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Efecto de la preparacion espermatica previo a la fertilizacion in vitro sobre la membrana plasmatica y el ADN de semen bovino sexado.

EFFECT OF SPERM PREPARATION BEFORE in vitro FERTILIZATION ON PLASMA MEMBRANE AND DNA OF BOVINE SEX-SORTED SEMEN

Introduccion

Desde el inicio de este milenio, el semen bovino sexado ha comenzado a tener una alta aplicabilidad comercial. La preseleccion del sexo es de alto interes tanto para la industria de leche como para la de carne ya que tener nacimientos con un sexo deseado posee ventajas en la produccion comercial (10). En 1987, Johnson y colaboradores (14) desarrollaron una tecnica que permite separar espermatozoides con cromosoma X y espermatozoides con cromosoma Y con base a las diferencias de cantidad de ADN entre las dos poblaciones celulares a traves de citometria de flujo (US Patent #5135759).

El metodo para medir el contenido de ADN en celulas espermaticas individuales se hace a traves de un fluorocromo especifico de ADN, Hoeschst 33342, dependiendo de la intensidad de la fluorescencia los espermatozoides son separados por el clitometro de flujo. Se ha probado que el procedimiento para separar espermatozoides con cromosoma X y Y es efectivo y posee una eficiencia alrededor del 90% (15).

De otro lado, la produccion in vitro de embriones (PIVE) bovinos es una excelente herramienta que se viene utilizando en combinacion con semen sexado, presentando una positiva relacion costo beneficio (25). Una dosis de semen sexado tiene un valor mucho mas elevado que una dosis de semen convencional y por tanto, debe de ser aprovechada al maximo (35, 41). La PIVE permite un mejor aprovechamiento del semen, ya que se requiere una concentracion mas baja de espermatozoides para llevar a cabo la fecundacion comparada con las concentraciones requeridas en la inseminacion artificial; ademas, una sola dosis puede ser utilizada para muchas vacas (11,39,41).

Tambien la PIVE en bovinos se ve beneficiada con la tecnica del sexaje de semen, debido a que el sexo predeterminado de los embriones mejora la relacion costo beneficio de la tecnica, sin un costo adicional, y se evita el desperdicio de embriones y el comprometimiento de la tasa de gestacion que ocurre con los embriones biopsiados para determinar el sexo antes de la transferencia embrionaria (28,40). Una de las limitaciones del uso de semen sexado en la PIVE es la alta variabilidad en los resultados, reduccion de las tasas de fecundacion y de desarrollo embrionario (25). Probablemente, la causa de estas variaciones sea el hecho de que durante la produccion de semen bovino sexado y congelado las celulas son expuestas a numerosos factores que pueden afectar su capacidad fecundante como la dilucion, la incubacion, la exposicion a un fluorocromo, presiones elevadas, laser de luz UV, congelacion y en el laboratorio donde se vaya a llevar a cabo la fertilizacion in vitro (FIV) el semen debe de ser descongelado y preparado con el proposito de obtener una fraccion espermatica con capacidad fecundante y libre de crioprotectores, para lo cual los espermatozoides deben de ser centrifugados.

Los numerosos factores que pueden afectar a los espermatozoides pueden producir especies reactivas de oxigeno (EROS) (6,7). Se ha comprobado que las EROS generadas en la manipulacion del semen bovino pueden causar un dano oxidativo, el cual altera el adecuado funcionamiento de la membrana plasmatica de los espermatozoides; ademas, puede causar fragmentacion en el ADN de los espermatozoides (4,37).

Dos tecnicas que permiten evaluar la integridad de la membrana plasmatica y la integridad del ADN en el semen bovino sexado son el test hipoosmotico (HOST) y el ensayo cometa, respectivamente. El HOST, es una tecnica desarrollada para evaluar la funcionalidad de la membrana plasmatica de los espermatozoides. Su principio consiste en que al someter los espermatozoides a condiciones hipoosmoticas, los espermatozoides bioquimicamente activos permitiran la entrada de agua mostrando diferentes grados de turgencia en un esfuerzo por mantener la dinamica del equilibrio entre los fluidos de sus compartimientos interno y el entorno extracelular.

Esta respuesta se asocia con el grado de integridad normal de la membrana y la actividad funcional de la misma, requisito indispensable para que se de la reaccion acrosomica durante el proceso de fertilizacion (8). Y el ensayo cometa o electroforesis en gel de una sola celula, es una tecnica rapida, simple, visual y sensible para medir y analizar quiebres de ADN en celulas de mamiferos (21,30,31).

