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Efecto de las lipoproteinas de baja densidad y la trehalosa sobre la actividad enzimatica antioxidante del semen bovino criopreservado.

Effect of low-density lipoproteins and trehalose on antioxidant enzymatic activity of cryopreserved bovine semen

INTRODUCCION

La criopreservacion de los espermatozoides bovinos es una herramienta utilizada en la biotecnologia reproductiva para difundir el germoplasma de animales geneticamente valiosos (Anzar y Graham, 1995). Este procedimiento genera diferentes tipos de estres en los espermatozoides, entre ellos el estres oxidativo, el cual es ocasionado por la excesiva produccion de especies reactivas de oxigeno (ERO) (Chen et al., 2015), que disminuyen el perfil de las enzimas antioxidantes (Bilodeau et al., 2000), debido a la alta susceptibilidad de los espermatozoides (Andrabi, 2009), a pesar de que cuentan con sistemas de defensa antioxidante enzimatico.

El sistema de defensa antioxidante enzimatico esta compuesto por la superoxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT), la glutation peroxidasa (GPx) y la reductasa, las cuales son importantes para mantener la viabilidad, la integridad de la membrana plasmatica y acrosomal, la movilidad y el ADN de los espermatozoides bovinos (Hu et al., 2010; Asadpour et al., 2012; Lecewicz et al., 2017; Lone et al., 2018). Las consecuencias del estres oxidativo se pueden disminuir suplementando los diluyentes de congelacion con antioxidantes. Se ha sugerido que la inclusion de SOD (100 U/ml) en los diluyentes con yema de huevo (YH) (20% v/v) puede mejorar la tolerancia de los espermatozoides de los toros (Bos taurus) (Baie et al., 2017) y gayal (Bos frontalis) a la criopreservacion (Perumal, 2014).

Adicionalmente, se ha demostrado que tanto la adicion de lipoproteinas de baja densidad (LDL) (8% v/v) como de trehalosa (T) (100 mM), mej ora la actividad de CAT y GPx en los espermatozoides bovinos, reflejandose en los parametros de calidad seminal posdescongelacion en comparacion con la YH (20% p/v). Sin embargo, se requieren mas estudios para determinar la capacidad antioxidante de la trehalosa (100 mM) en el semen de bovino criopreservado (Hu et al., 2010, 2011). La YH es considerada una fuente importante de LDL, responsable de la resistencia al choque termico y la mejora de la movilidad, a traves de la prevencion de la perdida de los fosfolipidos de la membrana (Amirat et al., 2004; Cardoso et al., 2010). Sin embargo, se reporta la presencia de otros componentes de la YH como las HDL, las cuales afectan el metabolismo espermatico (Nau et al., 2003).

Una alternativa esta en el uso de yema de huevo centrifugada (YHC), la cual conserva las LDL y posee una menor cantidad de otros constituyentes de la YH como chalazas, proporcionando una mayor proteccion de la movilidad, de la integridad de membrana y de la morfologia de los espermatozoides en los procesos de congelacion-descongelacion (Nouri et al., 2013). La YHC se ha evaluado con buenos resultados en la congelacion de espermatozoides caninos (Restrepo et al., 2017) y equinos (Nouri et al., 2013). El objetivo de este estudio fue evaluar la capacidad antioxidante enzimatica del semen bovino criopreservado con diferentes fuentes de lipoproteinas de baja densidad (LDL) y trehalosa (T).

MATERIALES Y METODOS

Animales

Se seleccionaron 10 eyaculados de cinco toros sanos y sexualmente maduros de razas Angus y Holstein (Bos taurus) ubicados en granjas del departamento de Antioquia, Colombia. Los toros se mantuvieron bajo condiciones controladas de manejo y alimentacion. El procedimiento de la colecta fue supervisado y asesorado por un veterinario para evitar el estres y la incomodidad en los animales. Todos los procedimientos fueron aprobados por el comite de etica y experimentacion con animales del Politecnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid.

Colecta y Evaluacion Seminal

Las muestras de semen se colectaron una vez a la semana durante 10 semanas mediante el uso de un electroeyaculador (Electrojac 6, EEUU). Primero, el toro fue inmovilizado mecanicamente en un brete, se corto el pelo del prepucio y se indujo la miccion con un masaje estimulante. El orificio del prepucio se lavo con una solucion salina y se seco con una toalla de papel. Posteriormente, se realizo una evacuacion rectal antes de insertar la sonda y encender el electroeyaculador, cuyo voltaje aumento automaticamente (Baie et al., 2017).

