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Efecto protector de la vitamina C sobre el estres oxidativo y dano al ADN en ratas con diabetes mellitus.

INTRODUCCION

La diabetes mellitus (DM) comprende un grupo de trastornos metabolicos caracterizados por una concentracion elevada de glucosa en sangre. Ademas de la hiperglucemia, el cuadro clinico incluye glucosuria, cetosis y acidosis, entre otros danos. Existen varios tipos de DM los cuales se deben a una compleja interaccion entre genetica, factores ambientales y estilos de vida. Los de mayor incidencia son los tipos I y II (13).

En la DM tipo I ocurre destruccion de las celulas beta del pancreas, lo cual conlleva a una deficiencia relativa o absoluta de insulina. Esta clase se conoce como diabetes inmunomediada y representa del 5 al 10% de los casos. La DM tipo II abarca el 90-95% de los casos y se caracteriza por grados variables de resistencia a la insulina, trastornos en la secrecion de la misma y aumento de la produccion de glucosa (13).

El riesgo de desarrollar DM tipo II aumenta con la edad, la obesidad y la falta de actividad fisica (1). La enfermedad, al estar asociada a un incremento en el riesgo de padecer patologias cardiovasculares, predispone a una muerte prematura. Asimismo, eleva la posibilidad de sufrir ceguera, insuficiencia renal y amputaciones de miembros (23).

Debido a la gran proliferacion de este trastorno, para el ano 2025 el numero de personas con DM en el continente americano sera aproximadamente de 64 millones y el 62% de los casos ocurriran en America Latina y el Caribe (3). En Venezuela, el numero de personas con diabetes varia entre 460.000 y 1.000.000 (2).

Debido al aumento de su prevalencia, la DM es considerada un problema de salud publica a nivel mundial, tanto en paises desarrollados como en vias de desarrollo. Su prevalencia actual es de 3,5 a 4,5%. La incidencia mas alta corresponde a Finlandia, donde la prevalencia abarca entre 35 y 40 personas/100.000 habitantes, casi el doble del indice de Estados Unidos, segun fue senalado en 2003. Si se tiene en cuenta el sub-registro de DM, ella alcanzaria el 6%, del cual 85% corresponderia a la DM tipo II. En Venezuela, mas de un millon de personas la padecen, de las cuales la mitad se encuentra sin diagnostico (9).

El estres oxidativo (EO) se ha relacionado con la patogenesis de la diabetes mellitus. El aumento de los radicales libres (RL) agrava la accion de la insulina a nivel periferico, contribuye a la disfuncion de la celula beta pancreatica (10, 19, 21) y esta implicado en el desarrollo de las complicaciones cronicas (11, 12).

El organismo mantiene un balance de oxido-reduccion constante, preservando el equilibrio entre la produccion de pro-oxidantes que se generan como resultado del metabolismo celular y los sistemas de defensa antioxidantes. La perdida de tal balance lleva a un estado de estres oxidativo, el cual se caracteriza por un aumento en los niveles de RL y especies reactivas de oxigeno, que no alcanza a ser compensado por los sistemas de defensa antioxidante, causando dano y muerte celular.

Esto ocurre en patologias degenerativas de tipo infeccioso, inmune e inflamatorio, como la DM. La alteracion del balance entre pro-oxidantes y antioxidantes, puede tener diversos grados de magnitud. En estados graves provoca alteraciones en el metabolismo celular, como destruccion de ADN, dano a los transportadores de iones y proteinas a traves de membranas y peroxidacion de lipidos (8).

En pacientes diabeticos existe un desequilibrio entre los mecanismos antioxidantes y oxidantes, habiendose demostrado una disminucion de los niveles plasmaticos de enzimas antioxidantes, de glutation y de vitaminas antioxidantes.

Por otro lado, en estos enfermos existe evidencia de un aumento de la peroxidacion lipidica mediada por radicales libres. Los antioxidantes de la dieta juegan un papel importante en la defensa frente al envejecimiento y las enfermedades cronicas como la DM, el cancer y la enfermedad cardiovascular. Estas sustancias inactivan los RL implicados en el EO e impiden su propagacion. La suplementacion con antioxidantes podria tener un efecto beneficioso al mejorar la morbimortalidad de los pacientes diabeticos (5, 6, 7), de tal forma que podrian prevenir y retrasar el desarrollo de las complicaciones cronicas de la diabetes (6).

En esta investigacion de corte longitudinal nos planteamos determinar el efecto protector de la vitamina C (VitC) sobre el EO en la DM experimental.

MATERIAL Y METODOS

Se utilizaron 16 ratas hembras Sprague-Dawley pertenecientes a la poblacion del Bioterio Central de la Universidad Centroccidental de Barquisimeto (Venezuela). El peso promedio de las ratas fue de 100 g. Se mantuvieron en jaulas individuales, con libre acceso al agua y una dieta comercial estandar, bajo ciclos de luz de 12 horas.

