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Efecto de rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal sobre el crecimiento del vetiver (chrysopogon zizanioides) bajo condiciones de invernadero.

Effect of rhizobacterias promoting vegetal growth on vetiver (Chrysopogon zizanioides) growth under greenhouse conditions

Efeito de rizobacterias promotoras do crescimento vegetal sobre o crescimento do vetiver (chrysopogon zizanioides) baixo condicoes de invernadouro

Introduccion

En los ultimos 30 anos se ha estudiado el efecto de ciertas bacterias habitantes del suelo, que no forman nodulos ni alguna otra estructura con sus huespedes, pero que han mostrado ser capaces de producir cambios fisiologicos en el desarrollo y crecimiento de las plantas a las que se asocian, a estas se les conoce como rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal (RPCV) (Lugtenberg y Kamilova, 2009).

Los suelos degradados son abundantes en todo el mundo, estos suelos se vuelven economicamente inservibles y no cultivables, una posibilidad de rehabilitacion de estos, es mediante el uso de pastos. El Vetiver (Chrysopogon zizanioides L.) es utilizado en la prevencion y control de la erosion de suelos, debido a que las raices emiten de los nodos de los tallos rebrotando aun cubiertos de sedimentos, este pasto forma barreras verdes, que son de utilidad para proteger acequias, canerias y cursos de agua, estabilizador de taludes en caminos y carreteras. Se puede emplear para la formacion de humedales para fitorremediacion (Brandt et al., 2006). El Vetiver se ha reportado resistente a metales pesados, a una amplia gama de acidez y alcalinidad y salinidad, y se ha reportado que es capaz, en combinacion con hongos micorrizico-arbusculares, de extraer metales a partir de suelos contaminados (Khan et al., 2003; Lou et al., 2007).

Las RPCV cuando se usan como control biologico, su capacidad se explica mediante la produccion de diversos tipos de compuestos, que estan sujetos a la regulacion dependiente de la densidad celular (Ferluga et al., 2008). El antagonismo es mediado generalmente por la produccion de metabolitos secundarios antimicrobianos (Sivasakhti et al., 2014), sideroforos (Hofte y Bakker, 2007) y por enzimas hidroliticas (Diby et al., 2005). El objetivo del presente trabajo fue observar el efecto de las RPCV seleccionadas, sobre el crecimiento y desarrollo del pasto vetiver (Chrysopogon zizanioides) creciendo en un solario, bajo condiciones controladas.

Metodos

Aislamiento de las rizobacterias Las raices del vetiver, provenientes de 1 zona del estado de Puebla (Huauchinango) fueron esterilizadas superficialmente sumergiendolas en una solucion (v/v) de etanol al 70 % y 6,5 % (v/v) de cloro comercial por 10 minutos y enjuagadas (un minimo de 5 veces) con agua destilada esteril. Estas raices esterilizadas fueron suspendidas en 0,05 M PBS y trituradas en un mortero con un pistilo esteril durante 3 minutos (100 ml de PBS por cada 5 g de raices, en peso fresco). La suspension resultante fue sembrada en los medios siguientes: Agar nutritivo adicionado con 8 hidroxiquinolina (50 mg/l) y Agar Pseudomonas adicionado con cetrimida (100 mg/l), e incubada por 3-5 dias a 30 oC, hasta que se detecto crecimiento.

Las colonias contadas y seleccionadas despues de 48 h de incubacion a 25 oC, se conservaron en viales con Agar Nutritivo a temperatura ambiente para su identificacion posterior.

Identificacion

Esta se realizo determinando la morfologia colonial de los aislados, asi como su tincion de Gram, prueba de oxidasa y catalasa y dependiendo de su comportamiento en el Agar Pseudomonas y el Agar McConkey, se utilizaron las galerias API 20NE y API 20E para su identificacion, siguiendo las direcciones del fabricante (Biomerieux)

Seleccion de cepas en base a su actividad antagonista vs hongos del suelo

Se probaron 53 aislados de RPCV vs 10 hongos de reto, provenientes de la rizosfera del vetiver. Para esto se utilizo agar Nutritivo a pH=6,0.

Previamente se hicieron crecer masivamente los hongos en placas de Agar V8 pH=5,5, de manera de obtener un crecimiento confluente en la superficie de la placa, posteriormente se corto con un bisturi esteril una porcion de 1 [cm.sup.2], y se deposito en una placa de agar Nutritivo, donde se habian sembrado por estria simple 3 RPCV, dejando el trozo de agar del hongo a 1 cm de distancia de las RPCV. Se registraron las posibles interacciones en las rizobacterias contra los hongos de prueba.

Ensayo de espermosfera con semillas de Alfalfa var. Atlixco Se realizaron ensayos de prueba para promocion del crecimiento con alfalfa para establecer que las rizobacterias no produjeron efectos patogenicos en otra especie vegetal, segun el metodo de Kloepper et al. (1985).

