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Efecto de temperatura y tiempo de almacenamiento de ovarios de alpacas sobre la tasa de maduracion y division in vitro de ovocitos.

EFFECT OF TEMPERATURE AND TIME OF STORAGE OF ALPACA OVARIES ON IN VITRO MATURATION AND CLEAVAGE RATE OF OOCYTES

INTRODUCCION

En especies domesticas de interes economico, como en el bovino, se emplean biotecnologias reproductivas para contribuir a la mejora genetica animal; sin embargo, estudios sobre biotecnologia reproductiva en camelidos sudamericanos (CSA) son muy limitados (Miragaya et al, 2006), habiendo algunas experiencias en inseminacion artificial y transferencia de embriones. No obstante, la fecundacion in vitro (FIV) es una tecnologia alternativa y factible de ser aplicada en los programas de mejoramiento genetico, y para los que se requieren gametos de hembras con adecuado potencial genetico.

El exito de un protocolo de FIV requiere controlar el tiempo de transporte, asi como el tiempo y temperatura de almacenamiento de los ovarios, sin afectar la calidad y competencia de los ovocitos y su desarrollo (Tas et al, 2006; Huanca et al, 2007; Ribeiro et al., 2008), de modo de asegurar la viabilidad y capacidad de maduracion in vitro (MIV) y posterior desarrollo embrionario. Tiempo y temperatura son dos factores claves que pueden contribuir a los efectos perjudiciales en la calidad del ovocito, en terminos de maduracion nuclear y tasas de division posterior a la FIV (Klumpp, 2004).

Existen diversas investigaciones para el bovino sobre el efecto de la temperatura de transporte y del tiempo de almacenamiento de ovarios sobre la calidad de los ovocitos (Yang et al, 1990; Sirard y Blondin, 1996; Blondin et al., 1997; Schernthaner et al., 1997; Matsushita et al, 2004). En lineas generales, los ovarios del bovino son recuperados entre 1 a 2 horas del sacrificio del animal y colocados a una temperatura de 30[grados]C, donde los ovocitos son obtenidos en el menor tiempo posible (Gordon, 2003).

En ovarios de equinos almacenados por 22-24 h a 15-20[grados]C se llego a obtener una tasa de metafase II (MII) de 38.5%, de division de 48.7% y de blastocistos de 7.7%, indicando que los ovocitos inmaduros almacenados por un dia mantuvieron su competencia de desarrollo in vitro (Matsukawa et al, 2007). Asimismo, se ha logrado obtener gestaciones con ese tipo de ovocitos (Preis et al., 2004).

La proporcion de ovocitos de camellos dromedarios que alcanzaron la etapa de MII de los ovarios colectados y almacenados en solucion salina normal (NSS) a temperatura ambiente por 12 h fue de 43%, y sin diferencias estadisticas con ovarios transportados en NSS tibia y procesados inmediatamente a su llegada al laboratorio; sin embargo, la tasa de MII fue menor (29%) cuando estos ultimos fueron almacenados a temperatura ambiente (Wani y Nowshari, 2005).

El transporte de ovarios porcinos almacenados entre 25-35[grados]C por 6 horas mantiene la competencia de los ovocitos en la MIV, pero las tasas de conservacion son menores en comparacion a un tiempo de transporte de 3 horas (Wongsrikeao et al, 2005). La autolisis celular ocurre en ovarios durante largos periodos de transporte a 35-38[grados]C o cuando se hace a temperaturas de refrigeracion (Holt y Pickard, 1999), aunque hay reportes de buenos resultados de MIV de ovocitos de ovarios felinos que fueron transportados y almacenados a 4[grados]C (Wolfe y Wildt, 1996). Estudios mas recientes concluyen que la recuperacion y transporte de ovarios a 4[grados]C se debe realizar en menos de 6 horas del sacrificio (Naoi et al., 2007).

En el caso de camelidos sudamericanos, y especificamente en la alpaca, no existen reportes sobre el efecto de la temperatura y tiempo de almacenamiento de ovarios en la tasa de maduracion in vitro, fecundacion in vitro y cultivo in vitro (CIV). Por otro lado, teniendo en cuenta que los centros de sacrificio ubicados en zonas altoandinas como Puno, Cusco, Arequipa, Huancavelica y Ayacucho se encuentran alejados de los laboratorios de reproduccion, se requiere evaluar el efecto del tiempo y temperatura de almacenamiento previo a la obtencion de los ovocitos.