Las ratas fueron divididas en cuatro grupos: 1 = control, grupo 2 = diabeticas (inyectadas con streptozotocina (STZ) a dosis de 60 mg/kg de peso, grupo 3 = VitC + STZ (tratados con VitC 700 mg/kg via oral + STZ) y grupo 4 = tratados con VitC).

En el dia 1 del experimento, a todos los animales se les extrajo una muestra de sangre (sin someterlos a ayuno), por medio de una puncion cardiaca. La sangre se centrifugo a 3500 revoluciones por minuto, durante 15 minutos, a 15[grados]C en una centrifuga Eppendorf 5402 (Westburry, NY, USA).

En el plasma se determino el nivel de glucosa por el metodo enzimatico de Trinder (1969) (20) mediante kit Qualitest. Estos analisis sanguineos se repitieron el dia del sacrificio. A las ratas de los grupos 2 y 3 se les indujo diabetes por administracion de una inyeccion intraperitoneal de STZ (60 mg/kg por cada 1000 g de peso corporal) diluida en buffer citrato de sodio.

A los grupos experimentales 3 y 4 se les administro el tratamiento con VitC (700 mg/kg en el agua de bebida, durante 6 dias), a partir del quinto dia de la induccion de diabetes. Luego de un ayuno de 12 h las ratas se sacrificaron bajo ligera eterizacion y se diseco el higado para obtener un homogeneizado del tejido, registrandose su aspecto macroscopico.

El homogenizado fue mantenido en hielo y en el sobrenadante se determinaron los niveles de las concentraciones de malondialdehido (MDA) por el test para sustancias reaccionantes con el acido 2-tiobarbiturico (tecnica de Ohkawa 1979), dienos conjugados (DC) por el metodo descrito por Wallin (1993) (22) y proteinas totales mediante el kit BioRad Richmond, basado en el metodo de Bradford (1976) (4).

Se utilizo como estandar una solucion madre de 1,41 mg/ml de albumina serica bovina y luego un trozo del higado se homogenizo con sacarosa 0,25 M y se diluyo al 10% p/v para centrifugarse a 12.000 rpm a 4[grados]C durante 10 minutos. Se separo el sobrenadante con pipeta Pasteur y en el se determino la actividad de la superoxido dismutasa (SOD) mediante un kit comercial (Calbiochem).

Otro trozo de tejido hepatico fue homogenizado con la solucion buffer provista por el kit Calbiochem y en el sobrenadante se determino la actividad de la catalasa (CAT) mediante el protocolo de Aebi. Para medir el dano al ADN hepatico en ratas ocasionado por la DM, se realizo una electroforesis en celulas individuales ("ensayo cometa"), tecnica basada en la capacidad de los fragmentos de ADN para ser embebidos en un gel de agarosa y responder a un campo electrico. La corrida del extendido de ADN depende directamente del dano del ADN presente en las celulas.

Es importante mencionar que las lesiones al ADN consisten en rotura de las cadenas despues del tratamiento con alcali o sin este, e incluso de la combinacion con ciertas enzimas, lo cual incrementa la migracion de ADN. Esta tecnica permite detectar danos en el ADN de una celula en condiciones experimentales de pH alcalino, y permite revelar la presencia de rompimiento en una hebra simple o doble del ADN en los sitios labiles a la alcalinidad.

Asi, las celulas en estudio son colocadas en agarosa, lisadas y luego sometidas a electroforesis bajo condiciones especificas. En la lisis, las celulas pierden sus proteinas y no son capaces de reparar el ADN danado. Durante la electroforesis, el ADN danado y fragmentado migra dentro del gel desde el nucleo hacia la direccion del anodo. La cantidad de ADN migrado constituye una medida de la extension del dano.

La observacion del ADN se realizo a traves de la tincion con el colorante bromuro de etidium, siendo examinado por fluorescencia de emision con un filtro de excitacion de 515 nm y emision de 560 nm. Las celulas que contienen ADN danado aparecen despues de la electroforesis con una apariencia de cometa, con una cabeza brillante y una cola. Por el contrario, las celulas que contienen ADN sin lesion, aparecen con un nucleo intacto y sin cola (18).

Los resultados fueron analizados estadisticamente mediante el programa SPSS version 17.0 para Windows, aplicandose una prueba Anova y otra de comparacion multiple con diferencia minima significativa-DMS (p<0,05).

RESULTADOS Y DISCUSION

El estudio realizado evidencio un aumento de los niveles de glucosa sanguinea en las ratas tratadas con STZ. Los datos confirmaron el efecto diabetogenico provocado por este compuesto, el cual se manifiesta hasta los 7 dias post-induccion (Figura 1). Este resultado coincide con el obtenido por otros investigadores, quienes senalan que la STZ genera un efecto diabetogenico en los animales de laboratorio (10, 16).