El eyaculado se recogio en una bolsa de plastico esteril. Se estimo su color y se determino el volumen, pH, concentracion de espermatozoides y movilidad masal e individual utilizando un tubo de recoleccion de vidrio graduado, tiras indicadoras de pH (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania), un espectrofotometro especifico Spermacue[R] (Minitube, Alemania) y un microscopio de contraste de fase (Eclipse E200, Nikon, Japon) (Dominguez et al., 2008), respectivamente. Los requerimientos minimos de calidad seminal para procesar los eyaculados fueron: 70% de movilidad total y una concentracion espermatica de 500 x [10.sup.6] espermatozoides/ml (Khumran et al., 2015).

Dilucion y Suplementacion del Semen

Las muestras de semen se diluyeron en alicuotas separadas a una concentracion final de 30 x [10.sup.6] espermatozoides/ml en el diluyente Triladyl[R] (Minitube, Alemania), previamente preparado de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Luego se suplementaron para los diferentes tratamientos con yema de huevo de gallina (YH, 20% v/v), yema de huevo de gallina centrifugada (YHC, 20% v/v), lipoproteinas de baja densidad (LDL, 8% v/v), trehalosa (T, 100 mM) (Merck, Alemania) o TLDL (T 100 mM y LDL 8% v/v). La YHC se obtuvo de acuerdo con el protocolo descrito por Montoya et al. (2017) y las LDL se obtuvieron mediante el protocolo descrito por Hu et al. (2011). Las muestras de semen diluido se colocaron en un Equitainer (Hamilton Biovet, EEUU) a 4 [grados]C para ser transferidas al Laboratorio de Andrologia del Politecnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid (Bello, Antioquia, Colombia).

Congelacion y Descongelacion del Semen

Las muestras de semen diluido fueron equilibradas a 4 [grados]C por 1 h en un refrigerador y luego se empacaron en pajillas de 0.25 ml (IMV, Francia) y se sellaron con alcohol de polivinilo (Merck, Alemania). Posteriormente, se colocaron en racks para pajillas a 4 cm por encima de la superficie del vapor de nitrogeno liquido (L[N.sub.2]) durante 15 min, para finalmente almacenarse en un tanque con L[N.sub.2]. Despues de una semana, dos pajillas de cada tratamiento fueron descongeladas en bano de agua a 37 [grados]C durante 1 min. La evaluacion de la actividad enzimatica antioxidante del semen criopreservado se realizo despues de la descongelacion (Khumran et al., 2015).

Actividad Antioxidante Enzimatica

Para medir la actividad de GPx se preparo una solucion de reaccion compuesta por 790 [micron]l medio de incubacion (buffer fosfato de potasio, EDTA 1 mM, pH 7.7), 20 [micron]l glutation reducida (2 mM), 30 [micron]l enzima glutation reductasa (0.15 U/ml), 10 [micron]l azida (0.4 mM), 10 [micron]l NADPH (0.1 mM), 50 [micron]l peroxido de hidrogeno ([H.sub.2][O.sub.2], 0.5 mM) y 90 [micron]l muestra de semen descongelado. Se midio el descenso en la absorbancia por espectrofotometria. Las lecturas se realizaron en celdas de cuarzo a 340 nm durante 5 min (Tavilani et al., 2008).

Para la SOD, se adapto el protocolo de Weydert y Cullen (2010) para evaluar el sistema NADH (dinucleotido de nicotinamida y adenina reducida, 156 [micron]M, pH 7.4) / PMS (metosulfato de fenazina, 10 [micron]M, pH 7.4). Para esto, se preparo una solucion de reaccion compuesta por 60 [micron]l NBT (5 mM), 60 [micron]l NADH, 15 [micron]l muestra de semen descongelado y 25 [micron]l PMS. Las lecturas se realizaron en multipozos a 560 nm cada 45 s durante 180 s para calcular el incremento de la absorbancia por segundo.

La actividad de CAT se evaluo mediante la medicion de la desaparicion del [H.sub.2][O.sub.2]. Se preparo una solucion buffer fosfato de potasio (10 mM, pH 7.0) que contenia: EDTA (1 mM), Triton x-100 (0.1%) y [H.sub.2][O.sub.2] (20 mM). La solucion de reaccion estuvo compuesta por 1080 [micron]l buffer fosfato de potasio y 45 [micron]l muestra de semen descongelado. Las lecturas se realizaron en celdas de cuarzo. Se midio el descenso de la absorbancia por espectrofotometria a 240 nm durante 3 min. Una unidad de CAT se definio como 1 [micron]mol [H.sub.2][O.sub.2] consumido por minuto. Las lecturas para las tres enzimas se realizaron mediante un espectrofotometro 6405 UV/Vis (Jenway, Burlington, EEUU) (Aebi, 1984).