Esta tecnica ha sido adaptada para medir quiebres en el ADN de las celulas espermaticas y aunque el procedimiento varia de laboratorio a laboratorio, este se ha basado principalmente en los siguientes pasos: preparacion de una solucion espermatica, la puesta en un gel, lisis celular, desnaturalizacion del ADN, electroforesis, neutralizacion, tincion del ADN y el analisis de las imagenes (34). Por su alta sensibilidad el ensayo cometa se ha venido utilizando ampliamente para evaluar la integridad del ADN de las celulas espermaticas sometidas a diferentes condiciones de estres oxidativo (37).

Por ende, el objetivo de este estudio fue determinar si la integridad de la membrana plasmatica evaluada por HOST por ensayo cometa de los espermatozoides bovinos sexados pueden ser afectada por el proceso de preparacion espermatica previo a la fertilizacion in vitro.

Materiales y metodos

Preparacion del semen

Para este trabajo se utilizaron pajillas de semen bovino sexado y congelado de 0.5 ml provenientes de un solo toro de la raza Holstein. Las pajillas de semen fueron descongeladas a 35[grados]C por un periodo de 1 min. Despues de descongelar, el semen fue inmediatamente sometido a uno de los tres tratamientos: 1) espermatozoides sin centrifugar 2) espermatozoides lavados y seleccionados mediante un metodo que utiliza la centrifugacion y 3) un control positivo, realizado con espermatozoides sometidos a estres oxidativo con [H.sub.2][O.sub.2] a una concentracion final de 200 [micron]M.

Gradiente diferencial de percoll (centrifugacion)

En la tecnica de percoll, la muestra de semen previamente descongelado fue puesta sobre el gradiente de percoll que contenia 1.0 ml de percoll con un gradiente de densidad de 45% y 90%. Se llevo a cabo la centrifugacion a 700 x g por 10 min a temperatura ambiente. Despues de remover el sobrenadante, los espermatozoides fueron resuspendidos en medio FIV-TALP y ajustada a una concentracion de 1x[10.sup.6] celulas/ml.

Los espermatozoides que no fueron sometidos a la preparacion espermatica (tratamiento 1), una vez descongelada la pajilla, el semen fue sometido a las evaluaciones de la integridad de membrana plasmatica y ADN. Para los espermatozoides del tratamiento 3, una vez descongelada la pajilla el semen fue lavado en medio FIV-TALP y mezclado con [H.sub.2][O.sub.2] a una concentracion final de 200 xM como control positivo.

Ensayo cometa

Para evaluar el efecto de la preparacion espermatica sobre el ADN del semen bovino sexado se utilizo el protocolo de ensayo cometa propuesto por Shen y Ong (34). De cada tratamiento se utilizaron concentraciones de 5 X [10.sup.5] espermatozoides/ml suspendidas en agarosa de bajo punto de fusion al 0.5 % (en PBS libre de [Ca.sup.++] y [Mg.sup.++]) en portaobjetos pretratados con 100 [micron]l de agarosa de punto de fusion normal al 0.5 % (en PBS libre de [Ca.sup.++] y [Mg.sup.++]).

Despues de 10 min a temperatura ambiente, los portaobjetos fueron colocados en solucion de lisis I (2.5 M NaCl, 0.1 M EDTA, 10% DMSO y 1% de Triton X 100) a un pH de 10.0, por 1 hora a 4[grados]C; posteriormente las placas fueron pasadas a lisis II (2.5M NaCl, 100 mM Na2 EDTA, 10 mM Tris, 200 [micron]g/ml de proteinaza K y 300 mM de DTT) a un pH de 7.4 por un periodo de 18 horas a una temperatura de 37.5[grados]C. Terminada la lisis II las placas fueron incubadas en buffer de electroforesis (0.3 M NaOH, 200 mM, EDTA) a un pH 13.0 por un periodo de 10 min en un cuarto oscuro a 4[grados]C. Luego, se realizo el corrido electroforetico durante 10 min a 25 V y 300 mA.

El siguiente paso fue lavar las laminas portaobjetos con buffer neutralizante (0.4 M Tris-HCL; pH 7.5) y deshidratarlas con metanol puro, una vez secas se tineron con 40 xl de bromuro de etidio (20 [micron]g/ml). Finalmente, los portaobjetos fueron visualizados en un microscopio Axiolab-Zeiss provisto de un sistema de fluorescencia y equipado con una camara CCD SONY (DSC-S85 de 4.1 mega pixeles), con un aumento de 200X. Las imagenes de 50 cometas seleccionados aleatoriamente fueron analizadas con un software analizador de imagenes (Comet Score) proporcionado gratuitamente en Internet por la empresa TriTek-Corp. La variable para cuantificar el dano en el ADN fue el Momento de Olive (OTM).

