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Efecto de la temperatura y el tiempo sobre la carga bacteriana, concentracion de histidina libre y la produccion de histamina en el musculo de la corvina (Cysnoscion maracaiboensis).

RESUMEN

Para estudiar los factores que afectan la produccion de histamina en el musculo de la Corvina (Cysnoscion maracaiboensis), se analizaron 30 ejemplares de dicha especie. Estos fueron divididos en tres grupos de 10 pescados, y colocados a temperaturas de 4, 10 y 28[grados]C respectivamente. A todas las muestras les fueron medidas, cada 24 horas, el numero de bacterias mesofilas aerobicas totales utilizando el metodo de conteo en placas recomendado por la American Public Health Association (APHA). Tambien se midieron, por cromatografia liquida de alta resolucion, los niveles de histidina e histamina. Las colonias de bacterias aerobicas fueron aisladas en agar MacConkey e identificadas utilizando el metodo API. Se determino que el numero de bacterias alcanzo su maximo valor a las 24 horas, a la temperatura de 28[grados]C. No hubo diferencias significativas entre el numero de bacterias a 4 y 10[grados]C a las 0 y 24 horas, encontrandose diferencias (P<0,05) a las 48 horas. La concentracion de histidina aumento en forma rapida a 28[grados]C, de 202,75 ppm a 1003,61 ppm, siendo este ultimo el valor maximo para todas las muestras. No se encontraron diferencias significativas entre los valores de histidina para 4 y 10[grados]C. Se aislaron e identificaron 15 especies de bacterias mesofilas presentes en el musculo de la Corvina, 8 de las cuales dieron resultados positivos como productoras de histamina. Los valores promedio de histamina detectados en el musculo de la Corvina fueron de un minimo 10,28 y un maximo de 59,53 ppm, sin llegar a valores considerados toxicos por la Food and Drug Administration (FDA) de Estados Unidos. Se encontraron diferencias (P<0,05) para los valores de histamina a los tiempos de 24 y 48 horas en todas las temperaturas, alcanzandose valores de 42,25 ppm a la temperatura de 10[grados]C. En base a los resultados obtenidos en la presente investigacion, se concluyo que el incremento de la temperatura favorecio la produccion de histamina debido al aumento del numero de bacterias, asi como del incremento en la concentracion de la histidina, la cual es precursor de la histamina. Los niveles de histamina no alcanzaron valores toxicos, tal vez debido a que las bacterias productoras de dicho compuesto presentes en el musculo mostraron baja actividad de la enzima histidina descarboxilasa. Se recomienda continuar investigando sobre la produccion de histamina en el musculo de la Corvina para precisar por que dichos valores no alcanzaron niveles toxicos.

Palabras clave: Histamina, produccion, temperatura, corvina.

ABSTRACT

In order to study the factors affecting the histamine production in Corvina's (Cysnoscion maracaiboensis) muscle, 30 fish of these species were sampled and divided in 3 groups of 10 fishes each. They were placed at 4[grados], 10[grados] and 28[grados]C temperatures. Every 24 hours, the mesophilic bacterial number was measured by using plate count recommended by the American Public Health Association (APHA). Histidine and histamine contents were determined by high performance liquid chromatograph. Bacterial colonies were isolated in Mac Conkey culture media and identified by using API test. Bacterial number reached its highest point at 24 hours for 28[grados]C temperature. There were no significant differences in the number of bacterias between 4 and 10[grados]C at 0 and 24 hours. Significant differences (P<0.05) were found between these temperatures only at 48 hours. Histidine concentration raised quickly at 28[grados]C from 202.75 to 1003.61 ppm. Differences were found at 4 and 10[grados]C for histidine concentration values. 15 bacterial mesophil species were isolated and identified in Corvina's muscle, 8 of them gave positive results for histamine production test. Histamine concentration reached minimum and maximum values of 10.28 and 59.53 ppm, lower than toxic values accepted by Food and Drug Administration (FDA). Significantly different (P<0.05) values were found at 24 and 48 hours for all temperatures, as reaching 42.25 ppm at 10[grados]C. Based on these results it can be concluded that temperature increases positively histamine production, due to growth of histamine-producing bacterial populations and increasing histidine concentration. Levels of histamine did not reach toxic values, maybe due to a low activity of the histidine decarboxilase enzime of bacterias found in this muscle. It is recommended to continue to investigate on histamine production in Corvina's muscle to determine why these values did not reach toxic levels.

