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Efecto del tiempo de maduracion in vitro de ovocitos bovinos sobre la progresion meiotica. Nota tecnica.

Effect of Time of in vitro Maturation of Bovine Oocytes on the Meiotic Progression. Technical Note

INTRODUCCION

Durante los ultimos anos la aplicacion de tecnicas in vitro para produccion de embriones se ha incrementado exitosamente [1]. Sin embargo, los embriones producidos in vitro difieren de su contraparte in vivo en muchos aspectos, como por ejemplo la capacidad de desarrollo, morfologia, resistencia a la congelacion y supervivencia despues de la transferencia [9, 13, 23, 30, 39, 40].

La capacidad de un ovocito maduro para superar las etapas de fecundacion, el desarrollo del embrion preimplantacional y la implantacion es denominada capacidad de desarrollo del ovocito y es una medida intrinseca de la calidad del mismo [20]. Los ovocitos madurados in vitro poseen baja competencia de desarrollo comparados con los ovocitos madurados in vivo en parte debido al inadecuado ambiente in vitro que apoya el completo desarrollo de la maduracion [14, 15, 34, 38].

La adquisicion de la capacidad de desarrollo por parte de los ovocitos madurados in vitro es un factor limitante para que se puedan alcanzar con exito las fases de fecundacion, division y desarrollo embrionario [11]. Esta diferenciacion de los ovocitos es orquestada por una interaccion compleja entre factores de crecimiento y citoquinas que permiten la maduracion nuclear y citoplasmatica [3, 4].

La maduracion in vitro de ovocitos bovinos es afectada por muchos factores, como el tiempo y la temperatura de transporte desde el matadero hasta el laboratorio [31], el tamano del foliculo [24, 32], la etapa de desarrollo del ovocito [16], el diametro del ovocito [21], la composicion del medio [25], el tiempo de maduracion [31], las hormonas [35, 45] y los sueros [31]. Un tiempo inapropiado de maduracion puede permitir la formacion anormal de la cromatina [8], el envejecimiento del ovocito [18] y un desarrollo comprometido del mismo [31].

Durante la maduracion in vitro, la extrusion del primer corpusculo polar indica el exito de la maduracion, alcanzando el estadio de metafase II, que ocurre durante las 18-24 horas despues de comenzar la maduracion. Existe la evidencia de que algunos ovocitos maduran rapidamente, observandose el primer corpusculo polar a las 16 horas. Sin embargo, un periodo de cultivo es necesario antes de la fecundacion, para que se pueda alcanzar la capacidad de desarrollo del ovocito [7, 21, 25, 42]. El objetivo del presente trabajo fue estudiar el efecto del tiempo de maduracion in vitro de ovocitos bovinos sobre la progresion meiotica.

MATERIALES Y METODOS

Obtencion y seleccion de ovocitos

Se utilizaron ovarios de vacas mestizas, sacrificadas en mataderos comerciales, ubicados en la Villa del Rosario, estado Zulia, Venezuela, los cuales se transportaron al laboratorio en solucion buffer fosfato (PBS) a una temperatura de entre 35 y 37[grados]C en un contenedor isotermico en un lapso aproximado de 3 horas posterior al sacrificio. Posteriormente, los ovarios fueron lavados con PBS + 50 mg/L de gentamicina a 35-37[grados]C. Foliculos ovaricos entre 2 y 8 mm de diametro fueron aspirados con una aguja de 18 G unida a una jeringa de 10 mL. Se seleccionaron los ovocitos que presentaron un mayor tamano, citoplasma homogeneo y al menos una capa completa de celulas del cumulus compacta [41].

Maduracion in vitro de ovocitos

Una vez seleccionados los complejos ovocito-cumulus (COCs), estos se cultivaron en grupos de 50 en platos de cultivo de 4 celdas contentivos de 250 uL del medio de cultivo tisular 199 (TCM-199, M-7528, Sigma) suplementado con 275 mg/L de piruvato sodico (P-5280, Sigma), 50 mg/L de gentamicina, 146 mg/L de L-glutamina (G-15120, Sigma), 10 [micro]g/mL de Folltropin-V[R] (Vetrepharm, Canada Inc), 1 [micro]g/mL de 17[beta]-estradiol (E-8875, Sigma), factor de crecimiento epidermal (50 ng/mL) y 10% suero fetal bovino (SFB, F-2442, Sigma), a 38,5[grados]C en una atmosfera con 5% C[O.sub.2] en aire saturado de humedad [28].