Test Hipoosmotico

Para evaluar el efecto de la preparacion espermatica sobre la membrana de las celulas espermaticas mediante el test HOS, se utilizo el protocolo propuesto por Correa y Zavos (8) para espermatozoides bovinos. Debido a que se conoce que los azucares y los electrolitos mantienen la integridad funcional de los espermatozoides, se preparo una solucion compuestas por un azucar (fructosa) y un electrolito (citrato de sodio) en agua pura Milli Q-UF. La osmolaridad de la solucion fue 100 mOsmol/L verificada con osmometro.

Se hizo una adicion y mezcla de 100 [micron]l de la muestra que contiene los espermatozoides con 500 [micron]l de la solucion hipoosmotica. La mezcla fue incubada a 38.5[grados]C por 30 min. Posteriormente, se evaluo la reaccion hipoosmotica espermatica colocando una gota de la muestra bien mezclada sobre un portaobjetos, que fue cubierto con un cubreobjetos y observado bajo microscopio de contraste de fases a 400X.

Se contaron un total aproximado de 100 celulas espermaticas, considerando como positivos al test HOS los espermatozoides que presenten doblez o hinchazon en sus piezas medias o enrollamiento de sus piezas principales. El porcentaje de espermatozoides reaccionados se calculo con el numero de celulas reaccionadas al HOST sobre el numero total de espermatozoides contados en la misma placa.

Analisis estadistico

Se utilizo semen sexado y congelado de un mismo lote de un toro de fertilidad comprobada. El analisis estadistico de los datos se efectuo por analisis de varianza y las correspondientes pruebas de medias Fisher. Para el analisis, los datos obtenidos por el test HOS fueron transformados con la formula raiz del dato mas 0.5. Las pruebas se realizaron utilizando el paquete estadistico Statgraphics Centurion XV.

Resultados

En la figura 1, se muestra la comparacion de medias para espermatozoides reaccionados positivamente al test HOS. En dicha figura, se observa que no hay diferencia estadistica significativa (p>0.05) entre el semen bovino sexado, congelado y descongelado y el semen bovino sexado congelado, descongelado y sometido a preparacion espermatica previo a la FIV, lo que involucra centrifugar el semen para la realizacion del gradiente de diferencial de percoll. Pero si se observa una diferencia estadistica significativa (p<0.05) entre el semen centrifugado y no centrifugado con respecto al control positivo realizado con [H.sub.2][O.sub.2]00 [micron]M.

[FIGURA 1 OMITIR]

En las figuras 2 y 3, se muestra el efecto de la centrifugacion sobre el ADN de las celulas espermaticas. Entre los espermatozoides seleccionados con centrifugacion y los seleccionados sin centrifugacion no hay diferencia significativa pero entre estos dos tratamientos y el [H.sub.2][O.sub.2] si hay diferencia estadistica significativa (p<0.05).

[FIGURA 2 OMITIR]

[FIGURA 3 OMITIR]

Discusion

Una de las mayores preocupaciones a la hora de utilizar comercialmente el semen sexado es que la fertilidad es inferior comparado con semen no sexado. Durante el sexaje, los espermatozoides son expuestos a una serie de condiciones como la tincion del ADN, procesos de dilucion, altas presiones, centrifugacion, lo que puede afectar la integridad espermatica, la estructura de la membrana, el citoesqueleto, la morfologia espermatica, la integridad del ADN y otros aspectos de la celula espermatica (4, 19, 20, 22, 25).

Esta situacion es agravada con el proceso de criopreservacion posterior al sexaje, lo que conlleva a que parametros como la vitalidad postdescongelacion, la movilidad y la integridad acrosomica sea mas baja con respecto a un semen no sexado (32). De hecho, cuando sea utilizado una dosis de semen sexado y congelado en los programas de inseminacion artificial (IA), las tasas de prenez bajan entre un 20-40% con respecto al semen convencional (33, 39). De igual forma, los primeros estudios en donde se utiliza semen sexado para producir embriones in vitro, las tasas de desarrollo son bastante bajas con respecto al semen no sexado (18).

Ademas, en la FIV bovina los espermatozoides deben de ser sometidos a un procedimiento de lavado y seleccion en el cual los de mejor movilidad son separados del plasma seminal, de los muertos e inmoviles, de los diluyentes y crioprotectores y de otras estructuras por medio de una tecnica ampliamente utilizada en los bovinos que es el gradiente diferencial de percoll (9,16,27). Esta tecnica requiere como minimo una centrifugacion, paso fundamental en el lavado y seleccion de los espermatozoides, en el cual se puede generar dano a la membrana plasmatica de los gametos masculinos (2, 30, 31) y aumentar la produccion basal de Especies Reactivas de Oxigeno (EROs) (2, 23, 36).