MATERIALES Y METODOS

Lugar de Estudio

Se recolectaron 202 ovarios de alpacas en el camal de Pilpichaca (provincia de Huaytara, departamento de Huancavelica) entre febrero y junio de 2010. La historia reproductiva de los animales era desconocida. El procesamiento de las muestras se llevo a cabo en la seccion de Biotecnologia Reproductiva del Laboratorio de Reproduccion Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos (FMV-UNMSM), Lima, Peru, y la tincion y lectura de los ovocitos fijados se llevo a cabo en la Unidad de Reproduccion y Obstetricia de la Facultad de Veterinaria, Universidad de Santiago de Compostela, Lugo, Espana.

Los ovarios se recolectaron directamente del tracto reproductor de los animales luego del sacrificio. Se colocaron en un termo que contenia solucion salina a 0.9% (NaCl), con una temperatura inicial de 35[grados]C. El traslado al laboratorio duro aproximadamente 8 horas, donde llegaron con una temperatura promedio de 24[grados]C. Una vez en el laboratorio, los ovarios fueron distribuidos al azar en los tres grupos experimentales.

Diseno Experimental

Los ovarios fueron distribuidos en tres tratamientos en forma aleatoria, en base a un diseno completamente randomizado (Fig. 1), segun se senala a continuacion:

C: 8 h de transporte y 0 h de almacena miento

T1: 8 h de transporte y 16 h de almacenamiento a 12-15[grados]C

T2: 8 h de transporte y 16 h de almacenamiento a 22-25[grados]C

Ademas, el estudio comprendio dos fases:

Fase 1: Se evaluo la tasa de maduracion nuclear in vitro de ovocitos (Metafase II) para los tres grupos, con tres replicas por tratamiento.

Fase 2: Se evaluo la tasa de division de ovocitos a las 72 h posfecundacion in vitro y la tasa de blastocistos a los siete dias posfecundacion in vitro para los tres grupos, con cinco replicas por tratamiento.

Obtencion y Seleccion de los Ovocitos

Los ovarios se lavaron con solucion salina para eliminar el exceso de sangre. Se removio el tejido circundante al ovario y se procedio a la diseccion (slicing) de cada foliculo ovarico (2 a 6 mm de diametro) sobre una placa Petri con medio de lavado premaduracion. Luego de repetidos cortes, se vertio 0.2 ml del medio de lavado para recuperar el liquido folicular y poder depositar el mayor numero de complejo cumulus-ovocitos (CCOs). Se dejo reposar por 10 minutos (Rivera et al, 2010).

Con la ayuda de un estereomicroscopio, se localizaron los CCOs, seleccionandose los ovocitos con una o mas capas completas de celulas del cumulus no expandidas con aspecto compacto, y citoplasma homogeneo y granulado, frente a ovocitos parcial o completamente denudados (Lorenzo, 1992; Blondin y Sirard, 1995; Hinrichs y Williams, 1997), correspondiendo a los grados 1 a 3 segun la clasificacion de Bertoldo et al. (2010) y Madison et al. (1992).

[FIGURA 1 OMITIR]

Maduracion in vitro

Los ovocitos seleccionados fueron lavados tres veces con medio de lavado premaduracion para eliminar restos de cumulus y tejido ovarico. Luego fueron colocados en grupos de 20 ovocitos por microgota de medio de maduracion TCM-199 suplementado con FSH, y madurados en la incubadora bajo condiciones de 39[grados]C con 5% de C[O.sub.2], 20% de [O.sub.2] y humedad relativa alta durante 20 horas. Luego fueron transferidos a microgotas de medio de maduracion sin FSH y madurados por otras 20 horas bajo las condiciones descritas.

Cumplido el tiempo de maduracion, se eliminaron las celulas del cumulus mediante la agitacion en vortex y se fijaron en etanol acido acetico (3:1), por no menos de 36 horas a 4[grados]C en refrigeracion. Se retiraron los ovocitos de la solucion de fijacion y se colocaron entre 5 a 10 por portaobjeto cubierto con un cubreobjeto adherido con parafinavaselina (1:1). Se adiciono orceina (1% de orceina disuelta en acido acetico al 45%) por un extremo del cubreobjeto para tenir los ovocitos, dejandose secar por 20 minutos. Por ultimo, se sellaron con laca de unas y se evaluaron en un microscopio de contraste de fase a 400X, determinando la fase de maduracion nuclear en las que se encontraban los ovocitos: vesicula germinal (VG), metafase I (MI), anafase-telofase I, metafase II (MII) y degenerados.