Tiempo de maduracion y evaluacion de la progresion meiotica

Una vez iniciada la maduracion, los COC se maduraron durante 23 a 27 horas. Para evaluar la progresion meiotica, los ovocitos fueron denudados de las celulas del cumulus mediante agitacion mecanica, luego se fijaron en una mezcla de metanol acido-acetico en proporcion 3:1 durante al menos 24 horas a 4[grados]C. Posteriormente se procedio a tenirlos con aceto-orceina al 1,1%. Una vez tenidos los ovocitos se evaluo la maduracion nuclear de los mismos bajo microscopio optico (400x, Olympus, BX40, Japon), clasificandolos, segun el estadio meiotico alcanzado en: ovocitos maduros (MII + CP: metafase II + corpusculo polar, TeloI: telofase I), ovocitos inmaduros (VG: vesicula germinal; CCII: condensacion cromosomica II; MI: metafase I y AnaI: anafase I) y ovocitos con material nuclear degenerado [41].

Analisis estadistico

Se consideraron como ovocitos maduros, aquellos que al culminar el tiempo de maduracion alcanzaron el estadio de metafase II (MII) o telofase I (Telo I) y que no mostraron signos de degeneracion y ovocitos degenerados los que muestren anormalidades en el material nuclear [37].

Las tasas de maduracion (proporcion de ovocitos totalmente madurados, con relacion al total) fueron analizadas aplicando un procedimiento Proc Logistic del paquete estadistico SAS[R], considerando diferencias estadisticamente significativas cuando P < 0,05 [37].

RESULTADOS Y DISCUSION

La capacidad de desarrollo de un ovocito ha sido definida por First y col. [12] como la capacidad de reiniciar y completar la meiosis, de dirigir la fecundacion y de iniciar los eventos que resultan en el desarrollo embrionario. Durante la maduracion in vitro son muchos los factores que pudieran estar afectando la capacidad de desarrollo de los ovocitos bovinos [17, 24, 35]. Cualquier mejora que se haga en esta etapa incrementara el exito en las fases subsiguientes.

En el presente estudio se evaluo la progresion meiotica de un total de 512 ovocitos que fueron madurados durante 23 a 27 horas. En la TABLA I se muestran los resultados obtenidos tras la maduracion in vitro, agrupados en [menor que o igual a] 24 y >24 horas de maduracion. La tasa promedio de maduracion ovocitaria alcanzada fue de 67,8%, observandose un 4,0% de ovocitos degenerados al final de la maduracion in vitro (MIV). Estos resultados indican que, el sistema de MIV utilizado soporta adecuadamente la maduracion nuclear de ovocitos bovinos.

Se han publicado resultados diversos en relacion a la progresion meiotica de ovocitos MIV, encontrandose en la literatura que las tasas de maduracion oscilan entre un 50% y un 80%. Martino y col. [29] obtuvieron un porcentaje de maduracion de 56,9% por medio de la tecnica de slicing. Hurtt y col. [19], obtuvieron un porcentaje de 77% y Luna y col. [27], obtuvieron una tasa de 80,3%. El exito limitado de la tasa de maduracion obtenida en el presente trabajo, puede ser atribuido a las imperfecciones en el medio de cultivo utilizado para la maduracion ovocitaria. Tal cual se deduce de los estudios de Van de Leemput y col. (1996) citado por Izadyar y col. [22], los cuales concluyeron que las condiciones in vitro no llegan a ser completamente adecuadas para un desarrollo optimo.

In vivo, los ovocitos bovinos alcanzan la maduracion final en el periodo entre el pico de LH y la ovulacion, aproximadamente 30 h despues del pico de LH. Sin embargo, la maduracion nuclear del ovocito (desarrollo a metafase II) pareciera acelerarse in vitro: 24h son suficientes para la maduracion in vitro de ovocitos bovinos obtenidos de foliculos antrales [13].

En el presente trabajo, tras 23 horas de cultivo, la tasa de maduracion ovocitaria alcanzo un 59,71%, valor que se elevo hasta un 83% a las 26 horas de cultivo, disminuyendo luego a un 56,25% a las 27h. La proporcion de ovocitos degenerados tras el cultivo in vitro tambien se incremento con el aumento en la duracion de la maduracion ovocitaria, de un 0% a las 23 horas hasta un 10,41% a las 27 horas (FIG. 1).

Cuando la maduracion ovocitaria tuvo una duracion de 24 horas o menos, la proporcion de ovocitos que fueron clasificados como maduros fue de 59,49% y la de ovocitos degenerados de un 2,53%. En el grupo experimental en el que la duracion de la MIV fue mayor a 24h, la proporcion de ovocitos que alcanzaron el estadio de metafase II + corpusculo polar (MII+CP) fue de 72% y la tasa de degeneracion de un 5,09%. La proporcion de ovocitos en metafase II aumenta significativamente (P<0,05) con el incremento en el tiempo de cultivo, no asi la tasa de degeneracion.