Tambien se ha demostrado que la administracion de altas dosis de STZ en animales de laboratorio causa la muerte de las celulas beta de los islotes de Langerhans del pancreas en 24 h y su administracion en dosis baja permite realizar el estudio citotoxico de este compuesto (14).

El incremento de la concentracion de glucosa ocasiona aumento proporcional de productos de la glicosilacion no enzimatica, que pueden ser escasamente daninos si se logra un buen control metabolico, pero en caso contrario generan productos finales de la glicosilacion avanzada, con degradacion oxidativa y liberacion de RL que danan la estructura y funcionalidad de las proteinas (17).

El desbalance entre la produccion de RL y antioxidantes genera estres oxidativo, el EO leve puede llevar a la celula a tener mas resistencia para injurias posteriores en una buena regulacion de los sistemas de defensa antioxidante. Por el contrario, si el EO es muy intenso, afectaria a todos los componentes de la celula (ADN, lipidos y proteinas) (15).

Ademas del caracteristico cuadro hiperglucemiante cronico, la DM es responsable de este tipo de complicaciones, por lo que a lo largo de los anos se han buscado alternativas terapeuticas para mejorar la calidad de vida de pacientes diabeticos, como es el caso de la VitC, la cual -por sus beneficios- ha sido utilizada como antioxidante.

En esta investigacion se midio el efecto protector de la VitC ante la generacion de estres oxidativo y dano al ADN en ratas con diabetes experimental. En cuanto al grado de EO, se pudo apreciar un efecto hepatoprotector de la VitC, evidenciado por una disminucion muy significativa (p<0,05) de los niveles de MDA (nmoles/mg de proteinas) en el grupo de diabeticos tratados con VitC, al compararlo con el grupo control (Figura 2). En el caso de los DC, productos iniciales del proceso de lipoperoxidacion, se observo una disminucion de los mismos en los animales tratados con el antioxidante respecto al control (Figura 3).

Al medir la enzima SOD se observo (Figura 4) un aumento significativo de su actividad (p<0,05) expresada en U/ml en el grupo de animales tratados con VitC, al compararlo con el grupo control. En forma similar, se obtuvo un aumento significativo en la actividad de CAT (Figura 5).

Existe evidencia experimental que indica que el EO puede determinar el comienzo y la progresion de las complicaciones tardias de la DM; sin embargo hay controversia respecto a si su aumento es asociativo o causal de esta enfermedad. Se ha demostrado que existe aumento de RL acompanado de una disminucion de agentes antioxidantes en pacientes diabeticos (6).

Los radicales libres son atomos o moleculas que en su ultimo orbital tienen un electron no apareado; al tratar de obtener su estabilidad, puede afectarse la fisiologia de las celulas al oxidar a los lipidos de membrana, a los carbohidratos, a las proteinas o al ADN, lo cual seria un dano causado por el EO (8). En esta investigacion se midio el efecto de la VitC sobre la posible alteracion en el ADN causado por el EO.

En la Figura 6 se puede observar la migracion del ADN, al formarse una imagen nitida de la "cola del cometa", obtenida en los animales diabeticos. Por el contrario, la imagen proveniente del grupo control no revela migracion, ni formacion de la cola, mientras que en las provenientes del grupo tratado con VitC se observo una leve migracion y -en algunos casos- imagenes muy similares al grupo control. Ello permite inferir que la VitC previene danos en el ADN, caracteristicos en los pacientes con diabetes.

En conclusion, surge que la vitamina C constituye un efectivo antioxidante y un importante protector del higado, ante la produccion permanente de radicales libres por diversas fuentes, ademas de ser efectiva en la reparacion y conservacion del ADN.

Agradecimientos. Este trabajo fue financiado por el Consejo de Desarrollo Cientifico, Humanistico y Tecnologico (CDCHT) de la Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado (Venezuela), a traves del proyecto de Codigo 014-VE-2012.

REFERENCIAS

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Mendoza, C.; Flores, C.; Melendez, C.; Marquez, Y.C.; Matheus, N.

Unidad de Investigacion en Ciencias Funcionales "Dr. Haity Moussatche", Fac. Cs. Veterinarias, Universidad Centroccidental "Lisandro Alvarado", Barquisimeto, Venezuela. E-mail: carmenmendoza@ucla.edu.ve

Recibido: 16 febrero 2018 / Aceptado: 22 junio 2018
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Author:Mendoza, C.; Flores, C.; Melendez, C.; Marquez, Y.C.; Matheus, N.
Publication:Revista Veterinaria
Date:Jun 28, 2019
Words:3001
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