Coleccion de Espermatozoides Epididimarios

Se obtuvieron testiculos de alpacas machos adultos, sacrificadas en el mismo camal, y fueron colocados en tampon fosfato salino (PBS) para su transporte. Una vez en el laboratorio, los testiculos fueron lavados, desinfectados y divulsionados para obtener las colas de los epididimos. Estas fueron diseccionadas mientras se anadia una solucion de TRIS-yema de huevo temperada a 37[grados]C. Se encontro una concentracion de 190 x [10.sup.6] espermatozoides/ml, 70% de motilidad espermatica y 51% de funcionalidad de membrana espermatica en promedio. Las muestras fueron refrigeradas hasta el momento de la fecundacion in vitro.

Fecundacion in vitro

Cumplido el periodo de maduracion de los ovocitos y de observar la expansion del cumulus (Gordon, 2003), se lavaron los ovocitos de cada tratamiento por separado con medio de pre-fecundacion, para luego ser colocados en grupos de 20 en microgotas de Medio de fecundacion TL-stock, por no menos de una hora.

Los espermatozoides fueron separados mediante una gradiente discontinua de Percoll de 22.5%:45%, la que se centrifugo por 10 minutos a 600G y luego por 5 minutos a 300G El pellet obtenido fue reconstituido con 30 [micron]l de TL-Stock.

Finalmente, se colocaron 2 pl de suspension de espermatozoides en cada microgota con los ovocitos maduros y se anadieron 2 [micron]l de heparina al 2% y 2 [micron]l de PHE (2 mM Penicilamina, 1 mM Hipotaurina y 250 mM Epinefrina). Se realizo el co-cultivo en una estufa bajo condiciones de 39[grados]C con 5% de C[O.sub.2], 20% de [O.sub.2] y humedad relativa alta durante 18 horas.

Cultivo in vitro

Cumplido el tiempo de co-cultivo de gametos, se retiraron los presuntos cigotos para eliminar las celulas del cumulus y los espermatozoides adheridos a la zona pelucida mediante agitacion por vortex durante 5 minutos. Los presuntos cigotos de cada tratamiento fueron lavados por separado con medio de lavado Pre-cultivo SOF-Hepes y colocados en microgotas de medio cultivo KSOMAA. Luego fueron cultivados por 72 h y se evaluo el desarrollo embrionario temprano (28 celulas) mediante la tasa de division (Khatir et al, 2007). Luego fueron transferidos a medio de cultivo SOF-Stock, donde permanecieron hasta los siete dias posfecundacion para proceder a evaluar el porcentaje de blastocistos.

Analisis Estadistico

Los resultados fueron expresados como porcentajes y distribuidos para cada grupo experimental. Al tratarse de datos cualitativos, se utilizo una prueba no parametrica de Chicuadrado de Pearson. En el analisis de los datos se utilizo el programa SPSS v. 15.

RESULTADOS

En la evaluacion de la maduracion nuclear in vitro se utilizaron 71 ovarios y en la evaluacion de la division posfecundacion in vitro se emplearon los 131 ovarios restantes. En total se obtuvieron 1571 ovocitos de 1813 foliculos diseccionados (slicing). Se seleccionaron 172 ovocitos de buena calidad para la evaluacion de la maduracion nuclear in vitro y 452 ovocitos de buena calidad para la evaluacion de la division pos-fecundacion in vitro. En este ultimo experimento se perdieron 12 ovocitos, quedando 440 ovocitos madurados para que entren a la FIV/CIV.

Los resultados de la maduracion nuclear en MII a las 40 horas de MIV se muestran en el Cuadro 1. Se evidencia que la tasa de MII en el tratamiento de mayor temperatura (T2) fue superior a T1 (p< 0.05), mientras que el Control (0 h) fue superior a los otros dos grupos de almacenamiento (16 h) (p<0.05).

La tasa de division a las 72 h de la fecundacion in vitro y la tasa de blastocistos a los siete dias de la fecundacion in vitro se resumen en el Cuadro 2. Al igual que en el caso de la maduracion nuclear, T2 obtuvo mejores resultados de division embrionaria que T1, aunque no estadisticamente diferentes, mientras que el Control (0 h) fue superior a los otros dos grupos de almacenamiento (16 h) (p<0.05).