[FIGURA 1 OMITIR]

Yadav y col. [44] estudiaron la maduracion in vitro de ovocitos de cabra (Capra hircus) en medio TCM199 suplementado con suero de vaca en celo y hallaron que al inicio del cultivo (0 h) la mayoria de los ovocitos se encontraban en el estadio de vesicula germinal (VG). En dicho estudio la rotura de la membrana de la VG se iniciaba dentro de las primeras 6 h de cultivo y muchos de los ovocitos completaban este estadio a las 16 h de cultivo. La consiguiente condensacion de cromosomas daba lugar a la metafase I (MI) entre las 12 a 20 h seguida del estadio de MII a las 22 a 36 h, con el numero mayor de ovocitos alcanzando el estado de MII a las 30 h.

Estudios recientes describen una amplia variacion en el tiempo requerido para completar la meiosis in vitro, variando desde las 24 hasta las 32 h [5, 6, 39]. Martino y col. [29], estudiando la competencia de desarrollo de ovocitos de cabra observaron un aumento significativo en la proporcion de ovocitos en MII+CP con el incremento correspondiente en el tiempo de cultivo de 24 a 27h. Son y col. [36], demuestran que la capacidad de desarrollo de ovocitos colectados luego de un tratamiento con gonadotropina corionica humana (hCG) en un programa de MIV humana, se correlaciona con el tiempo de maduracion. Tambien observaron una relacion significativa entre el potencial de desarrollo embrionario y la duracion en alcanzar el estadio de MII.

Se afirma que la baja competencia para el desarrollo de embriones derivados de ovocitos madurados lentamente, puede ser debida a una perdida en la actividad del factor promotor de la fase M, en la produccion de ciclinas y otras proteinas que controlan el ciclo celular. La asincronia en el tiempo de maduracion puede ser debida a diferencias intrinsecas de los ovocitos recuperados de foliculos de tamanos diferentes. Se sabe que el diametro folicular tiene una influencia clara sobre la competencia para el desarrollo de ovocitos de raton (Mus spp.) y de ganado bovino [2, 10, 26, 33, 43]. En el presente estudio, este factor pudiese ejercer un efecto negativo sobre la tasa de maduracion, debido a que los ovocitos obtenidos por medio de la tecnica de slicing se encontraban en foliculos de diferentes diametros (2-8 mm).

CONCLUSIONES

La competencia para el desarrollo de ovocitos bovinos se ve afectada por la duracion de la maduracion in vitro. Una forma mas definitiva de evaluar este efecto deberia ser el analisis de la capacidad de desarrollo de los embriones derivados de ovocitos asi madurados y fecundados in vitro y cultivados hasta el estadio de blastocito.

AGRADECIMIENTO

Los autores expresan su agradecimiento al Consejo de Desarrollo Cientifico y Humanistico (CONDES) de la Universidad del Zulia y a la empresa GENICA por el financiamiento de esta investigacion.

Recibido: 10/03/2009. Aceptado: 14/06/2010.

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Julio A. Landinez Aponte (1,3,4), Patricia C. Villamediana (2), Hugo J. Hernandez Fonseca (1) * y Eleazar Soto Belloso (5)

(1) Laboratorio de Fecundacion in vitro, Unidad de investigacion en Biotecnologia Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias.

(2) Laboratorio de Citogenetica, Unidad de Investigacion en Biotecnologia Animal, Facultad Experimental de Ciencias. Universidad del Zulia. Maracaibo 4505-A, Venezuela.

(3) Postgrado en Produccion Animal, Facultades de Agronomia y Ciencias Veterinarias, Universidad Central de Venezuela. Maracay.

(4) Empresa GENICA. Maracaibo, Venezuela. Venezolana de Inseminacion Artificial y Trasplante de Embriones (VIATECA)

* E-mail: hjhernan@cantv.net
TABLA I

TASA DE MADURACION DE OVOCITOS BOVINOS MADURADOS IN VITRO DURANTE
DIFERENTES HORAS DE MADURACION / RATE OF MATURATION OF BOVINE OOCYTES
MATURED IN VITRO FOR DIFFERENT TIMES OF MATURATION

                   No Total
Tratamiento      de Ovocitos      No Ovocitos

                                  Maduros (%)

[menor que o         237        141 (59,49) (a)
  igual a] 24
> 24                 275          198 (72) (b)

Tratamiento                   No Ovocitos

                    Inmaduros         Degenerados
                                          (%)

[menor que o      90 (37,98) (a)      6 (2,53) (a)
  igual a] 24
> 24                63 (22,91)       14 (5,09) (a)

Maduros: ovocitos que alcanzaron un estadio de metafase II +
corpusculo polar o telofase I. Inmaduros: ovocitos que presentaron un
estadio de vesicula germinal, condensacion cromosomica II, metafase I
y anafase I.

Letras diferentes en la misma columna denotan diferencias
significativas (P<0,05).
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Author:Landinez Aponte, Julio A.; Villamediana, Patricia C.; Hernandez Fonseca, Hugo J.; Soto Belloso, Elea
Publication:Revista Cientifica de la Facultad de Ciencias Veterinarias
Date:Nov 1, 2010
Words:3620
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