Analisis Estadistico

Se utilizo un modelo de bloques al azar, donde el efecto de los tratamientos se bloqueo por el eyaculado y el toro. Se valido la normalidad de los datos a traves de la prueba Kolmogorov-Smirnov. Las fuentes de variacion se evaluaron a traves de un modelo lineal generalizado (GLM) y la comparacion de las medias entre los tratamientos se realizo mediante la prueba de Tukey. Se definio la pajilla de semen como unidad experimental. Todos los analisis se desarrollaron utilizando el software SAS 9.2.

RESULTADOS Y DISCUSION

Los valores encontrados para la actividad enzimatica antioxidante del semen criopreservado (Cuadro 1) fueron superiores a los reportados por Lecewicz et al. (2015). Sin embargo, se conoce que la actividad enzimatica antioxidante podria incrementarse por el aporte de los diferentes componentes de los diluyentes, como la YH (Restrepo et al., 2016); un medio rico en antioxidantes no enzimaticos como la vitamina E, la vitamina B12, la biotina y la fosvitina (Seuss-Baum, 2007).

Adicionalmente, el efecto del animal y de sus eyaculados mostro tener gran influencia al ser significativo en los modelos estadisticos aj ustados para cada enzima antioxidante (p<0.05). Sin embargo, estos factores sumados al efecto del tratamiento explicaron apenas parcialmente la variabilidad de los resultados, lo cual se refleja en los coeficientes de variacion ([R.sup.2]), todos por debajo del 50% (Cuadro 1). Es posible que otros efectos debidos a componentes no evaluados tengan mayor influencia sobre los resultados que los evaluados en este estudio.

Se ha encontrado una correlacion directa entre la vitamina E y la actividad enzimatica antioxidante de CAT en el suero humano (Ondreicka et al., 1998), una asociacion entre la vitamina B12 y la actividad de CAT en la sangre humana (Lee et al., 2016) y una correlacion positiva entre los niveles de biotina en la sangre con las enzimas GSH, GPx y CAT (Al-Qudah e Ismail, 2012). Dichas correlaciones podrian darse tambien en el semen bovino criopreservado. Esto explicaria la mayor actividad de las enzimas CAT y GPx en el semen criopreservado en los medios suplementados con YH y YHC (Cuadro 2). Ademas, la actividad del sistema enzimatico antioxidante de la YH fue similar a la encontrada en la YHC, lo cual permite deducir que en la YHC permanecen la mayoria de enzimas antioxidantes, asi como otros componentes como cofactores que favorecen su actividad.

Por otra parte, se ha reportado que las LDL (8%) y la T (100 mM) potencian la actividad de CAT y GPx, aunque los niveles de SOD no se ven afectados por estos suplementos en comparacion con la YH (20%) (Hu et al., 2010, 2011). Los resultados de este estudio evidencian que los medios que contenian LDL, tanto purificada (LDL y TLDL) o como un componente natural (YH y YHC), presentaron mayor actividad de CAT. Adicionalmente, no hubo cambios en los niveles de SOD para ninguno de los tratamientos (Cuadro 2).

De acuerdo con Iqbal et al. (2016), aunque se ha sugerido que la concentracion optima de T para la criopreservacion de semen es 100 mM, una concentracion de 30 mM mejora la actividad de las enzimas antioxidantes del semen bovino. Asi mismo, la actividad de CAT, SOD y el glutation total son mayores despues de la dilucion y antes del enfriamiento, mientras que CAT y glutation total son mayores posdescongelacion, lo cual incluso influye en las tasas de fertilidad in vivo. Esto sugiere que posiblemente la concentracion T (100 mM) empleada en esta investigacion, no necesariamente promueve de la mejor manera la actividad antioxidante enzimatica del semen bovino, lo que lleva a plantear la evaluacion de otras concentraciones de este disacarido.

Se sugiere que los procesos de congelacion conducen a la perdida de la actividad de defensa antioxidante, principalmente a causa de la alteracion de las enzimas antioxidantes (Isachenko et al., 2004). En este orden de ideas, es congruente que la suplementacion del diluyente de congelacion con YH o YHC mejore la actividad enzimatica antioxidante del semen y como tal, pueda tener un efecto positivo sobre la calidad seminal posdescongelacion. En tal sentido, se ha reportado una correlacion positiva entre las enzimas antioxidantes y los parametros de calidad del semen (Lone et al., 2018). Asi mismo, diferentes estudios informan que la suplementacion con estas enzimas mejora la calidad posdescongelacion del semen bovino (Asadpour et al., 2012; Perumal 2014), lo cual podria atribuirse a la accion conjunta de los antioxidantes que ocasiona una mayor proteccion en contra de las ERO (Ghiselli et al., 2000). Es asi que una alternativa para potenciar el efecto crioprotector de los medios que no contienen YH o sus derivados y en su lugar se suplementan con LDL y/o T podria ser la inclusion de otros agentes antioxidantes enzimaticos y no enzimaticos.