Todos los blastocistos presentaron como caracteristica constante la presencia de una coloracion oscura, producto de la presencia de lipidos citoplasmaticos.

DISCUSION

Esta es la primera experiencia que evalua la influencia de la temperatura y el tiempo de almacenamiento de los ovarios sobre la viabilidad de los ovocitos de alpaca para MIV/FIV/CIV en alpacas en el pais. Temperaturas de 12-15[grados]C con 16 h de almacenamiento permitieron una tasa de maduracion de 12.2%, una tasa de division a las 72 h de la fecundacion de 8.1% y una tasa de blastocistos de 14.2% a los 7 dias de la fecundacion.

En una experiencia similar en bovinos, donde se mantuvieron ovarios a 10[grados]C por 24 horas, se obtuvo una tasa de maduracion de 68%, de division en la etapa de morula de 33% y de blastocistos de 25% (Matsushita et al., 2004). Asimismo, Wang et al. (2011) concluyeron que el almacenamiento a 15[grados]C por un periodo de 3 a 4 h tenia un efecto benefico significativo en la calidad y competencia de desarrollo de ovocitos usados para la transferencia nuclear de celulas somaticas (SCNT), debido al alivio del estres en el ovocito, comparado con los ovarios sujetos a temperaturas de almacenamiento de 25 o 35[grados]C.

Al comparar estos estudios con la presente investigacion, se evidencia que los ovarios de alpaca son susceptibles al almacenamiento en temperaturas de 12 a 15[grados]C y que la competencia del ovocito para FIV se ve disminuida. Esta situacion se asemeja a otros estudios donde se reportaron bajas tasas de division y formacion de blastocistos cuando los ovarios fueron guardados a 4[grados]C (Yang et al., 1990) o 10[grados]C (Shigeki y Yasuo, 1993, citado porWani y Nowshari, 2005). Esto puede ser posible debido a que la membrana lipidica de los ovocitos bovinos sufria cambios cuando se exponia a temperaturas inferiores a 20[grados]C (Arav et al, 1996); asi como lesiones del huso meiotico y endurecimiento de la zona pelucida que afectaba directamente la fecundacion (Wlodarczyk et al, 2009). Sin embargo, la fase de transicion lipidica no ha sido examinada para los ovocitos de alpaca.

En el presente estudio se evidencia que la tasa de blastocistos (14.2%) aumenta con respecto a la tasa de division (8.1%), posiblemente debido a la baja temperatura de almacenamiento de los ovarios, dado que las actividades metabolicas de los ovocitos disminuyen con las bajas temperaturas; sin embargo, con el avance del tiempo de cultivo se pudo observar mayor cantidad de ovocitos divididos y que alcanzaron la etapa de blastocistos.

En el caso del tratamiento con mayor temperatura de almacenamiento (22-25[grados]C), se obtuvo una tasa de maduracion de 32.7%, de division a las 72 h de la fecundacion de 32.7% y de blastocistos a los 7 dias de la fecundacion de 20.6%. En investigaciones similares en el camello dromedario, donde los ovarios fueron almacenados a temperatura ambiente por 12 h y donde la proporcion de ovocitos que alcanzaron la etapa de MII fue de 43% (Wani y Nowshari, 2005), se puede observar que los resultados fueron similares, lo que sugiere que la temperatura ambiente juega un papel importante en la viabilidad de los ovocitos de alpaca, demostrado por las buenas tasas de MIV/CIV, comparado con temperaturas mas bajas (12-15[grados]C). Esta conclusion llega a ser relevante cuando se considera el transporte y almacenamiento de ovarios para fines de investigacion o de uso comercial.

En la especie bovina se han realizado estudios que avalan lo mencionado anteriormente. Schernthaner et al. (1997) demostraron que era posible almacenar los ovarios a 15-21[grados]C hasta 12 h antes de la maduracion, sin afectar adversamente la competencia de desarrollo de los ovocitos. Ademas, Yang et al. (1990) sugirieron que los ovarios bovinos pueden ser almacenados a 25[grados]C por 16 h, sin reducir la habilidad del ovocito para ser fecundado y desarrollado hasta la etapa de blastocisto. En equinos se almacenaron ovarios por 22-24 h a 15-20[grados]C y se logro obtener tasa de MII de 38.5%, de division de 48.7% y de blastocistos de 7.7% (Matsukawa et al., 2007); asimismo, en otro experimento se lograron gestaciones a partir de ovocitos MIV recuperados de ovarios almacenados por 18-24 h a 12 y 22[grados]C (Preiset al, 2004). Por otro lado, en ovarios de ovejas almacenados a 20-22[grados]C por 12 h se obtuvieron resultados similares que en ovarios no sometidos a largos periodos de almacenamiento (Garcia Alvarez et al., 2011).