Key words: Histamine, production, temperature, corvina.

Temperature and Time Effects on Bacterial Growth, Free Histidine Concentration and Histamine Production in Corvina's Muscle (Cysnoscion maracaiboensis)

INTRODUCCION

La Corvina (Cysnoscion maracaiboensis) es un pez que habita las aguas de zonas tropicales: Golfo de Venezuela y el Mar Caribe, zonas marinas donde se captura la mayor parte del pescado consumido en Venezuela. Representa el recurso pesquero de mayor importancia para la region occidental del pais. Se estima que entre 1994 y 1995 se pescaron mas de 15.000 TM de Corvina en las costas de Venezuela [5]. De la cantidad anterior, el 50% procedio de los estados Zulia y Falcon, de alli la importancia de este pescado para la region. Su comercializacion en la ciudad de Maracaibo ocupa el primer lugar dentro de las pesquerias locales, transportandose incluso grandes cantidades de el, al resto del pais.

Uno de los parametros que se ha tomado en cuenta en los ultimos anos para determinar la frescura del pescado, es la cantidad de histamina que pueda presentar el tejido muscular. La histamina es un compuesto producido por algunas bacterias a partir del aminoacido histidina, y es la responsable de los envenenamientos por consumo de pescado y otros productos marinos mal conservados, es decir a consecuencia de la exposicion del pescado a temperaturas no aptas para su conservacion [11, 15, 16]. Las intoxicaciones producidas por la ingestion de pescado descompuesto son materia de preocupacion por razones de salud publica, que aumenta en paises donde la explotacion pesquera tiene importancia economica. En Venezuela se hace necesario generar informacion que permita precisar bajo que condiciones se produce histamina en una cantidad toxica en las especies locales y no utilizar la in formacion disponible sobre especies de pescado diferentes a las existentes en el pais.

La produccion de histamina ha sido estudiada en vahas especies de pescado, tanto fresco como procesado [7, 9, 15], sin embargo es poca la informacion existente sobre los procesos de descomposicion que se desarrollan en el musculo de la Corvina y su relacion con la produccion del mismo. El presente trabajo tuvo como proposito determinar la produccion de histamina en el musculo de la Corvina a distintas temperaturas y tiempos de almacenamiento.

MATERIALES Y METODOS

Treinta pescados de la especie Cysnoscion maracaiboensis recien capturados, fueron comprados a pescadores locales de la ciudad de Maracaibo y transportados refrigerados en hielo al laboratorio, donde les fueron removidas la cabeza y la cola; luego con la ayuda de un cuchillo esteril, se dividieron los cuerpos en tres secciones de 250 g cada una. Para el analisis se tomaron tres muestras que representan el tiempo inicial y el resto fue conservado a temperaturas de 4, 10 y 28[grados]C. Posteriormente se les determino el numero de microorganismos mesofilos aerobicos, histidina libre e histamina producida a tiempos de 0, 24 y 48 h de haberse colocado a las temperaturas indicadas.

El analisis microbiologico se realizo por el metodo de conteo en placas propuesto por la American Public Health Association (APHA) [1], para lo cual se tomaron 50g de musculo de Corvina se licuaron en 450 mLde agua peptonada esteril a una concentracion de 0,1% y a una temperatura de 4[grados]C durante 2 min. A partir del homogeneizado original se prepararon diluciones en agua peptonada de concentracion [10.sup.-1], [10.sup.-2], [10.sup.-3] y [10.sup.-]4. Para cada una de estas diluciones se prepararon placas de Petri con agar de conteo en placas (Merck), en las que fueron sembrados superficialmente 0,1 mL de cada muestra. Las placas se incubaron a 37[grados]C por 24 h y el recuento de las colonias se realizo usando un cuenta colonias, marca Fisher (Fisher Instruments, EUA).