Las semillas de Medicago sativa L. var. Atlixco fueron desinfectadas con etanol al 70 %, durante 30 segundos, enjuagadas una vez con agua destilada esteril y posteriormente desinfectadas con cloro al 2 % durante 5 minutos, siendo enjuagadas 7 veces con agua destilada esteril para eliminar el cloro remanente. 5 semillas desinfectadas fueron colocadas sobre placas de agar agua, inoculadas cada una con una suspension bacteriana, equivalente a 1 x[10.sup.6] ufc, y mantenidas en la oscuridad durante 48 h. Se fotografiaron con una camara Sony en un microscopio estereoscopico Zeiss, para registrar los resultados para cada una de las rizobacterias retadas.

Tolerancia a metales

Esta se llevo a cabo sembrando las rizobacterias, con 24 horas de incubacion en caldo Nutritivo a una absorbancia de 0,6, en Medio agar Nutritivo adicionado con 50,100 o 150 ppm. Se determino la presencia o ausencia de crecimiento a las 24, 48 y 72 horas.

Produccion de Biosurfactantes Se realizo por el metodo de Pinzon y Ju (2009), mediante la produccion de biosurfactantes en placas de Agar Cetrimida, con un decremento de la concentracion del detergente a 100 mg/l.

Produccion de sideroforos Se llevo a cabo mediante 2 procedimientos: el ensayo quimico universal para la produccion de sideroforos (Schwyn y Neilands, 1986) y mediante la prueba de crecimiento en Agar Nutritivo adicionado con 100 ppm de 2,2'-dipiridilo (modificado de Rachid y Ahmed, 2005).

Resultados

Los generos de hongos, que fueron aislados de la rizosfera del vetiver y se utilizaron para el reto con las rizobacterias fueron: Scopulariopsis sp, Stemphyllium sp, Paecilomyces sp Penicillium sp, Phytophtora sp, y Alternaria sp. Con una tasa de antagonismo que vario entre 72 y 100 %, dependiendo de la rizobacteria y el hongo de reto, siendo mas sensible Penicillium spp y Phytophthora spp el mas resistente al ataque.

A partir de las cepas bacterianas aisladas de rizosfera y rizoplano del Vetiver, se seleccionaron 54 rizobacterias, con al menos dos de las siguientes propiedades: produccion de sideroforos (100 %), de biosurfactantes (74 %), de otras sustancias antifungicas (90,7 %) y solubilizacion de fosfatos (14,8 %). El genero con mayor incidencia de produccion de sustancias con accion biologica fue Pseudomonas spp. (82,3 %, principalmente P. fluorescens [67,6 %] y P.putida [14,7 %]), Burkholderia spp. (5,8 %), Enterobacterias (5,8 %) y el resto otros generos de bacilos Gram-negativos no fermentadores [5,8 %]. (Ver tabla I).

Despues de 30 dias de crecimiento en solario a las plantas de alfalfa inoculadas con las 20 rizobacterias, se detecto que todos los tratamientos mostraron rendimientos significativos en el peso seco de la parte aerea y de las raices con respecto a los testigos negativos (Figura 1). Las 5 rizobacterias que mostraron una mayor promocion de la alfalfa fueron en orden descendente:

Enterobacter H1b> Pseudomonas H105> Enterobacter H17a> Pseudomonas H50> Enterobacter 14a

En el caso del vetiver tambien notamos efectos beneficos tanto en el peso seco de la parte aerea como en las raices, 45 dias despues de la inoculacion. Aunque los efectos variaron con respecto a las cepas de prueba, respecto del ensayo con la alfalfa, segun el siguiente orden descendente:

Enterobacter H14a> Pseudomonas H105> Pseudomonas H50> Enterobacter H1b> Enterobacter H17a

Se observa que aunque las 5 cepas funcionan como RPCV, su respuesta varia dependiendo de la especie de planta utilizada para el reto (Figura 2).

Discusion de resultados

Los posibles mecanismos que explican el antagonismo por parte de las rizobacterias hacia los hongos fitopatogenos son los siguentes:

Los sideroforos proveen una ventaja ecologica en la supervivencia tanto de plantas como de rizobacterias debido a que estos median interacciones competitivas que producen la exclusion de los fitopatogenos y otros competidores microbianos en la rizosfera mediante la reduccion de la disponibilidad del hierro necesario para su reproduccion y crecimiento.

Deshwal y Kumar (2013) mencionan que entre los factores involucrados en las interacciones plantamicroorganismo, asi como entre microorganismo-microorganismo en la rizosfera, la produccion de sideroforos y de HCN ha recibido una atencion especial.