Todas estas experiencias en varias especies corroboran la mejor viabilidad de ovocitos provenientes de ovarios almacenados a temperatura ambiente (22-25[grados]C), asi como en la alpaca, a la vez que se reafirma la importancia de esta variable en el desarrollo de protocolos de FIV en alpacas.

* El almacenamiento de ovarios de alpaca a 22-25[grados]C por 16 h permitio obtener una mayor calidad y tasa de maduracion nuclear (Metafase II) in vitro de los ovocitos (p<0.05) y una mayor tasa de division de ovocitos a las 72 h de la fecundacion in vitro (p<0.05), en comparacion con el mantenimiento de ovarios a 12-15[grados]C.

* No se encontraron diferencias estadisticas entre las tasas de blastocistos debido al almacenamiento de ovarios de alpaca por 16 h a 22-25[grados]C o a 12-15[grados]C.

* Se obtuvo una mayor tasa de maduracion, division de ovocitos y tasa de blastocistos in vitro con 0 h de almacenamiento, en comparacion con 16 h de almacenamiento de los ovarios (p<0.05).

http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v25i4.10783

Agradecimientos

Un especial agradecimiento al Proyecto No. 064 FINCyT-PIBAP 2008 por el financiamiento para el desarrollo del presente trabajo.

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Irma Arriaga C. [1], Wilfredo Huanca L. [1,4], Marino Terreros C. [1], Juan J. Becerra G. [3], Pedro Garcia H. [3], Antonio Ampuero B. [2]

[1] Laboratorio de Reproduccion Animal, [2] Laboratorio de Zootecnia y Produccion Agropecuaria, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Peru

[3] Departamento de Patologia Animal, Unidad de Reproduccion Animal, Universidad Santiago de Compostela, Espana

[3] E-mail: whuanca2002@yahoo.com

Recibido: 20 de diciembre de 2013

Aceptado para publicacion: 12 de agosto de 2014
Cuadro 1. Tasa de maduracion nuclear (Metafase II) de ovocitos
colectados de ovarios de alpacas sacrificadas en el camal de
Huancavelica, Peru (1)

Tratamiento                   No.        Metafase II        Total
                            ovarios                      ovocitos (n)

C (0 h)                       26      47.9% (a)   (34)        71
T1 (16 h, 12-15[grados]C)     24      12.2% (b)   (6)         49
T2 (16 h, 22-25[grados]C)     21      32.7% (c)   (17)        52
Total                         71      33.1%       (57)       172

(1) Los experimentos se replicaron tres veces

(a,b,c) Superindices diferentes dentro de columnas
indican diferencia significativa (p<0.05)

Cuadro 2. Tasa de division a las 72 horas posfecundacion in vitro y
tasa de blastocistos a los siete dias posfecundacion in vitro en
alpacas a partir de 440 ovocitos colectados de ovarios de alpacas
sacrificadas en el camal de Huancavelica, Peru (1)

Tratamiento                 Ovarios     Division     Blastocistos
                              (n)         72 h          7 dias

C (0 h)                       26      46.2% a (43)   33.3% a (31)
T1 (16 h, 12-15[grados]C)     50      8.1% b (12)    14.2% b (21)
T2 (16 h, 22-25[grados]C)     55      32.7% c (65)   20.6% b (41)
Total                         131     27.3 % (120)    21.1% (93)

Tratamiento                   Total de
                            ovocitos (n)

C (0 h)                      100% (93)
T1 (16 h, 12-15[grados]C)    100% (148)
T2 (16 h, 22-25[grados]C)    100% (199)
Total                        100% (440)

(1) Los experimentos se replicaron cinco veces

(a,b,c) Superindices diferentes dentro de columnas
indican diferencia significativa (p<0.05)
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Author:Arriaga C., Irma; Huanca L., Wilfredo; Terreros C., Marino; Becerra G., Juan J.; Garcia H., Pedro; A
Publication:Revista de Investigaciones Veterinarias del Peru (RIVEP)
Date:Oct 1, 2014
Words:4421
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