Para el aislamiento de los organismos gram negativos, se inoculo 1 mLdel homogenizado en 9 mLde agua peptonada y luego se incubaron a 35[grados]C por 24 h; transcurrido este tiempo, se sembro 0,1 mLde la dilucion en agar McConkey y eosina azul de metileno. Luego se incubaron las placas, a 37[grados]C por 24 h. Las colonias fueron sembradas en el medio de Niven propuesto por Yoshinaga y col. [17], para determinar la produccion de histamina, el cual esta formado por 0,5% de triptona, 0,5 de extracto de levadura, 2 de L-histidina, 0,5 de cloruro de sodio y 1,5% de agar. Las colonias ailadas se conservaron posteriormente en agar nutritivo hasta su identificacion que se hizo utilizando el API-20E Enterobacteriaceae System (Biomerieux, Lyon, France).

Los analisis de histidina e histamina se realizaron de acuerdo a la metodologia propuesta por Gouygou y col. [6], la misma consiste en medir las concentraciones de los analitos por cromatografia liquida. Como patrones se utilizaron histidina e histamina de alta pureza (Sigma, Missouri, EUA). Los demas reactivos y solventes utilizados fueron de la marca Merck, (Alemania). El sistema de cromatografia liquida estuvo constituido por una bomba marca Shimadzu (Tokio, Japon) modelo LC-6A, una valvula de inyeccion marca Rheodyne equipada con un loop de 20 [micron]L de capacidad y una columna de fase reversa marca Merck, RP-18 Lichrospher de 12,5 cm de longitud por 4,5 mm de diametro interno, el tamano de las particulas de silica fue de 5 m. Se uso un detector de fluorescencia, marca Shimadzu (Tokio, Japon) modelo FLD-6A, a una longitud de onda de excitacion de 350 nm, mientras que la de emision era de 450nm.

Las condiciones de trabajo del equipo consistieron en un sistema isocratico de solventes en el que se utilizo una fase movil compuesta por Acetonitrilo al 40% en agua con fosfato monosodico en una concentracion de 50 mmoles/L. El flujo fue constante con un caudal de 1 mL/min. El registro y analisis de la data se realizaron con el software cromatografico Class-VP de la marca Shimadzu.

Para la derivatizacion de los estandares y las muestras fue utilizado el orto-ftalaldehido (OPA) preparado mezclando 10 mg del mismo en 1 mL de metanol. Se prepararon estandares de histamina que contenian 0,01; 0,015 y 0,02 mg/mL disueltos en Acido Tricloroacetico (TCA) al 10%. Los mismos se filtraron a traves de filtros Millipore de 0,22 pm de poro.

El fluoroforo histamina-OPA o histidina-OPA se preparo mezclando 135[micron]L de la solucion stock con 1,86 mLde agua desionizada y 0,4 mLde NaOH 1N, se dejo en reposo durante un 1 min a oscuras y luego se le agrego 0,1 mLde solucion de OPA. A los 4 min se le anadieron 0,2 mLde HCI de concentracion 3N.

Las muestras para inyeccion, se prepararon licuando 50g de musculo de Corvina en 100 mLde TCA al 10% durante 2 min, a maxima velocidad, para ello se utilizo una licuadora comercial marca Oster y un vaso de acero inoxidable. Una vez trituradas, se filtraron al vacio a traves de papel de filtros Whatman No 1 y Millipore de 0,22 [micron]m de poro. Todas las muestras al igual que los estandares fueron conservados a 49C para su posterior inyeccion.

El diseno experimental utilizado fue el diseno factorial 3 x 3, siendo los factores la temperatura a tres niveles (4, 10, 28[grados]C), y el tiempo a tres niveles (0, 24, 48 h). Tambien las unidades experimentales se asignaron a los tratamientos en forma aleatoria. Las variables independientes eran el tiempo y la temperatura y, las variables dependientes, la carga bacteriana, la histidina liberada y la histamina producida. Los datos se analizaron empleando el SAS PROC-GLM [10,13] y las medias se compararon usando la prueba de Tukey con un nivel de significacion de P<0,05 [3],

RESULTADOS Y DISCUSION

Separacion cromatografica

La FIG. 1 muestra el cromatograma de una mezcla de histidina e histamina separadas, empleando la metodologia propuesta por Goygou y col. [6]. En la misma se puede apreciar la separacion de estos analitos, utilizando un metodo cromatografico isocratico. El tiempo de analisis fue de 5 min y los analitos histidina e histamina eluyeron de la columna en ese orden. El tiempo de analisis de 5 min fue distinto al reportado por Gouygou y col. [6], que fue de 10 min, atribuible al uso de una columna de diferente marca.