En el presente estudio, se evaluo el efecto de la preparacion espermatica por gradiente percoll previo a la fertilizacion in vitro con semen bovino sexado, sobre la membrana plasmatica y el ADN, dichas variables fueron evaluadas a traves de las tecnicas HOST y ensayo cometa, respectivamente. Se encontro que no hubo diferencia estadistica significativa entre los espermatozoides no centrifugados con respecto a los que han sido centrifugados por 10 min 700. x g (p<0.05). Pero si se observo diferencia estadistica significativa (p<0.05) entre los demas tratamientos y el control positivo realizado con [H.sub.2][O.sub.2] a una concentracion final de 200 [micron]m.

Estos datos concuerdan parcialmente con los publicados por Urrego et al (37) quienes evaluaron en semen no sexado si la integridad de la membrana plasmatica y el ADN de los espermatozoides pueden ser afectados por la centrifugacion realizada en el proceso de lavado y seleccion.

En relacion con los espermatozoides con reaccion positiva al test HOS, no observaron diferencia estadistica significativa entre los espermatozoides no centrifugados y los centrifugados por un periodo de 10 y 30 min, pero si encontraron diferencia con los espermatozoides que fueron centrifugados por un periodo de 45 min. Lo cual concuerda con este estudio en donde se encontro que unas condiciones de 10 min de centrifugacion a 700 x g para la realizacion del gradiente diferencial de percoll no posee un efecto deletereo sobre la integridad de la membrana plasmatica de semen bovino sexado.

Pero en dicho estudio, se encontro que la centrifugacion de los espermatozoides por un tiempo de 10, 30 o 45 min a 700 x g para la realizacion del gradiente diferencial de percoll tiene un efecto deletereo sobre el ADN de los espermatozoides bovinos (37). Esto difiere por lo encontrado en este estudio, en donde la preparacion espermatica no tiene efecto sobre la integridad del ADN, pero si se observa que el semen bovino sexado antes de la preparacion espermatica trae alterada la integridad del ADN (ver figura 3).

Presumiblemente, el dano en el ADN es el resultado de la combinacion de efectos como la tincion del material genetico y la posterior exposicion a un laser de luz UV necesaria para realizar la separacion de las celulas y su posterior criopreservacion (29). Se ha mostrado en espermatozoides de conejo que el dano en ADN aumenta en la medida en que la intensidad del laser sea mayor (13). Catt y colaboradores (5), tineron espermatozoides humanos con el fluorcromo Hoechst 33342 y luego los expusieron a luz UV sin encontrar cambios en la frecuencia de quiebres en el ADN. En semen porcino tambien se ha encontrado que el Hoechst 33342 no posee efecto genotoxico (26). Por otro lado, se ha demostrado en espermatozoides de humano (3), de raton (21) y de bovino (24) que la criopreservacion esta asociada al estres oxidativo.

Ademas, el congelamiento y descongelamiento de los espermatozoides bovinos aumenta la generacion de EROs (6), produciendo alteraciones en el citoesqueleto (12), inhibicion de la fusion esperma-oocito (1), afectando el axonema del esperma lo cual esta asociado con perdida de movilidad (38) y produce dano en el ADN (17).

Conclusion

La tecnica de preparacion de semen sexado a traves del gradiente diferencial de percoll no altera ni la integridad de la membrana plasmatica ni del ADN bajo unas condiciones de 10 min de centrifugacion a 700 x g, por lo que se sugiere la utilizacion de este protocolo para la preparacion espermatica previo a la fertilizacion al no tener efectos deletereos sobre la membrana plasmatica y sobre el ADN. Sin embargo, se podria evaluar las tasas de clivaje y blastocistos producidos utilizando dicho protocolo.

Recibido el 26 de agosto de 2009 y aceptado el 20 de noviembre de 2009

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Daniel Angell, Natalia Perez [1], Andres Pareja Zoot MSc [2], Omar Camargo [3], Rodrigo Urrego Zoot MSc [4]

[1] Est MVZ Grupo de Investigacion INCA-CES, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad CES

[2] Zoot MSc. Grupo de Investigacion Biologia CES-EIA Programa de Biologia CES-EIA

[3] MVZ MSc Grupo Biogenesis, Universidad de Antioquia

[4] Zoot MSc Grupo de Investigacion INCA-CES, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad CES. rurrego@ces.edu.co
COPYRIGHT 2009 Universidad del CES
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Author:Angell, Daniel; Perez, Natalia; Pareja Zoot, Andres; Camargo, Omar; Urrego Zoot, Rodrigo
Publication:Revista CES Medicina Veterinaria y Zootecnia
Date:Jul 1, 2009
Words:4408
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