Los ramnolipidos son los biosurfactantes producidos por P aeruginosa y los lipopeptidos de P. fluorescens causan inmovilidad y la lisis completa de las zoosporas (en menos de 1 minuto) de Phytophthora aphanidermatum, Plasmopara lactucae-radicis y de Ph. caps/'c/'.(Hultberg et al., 2011)

La produccion de sustancias antlfunglcas especificas tales como el acido 1-fenazlncarboxillco, la fenazlncarboxamlda, el 2.4-dlacetllflorogluclnol (DAFG), la ploluteorlna y la plrrolnltrlna, entre otros (Dllantha etal., 2005). Seria Interesante discriminar cual de estas sustancias son las responsables del antagonismo de nuestras rizobacterias hacia los hongos retados. Maurhoferetal., (2004)determinan que la produccion de antibioticos en diversas cepas de pseudomonas fluorescentes es uno de los principales factores en la supresion de patogenos de las raices de las plantas.

Los blosurfactantes como la vlscoslnamida y los rhamnolipidos poseen efectos principalmente sobre las zoosporas de los oomicetos, ya que producen su destruccion en menos de un minuto de exposicion (Nielsen et al., 2003).

En un estudio en Tailandia, Leaungvutiviroj et al. (2010) encuentran que las condiciones de sus suelos de prueba,con baja fertilidad, gran acidez y alta salinidad, el pasto vetiver selecciono una gran cantidad de microorganismos beneficos, principalmente rizobacterias y micorriza arbuscular, ya que se incrementaron los nutrientes del suelo y se mejoraron algunas propiedades fisicas del mismo.

El incremento de la colonizacion bacteriana incitada por exudados carboniferos especificos provenientes de las raices de las plantas y la capacidad de ciertas bacterias para modular el metabolismo vegetal son cuestiones claves para estudios ulteriores, debido a que dan ideas acerca de las posibles relaciones mutualistas entre las plantas y los endofitos (Hardoim et al., 2008)

Conclusiones

El genero Pseudomonas predomino entre los aislamientos de la rizobacterias.

La mayoria de las rizobacterias produjo al menos 2 diferentes metabolitos con actividad antifungica (sideroforos, biosurfactantes entre otros).

Se pudo demostrar la actividad promotora de crecimiento de las cepas seleccionadas, puesto que fueron capaces de promover cambios beneficos tanto en las plantas de alfalfa como en el vetiver mismo, lo que las hace candidatas para formar parte de un inoculante para la promocion del desarrollo y crecimiento de plantas de interes agricola.

Recibido: 4-9-14; Aprobado: 19-11-14

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A. Munoz G. (1) Y. Santoyo P. (2) M. L. Cedillo R. (3) M. C. Villegas H. (4) J. A. Munive H. (5) J. Ruiz C. (6)

(1) Quimo, MSc. Benemerita Universidad Autonoma de Puebla (BUAP). e-mail: amugar@vahoo.com.

(2) Biolo, MSc. BUAP. e-mail: vuririasp@.vahoo.com.mx.

(3) Quimo, Dra. BUAP. e-mail: lcedil9@gmail.com.

(4) Quimo, Dra. Instituto Politecnico Nacional. e-mail: marycarmenvm@yahoo.com.

(5) Quimo, Dr. BUAP e-mail: munive68@yahoo.fr. 6 Agrono, Dr. BUAP. e-mail: ajcareaga@gmail.com

Leyenda: Figura 1. Efecto de la inoculacion con rizobacterias sobre la Alfalfa (Medicago sativa L.).

Leyenda:Figura 2. Efecto de las rizobacterias sobre el crecimiento del vetiver (Vetiveria zizanioides L.), a los 15, 30 y 45 das despues de la inoculacion con las rizobacterias.
Tabla I. Resumen de efectos de las rizobacterias seleccionadas,
resistencia a los metales pesados, prueba cualitativa de
estimulacion de espermosfera y antagonismo a hongos de la rizosfera.

                              No de     Efecto de Hongos
Rizobacteria probada         metales      Antagonizados
                            tolerados     Espermosfera

Enterobacter sp H1b             6             ++ 7
Pseudomonas putida H5b          5              -7
Enterobacter H14a               5              7
PI-H16                          6             ++ 0
Enterobacter H17a               6             ++ 2
P. fluorescens H19b             5             ++ 6
Burkholderia sp H98             5              0
Enterobacter N2                 5             ++ 5
Enfecobacfer N14                5             ++ 8
Enterobacter/Pantoea N19        5             ++ 7
P. putfda N21                   6              5
Serraria N163                   5             ++ 2
P. fluorescens H50              5             ++ 8
P. fluorescens H105             4             ++ 4
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Title Annotation:Agronomia
Author:Munoz G., A.; Santoyo P., Y.; Cedillo R., M. L.; Villegas H. M. C.; Munive H. J. A.; Ruiz C., J.
Publication:Geominas
Date:Dec 1, 2014
Words:2643
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