Efectos de la temperatura y el tiempo sobre la carga bacteriana

En la TABLA I se pueden observar los valores promedio de las unidades formadoras de colonias (UFC) presentes en el musculo de las Corvinas, almacenadas a tres temperaturas y tiempos diferentes. La temperatura de 4[grados]C simula la conservacion en hielo utilizada en el transporte de pescado; la temperatura de 10[grados]C a la refrigeracion en nevera, y la de 28[grados]C representa una temperatura control que se presenta en muchos expendios de pescado ambulante y ademas, usada por otros autores [2, 9] como una temperatura de alto riesgo para la conservacion del pescado, ya que permite el libre crecimiento de bacterias.

A la temperatura de 28[grados]C se observo un rapido crecimiento de bacterias mesofilas que alcanzaron su valor maximo a las 48 h. Este comportamiento no difiere de los estudios realizados por Baranowsky y col., Lopez y col. y Yoshinaga y Frank [2, 9, 17], en otras especies de pescado. Los valores de UFC a la temperatura de 28[grados]C fueron significativamente diferentes (P<0,05) a 24 y 48 h, con respecto al resto de las temperaturas debido al rapido crecimiento bacteriano y al efecto inhibidor del crecimiento a 4 y 10[grados]C [9],

Con relacion a las muestras conservadas en refrigeracion a 4 y 10[grados]C se presentaron diferencias significativas (P<0,05) a los tiempos de 24 y 48 h, ya que a la temperatura de 10[grados]C no se detiene eficientemente el crecimiento de bacterias mesofilas en la Corvina [2, 9]; ademas el crecimiento bacteriano que se presenta a 4[grados]C pudiera explicarse por la presencia de organismos psicrotroficos, menores en numero [2]. El musculo de la corvina presento un numero de bacterias mayor al atun (Thunnus thynnus) y ligeramente superior al mahi-mahi (Coryphaaenea hlppurus) [2, 9], se obtuvieron recuentos mayores de organismos aerobios mesofilos en el musculo de la Corvina. En el analisis de varianza se obtuvo un [R.sup.2] de 0,973, lo que significa que un 97% del crecimiento bacteriano se debe al efecto de la temperatura y el tiempo, encontrandose interaccion entre ambos.

Efecto de la temperatura y el tiempo sobre los niveles de histidina libre

En la TABLA II se aprecia el efecto de las distintas temperaturas y tiempos sobre la liberacion de histidina en el musculo de pescado; se observa asi mismo, que a 4 y a 10[grados]C, los niveles de histidina difieren significativamente (P<0,05) de los valores promedio registrados a 28[grados]C, en todos los tiempos, debido a la violenta autolisis que ocurre en el musculo de la Corvina por efecto de la temperatura de 28[grados]C. A 4 y 10[grados]C se detiene la liberacion de histidina, posiblemente por inhibicion de las enzimas proteoliticas de estos procesos degradativos, tal como lo establecen Stoknes y Rustad [14],

Los resultados parecen indicar que la baja temperatura detiene o retarda los procesos de autolisis que ocurren a 28[grados]C en el musculo de la Corvina, que al igual que el de otras especies, sufre procesos proteoliticos que liberan histidina [14], La histidina es el sustrato de la enzima histidina descarboxilasa que la convierte en histamina. El hecho de que a 4 y 10[grados]C se inhibe la autolisis, tambien pudiera explicar que la produccion de histamina se detiene por una limitacion en la provision de sustrato [4].

El valor de [R.sup.2] obtenido fue de 0,917, lo que indica que un 91% de la histidina se libera por efecto de la temperatura y/o el tiempo.

Bacterias presentes en el musculo de la corvina

Se observa una lista de las bacterias identificadas en el musculo de las Corvinas conservadas a 28[grados]C, TABLA III. De alli fueron aisladas e identificadas 15 especies bacterianas mesofilas aerobicas, 8 de las cuales demostraron ser productoras de histamina con ayuda del medio modificado de Niven [17], Lopez y col. [9], han reportado los valores promedio de histamina producidos por las especies aisladas en el atun (Thunnus thynnus) ya que son de elevada produccion de histamina. La Klebsiella pneumoniae es, entre las 8 especies aisladas, la unica que produce histamina a elevadas concentraciones. El resto de las bacterias identificadas solo producen histamina a baja concentracion, o no producen [9].

