity, such as a greater area fraction of alveolar spaces and amount of total collagen in IHH group. In the diaphragm, IHH group had a lower number of irregularly distributed myocytes and a lower amount of total collagen. In conclusion, the main findings indicate that the diaphragm and lung tissue subjected to IHH undergo structural changes, which result in a decrease in tensile strength.

KEY WORDS: Hypoxic; Diaphragm; Lungs; Tension.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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Daniel Conei (1,2); Mariano del Sol (1); Rodrigo Munoz Cofre (1); Maximo Escobar Cabello (3); Hector Saavedra P. (4); Emilio A. Herrera (5) & Claudio M Garcia-Herrera (4)

(1) Programa de Doctorado en Ciencias Morfologicas, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile.

(2) Departamento de Ciencias Morfologicas, Facultad de Medicina y Ciencia, Universidad San Sebastian, Puerto Montt, Chile.

(3) Programa de Funcion Disfuncion Ventilatoria, Departamento de Kinesiologia, Universidad Catolica del Maule, Talca, Chile.

(4) Departamento de Ingenieria Mecanica, Facultad de Ingenieria, Universidad de Santiago de Chile, Santiago, Chile.

(5) Programa de Fisiopatologia, Facultad de Medicina, Instituto de Ciencias Biomedicas, Universidad de Chile, Santiago, Chile.

Direccion para correspondencia:

Daniel Conei Valencia

Programa de Doctorado en Ciencias Morfologicas

Universidad de La Frontera

Temuco - CHILE

Recibido: 18-03-2019

Aceptado: 16-04-2019

CONEI, D.; DEL SOL, M.; MUNOZ, R.; ESCOBAR, C. M.; SAAVEDRA, H.; HERRERA, E. A. & GARCIA-HERRERA, C. M. Efectos morfologicos y mecanicos en ratas Sprague Dawley sometidas a ciclos de hipoxia. Int. J. Morphol., 37(3):908-911, 2019.
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Author:Conei, Daniel; Sol, Mariano Del; Cofre, Rodrigo Munoz; Cabello, Maximo Escobar; P., Hector Saavedra;
Publication:International Journal of Morphology
Date:Sep 1, 2019
Words:2712
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