CONCLUSIONES

* Los diluyentes suplementados con yema de huevo (YH), yema de huevo centrifugada (YHC) y lipoproteinas de baja densidad (LDL) potencian la actividad antioxidante de la catalasa y la glutation peroxidasa del semen bovino criopreservado, lo cual podria ser determinante en la calidad espermatica posdescongelacion.

* La suplementacion del medio de congelacion para semen bovino con diferentes fuentes de LDL y trehalosa no influye en la actividad antioxidante de la superoxido dismutasa posdescongelacion.

* El uso de YHC en el diluyente para la congelacion de semen bovino es una alternativa promisoria dado su efecto promotor de la actividad enzimatica antioxidante posdescongelacion, sumado a la eliminacion de componentes de la YH con efectos deletereos sobre la calidad seminal.

http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v30i1.15680

Agradecimientos

Al personal de los laboratorios de Biotecnologia Animal del Politecnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid y Ciencia de los Alimentos de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellin, por su ayuda en la fase experimental de este estudio. Al Politecnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid, por la financiacion de esta investigacion.

LITERATURA CITADA

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Elizabeth Varela G. [1, 4], Benjamin A. Rojano [2], Giovanni Restrepo B. [3]

[1] Politecnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid, Antioquia, Colombia

[2] Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, sede Medellin, Antioquia, Colombia

[3] Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia, sede Medellin, Antioquia, Colombia

[4] E-mail: elvarelagi@unal.edu.co

Recibido: 6 de mayo de 2018

Aceptado para publicacion: 17 de octubre de 2018
Cuadro 1. Resultados de los modelos estadisticos para la actividad
antioxidante enzimatica en semen de toros Angus y Holstein

Variable        n      Media       DE      CV (%)     EE     [R.sup.2]
dependiente            (U/ml)

SOD             38     2820.1    2806.4     99.5    455.2       0.41
GPx             97     5810.7    9279.5    159.7    942.1       0.36
CAT             92    52577.5    71968.0   136.8    7503.1      0.22

SOD: superoxido dismutasa; GPx: glutation peroxidasa; CAT: catalasa

DE: desviacion estandar; CV: coeficiente de variacion; EE: error
estandar; [R.sup.2]: coeficiente de determinacion

Cuadro 2. Comparacion de las medias ([+ o -] desviacion estandar)
de la actividad antioxidante del semen bovino criopreservado

Tratamiento                SOD (U/ml)

YH                  1144.8 [+ o -] 826.6 (a)
YHC                2346.57 [+ o -] 1888.3 (a)
LDL                3965.0 [+ o -] 2144.9 (a)
T                   3324 [+ o -] 3233.5 (a)
TLDL               3269.8 [+ o -] 4463.6 (a)

Tratamiento                GPx (U/ml)

YH                 10582.5[+ o -] 13650.0 (a)
YHC               12992.2 [+ o -] 11037.4 (a)
LDL                3070.1 [+ o -] 4489.1 (b)
T                    1253 [+ o -] 955.0 (b)
TLDL                1617.2 [+ o -] 964.3 (b)

Tratamiento                CAT (U/ml)

YH                84829.5 [+ o -] 72368.8 (a)
YHC               82456.1 [+ o -] 89906.6 (a)
LDL               39102.5 [+ o -] 61866.0a (b)
T                   18875 [+ o -] 41432.0 (b)
TLDL              36840.8 [+ o -] 66014.5 (ab)

YH: yema de huevo. YHC: yema de huevo centrifugada. LDL: lipoproteinas
de baja densidad. T: trehalosa. TLDL: lipoproteinas de baja densidad y
trehalosa

SOD: superoxido dismutasa. CAT: catalasa. GPx: glutation peroxidasa

Letras diferentes dentro de filas representan significancia
estadistica (p<0.05)
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Author:Varela G., Elizabeth; Rojano, Benjamin A.; Restrepo B., Giovanni
Publication:Revista de Investigaciones Veterinarias del Peru (RIVEP)
Date:Jan 1, 2019
Words:3979
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