Efectos de la temperatura y el tiempo sobre la produccion de histamina

En la TABLA IV se aprecian los valores promedio de histamina producida en el musculo de la Corvina a tres temperaturas y tiempos. Se puede apreciar que el valor mas bajo, corresponde al tiempo cero sin encontrarse diferencias significativas para las distintas temperaturas. La cantidad inicial de histamina no alcanza las 11 ppm, lo que la asemeja a las aseveraciones hechas por otros autores en especies distintas a la corvina, donde se han encontrado cantidades iniciales que llegan a las 20 ppm [9, 12]. Transcurridas 24 h, TABLA IV, se observaron diferencias significativas (P<0,05) entre los valores promedio de histamina a 4 y 28[grados]C, producto del crecimiento y actividad bacteriana en el musculo de la Corvina. Transcurridas 48 h, TABLA IV, se aprecian diferencias significativas en los valores de histamina producida a las temperaturas de refrigeracion con respecto a la de 28[grados]C. Con el transcurrir del tiempo y a pesar de estar refrigerado, se podrian alcanzar valores de concentracion de histamina mayores [8, 9]. Sin embargo, debe senalarse que los valores maximos de histamina logrados a las 48 h a 28[grados]C, no alcanzaron la cifra establecida como toxica por la Administracion de Alimentos y Drogas de los Estados Unidos (FDA), que es de 200 ppm [9],

El valor de [R.sup.2] para la produccion de histamina fue de 0,973 lo que explica que el 97% de la histamina generada en el musculo de la Corvina es debida a los efectos de la temperatura y el tiempo, por separado o en interaccion. A pesar de que el modelo expresa que la histamina se debe en un 97% a los efectos de la temperatura y el tiempo, existen dos factores que no pueden ser ignorados: la carga bacteriana y la cantidad de histidina presente en las muestras analizadas. En las TABLAS I y II se observa que los factores antes mencionados aumentan en el tiempo y a todas las temperaturas estudiadas. El valor promedio maximo de histamina encontrado a las 48 h fue de 59,53 ppm, menor a los valores toxicos establecidos por la FDA; lo que podria explicarse por la presencia de microorganismos poco eficientes como productores de histamina [9],

CONCLUSIONES

Sobre la base de los resultados obtenidos en esta investigacion, se puede concluir que:

--La concentracion de histidina libre en la Corvina aumenta con el incremento de la temperatura.

--A las temperaturas de 4 y 10[grados]C se detiene la liberacion masiva de histidina en el musculo de la Corvina hasta 48 h despues de ser capturada.

--El numero de bacterias en el musculo de la Corvina aumenta con el incremento de la temperatura y el tiempo de conservacion.

--La flora bacteriana de la Corvina conservada a 28[grados]C estuvo conformada por al menos 15 especies de bacterias mesofilas aerobicas, de las cuales la Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundi, Citrobacter diversus, Enterobacter sakazakii, Enterobacter aglomerans, Enterobacter spp, Proteus vulgaris y Hafnia alvei son consideradas cada una como productoras de histamina.

--Los niveles de Histamina en el musculo de la Corvina aumentan como consecuencia del incremento de la temperatura y tiempo de conservacion, sin embargo, fueron inferiores a 200 ppm, por lo que no se consideraron toxicos.

RECOMENDACIONES

Para continuar el estudio de la produccion de histamina en la carne de la Corvina se recomienda lo siguiente:

--Realizar trabajos que permitan estudiar el efecto individual que tiene sobre la produccion de histamina la temperatura y la concentracion de histidina, evitando el solapamiento de dichos efectos. Esto permitiria determinar el verdadero aporte de cada uno en la produccion de histamina en la Corvina.

--Estudiar la baja produccion de histamina en la Corvina midiendo la actividad de la enzima histidina descarboxilasa en el musculo de dicha especie.

--Es importante medir en el musculo de la corvina la presencia de otras aminas biogenas. Finalmente se recomienda el almacenamiento de la Corvina a temperaturas menores a los 4[grados]C, de ser a esta temperatura, dicho pescado debe ser consumido en las siguientes 48 horas luego de su captura y refrigeracion.

AGRADECIMIENTO

Los autores desean agradecer al Consejo de Desarrollo Cientifico y Humanistico de la Universidad del Zulia (CONDES), por el financiamiento de esta investigacion a traves de su proyecto No 0613-99.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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Recibido: 10/05/99. Aceptado: 03/03/2000.

Gabriel Torres Ferrari (1), Pedro Izquierdo Corser (1), Enrique Marquez Salas (1), Egar Sanchez Camarillo (2) y Yasmina Barboza (1)

(1) Unidad de Investigacion en Ciencia y Tecnologia de los Alimentos, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad del Zulia. E-mail: gtorres@luz.ve. (2) Unidad de Estadistica, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad del Zulia. Maracaibo 4005-A, Estado Zulia, Venezuela.

Leyenda: FIGURA 1. CROMATOGRAMA DE UNA MEZCLA DE PATRONES DE HISTAMINA E HISTIDINA DONDE SE APRECIAN DOS PICOS, EL No 1 CORRESPONDIENTE A LA HISTIDINA Y EL No 2 CORRESPONDE A LA HISTAMINA.
TABLA 1

CANTIDAD DE BACTERIAS MESOFILAS AEROBICAS AISLADAS EN EL MUSCULO
DE LA CORVINA, EXPRESADAS EN log UFC/g

Tiempo                 Temperatura de Almacenamiento

            4[grados]C        10[grados]C       28[grados]C

0 h          5,27 (a)          5,00 (a)          5,90 (ab)
24 h         5,6 (ab)          6,37 (ac)         10,06 (d)
48 h         5,89 (ab)          6,87[c)          10,53 (d)

(a, b, c, d) p <0,05

TABLA II

VALORES PROMEDIO DE HISTIDINA EXPRESADA EN PARTES POR MILLON (PPM) A
DISTINTOS TIEMPOS Y TEMPERATURAS

Tiempo              Temperatura de Almacenamiento

            4[grados]C        10[grados]C       28[grados]C

0 h         155,99 (ab)       202,75 (ab)       298,54 (b)
24 h        154,46 (a)        280,58 (ab)       525,03 [c)
48 h        512,05 (c)        507,63 [c]        1003,61 (d)

(a, b, c,d) p <0,05.

TABLA III

BACTERIAS MESOFILAS AISLADAS E IDENTIFICADAS EN
EL MUSCULO DE LA CORVINA
(Cysnoscion maracaiboensis) UTILIZANDO EL MEDIO
MODIFICADO DE NIVEN

Especies                                Produccion de Histamina

Aeromonas hydrophyla / caviae                      -
Aeromonas sobria                                   -
Klebsiella pneumoniae                              +
Citrobacter freundi                                +
Citrobacter diversus / amalonaticus                +
Enterobacter sakazakii                             +
Enterobacter aglomerans                            +
Enterobacter spp                                   +
Pseudomonas fluorescens                            -
Pseudomonas spp                                    -
Vibrio hollisae                                    -
Proteus penneri                                    -
Proteus vulgaris                                   +
Hafnia alvei                                       +
Plesiomonas shigelloides                           -

TABLA IV

VALORES DE HISTAMINA EXPRESADOS EN PARTES POR MILLON (PPM) A
DISTINTOS TIEMPOS Y TEMPERATURAS

Tiempo                 Temperatura de Almacenamiento

            4[grados]C        10[grados]C       28[grados]C

0 h          10,28 (a)         10,42 (a)        13,55 (ab)
24 h         10,31 (a)         11,12 (a)         42,25 (d)
48 h        16,125 (bc)        20,1 (c)          59,53 (c)

(a, b, c, d) p <0,05.
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Author:Torres Ferrari, Gabriel; Izquierdo Corser, Pedro; Marquez Salas, Enrique; Sanchez Camarillo, Egar; B
Publication:Revista Cientifica de la Facultad de Ciencias Veterinarias
Date:Mar 1, 2000
Words:4565
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