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Efecto de la penicilina y estreptomicina sobre cultivos iniciadores utilizados en la elaboracion del queso tipo palmita venezolano.

RESUMEN

Se estudio a nivel de planta piloto el efecto de diferentes concentraciones de penicilina y estreptomicina sobre la produccion de acido de once cepas de Enterococcus faecalis y siete cepas de Lactobacillus casei usadas como cultivos iniciadores en la manufactura de queso tipo Palmita con leche pasteurizada. Los microorganismos fueron cultivados en leche descremada reconstituida esteril, libre de antibioticos y conteniendo concentraciones conocidas de penicilina desde 0,008 a 1000 U.l./ml y 0,007 a 1 mg/ml de estreptomicina. La actividad de los cultivos fue medida en terminos de acidez titulable despues de una incubacion a 35 [grados]C durante 18 h. Los resultados mostraron que el 18,2% de los cultivos con E. faecalis resultaron resistentes a concentraciones de 20 U.l./ml de penicilina, mientras que resultaron inhibidos a concentraciones de 40 U.l./ml; el 63,6% de los mismos cultivos fueron resistentes a concentraciones de 0,07 mg/ml de estreptomicina, mientras que fueron inhibidas por 0.1 mg/ml. El 28,6% de los cultivos con L. casei fueron resistentes a 10 U.l./ml de penicilina y el 42,9% fueron resistentes a 0.05 mg/ml de estreptomicina. Los cultivos con L. casei fueron mas susceptibles a la penicilina y estreptomicina que los cultivos con E. faecalis. Sin embargo, hubo cepas de enterococos y lactobacilos que fueron muy susceptibles a ambos antibioticos, 5 U.l./ml y 0,5 U.l./ml de penicilina para los enterococos y lactobacilos, respectivamente, y 0,5 mg/ml y 0,03 mg/ml de estreptomicina para enterococos y lactobacilos, respectivamente. Se observaron variaciones entre especies y entre cepas de la misma especie. Las cepas de E. faecalis Ef8 y Ef9 y las cepas de L. casei L1 y L3, constituyen las cepas mas recomendables en cultivos iniciadores en la elaboracion de queso tipo Palmita debido a su caracteristica de mayor resistencia a los antibioticos analizados.

Palabras clave: Penicilina, estreptomicina, susceptibilidad, cultivos iniciadores, queso.

ABSTRACT

The effect of different concentrations of penicillin and streptomycin on the acid production of eleven strains of Enterococcus feacalis and seven strains of Lactobacillus casei used as starters in the manufacture of pasteurized Palmita-type cheese at a pilot plant scale, were studied. All microorganisms were cultured on reconstituted sterile skim milk free of antibiotics and containing known dilutions of penicillin from 0.008 to 1,000 I.U./ml and from 0.007 to 1 mg/ml of streptomycin. The activity of the cultures was measured in terms of titratable acidity after incubation at 35 [degrees]C for 18 h. A total of 18.2% of the E. faecalis cultures were resistant to concentrations up to 20 I.U./ml of penicillin, being inhibited by 40 I.U./ml, and 63.6% were resistant to concentrations up to 0.07 mg/ml of streptomycin, being inhibited by 0.1 mg/ml. A total of 28.6% of L. casei cultures were resistant to 10 I.U./ml of penicillin, and 42.9% were resistant to 0.05 mg/ml of streptomycin. Lactobacilli were inhibited at lower concentrations than enterococci for both antibiotics. However, some strains of enterococci and lactobacilli were very susceptible to penicillin and streptomycin, 5 I.U./ml and 0.5 I.U./ml of penicillin for enterococci and lactobacilli, respectively, and 0.5 mg/ml and 0.03 mg/ml of streptomycin for enterococci and lactobacilli, respectively. Variations among species and among strains of the same species were noted. The E. faecalis strains Ef8 and Ef9, and the L. casei strains, L1 and L3, are considered the most appropriate to be used as starters for Palmita-type cheese due to their resistance to the antibiotics studied in this work.

Key word: Penicillin, streptomycin, susceptibility, starter, cheese.

Effect of Penicillin and Streptomycin on Starter Cultures used in the Manufacture of Pasteurized Palmita-Type Venezuelan cheese

INTRODUCCION

La presencia de residuos de antibioticos en la leche y en productos lacteos aparte de ser indeseable para el consumidor debido a que pueden provocar reacciones alergicas y de resistencia [6], representa uno de los mayores problemas que afronta la Industria Lactea dado que dichos residuos pueden afectar la fermentacion lactica por parte de los cultivos iniciadores utilizados en la fabricacion de productos tales como queso, leche fermentada, yogurt y mantequilla [1, 11, 12, 14], lo que se traduce en una disminucion de la acidez y un producto de calidad organoleptica no deseable [3], La significacion de la disminucion de acidez en productos lacteos por presencia de antibioticos, ha sido reportada por numerosos autores [1, 12, 13] asi como la ausencia de sabor y aroma [1, 15] como consecuencia de los mismos.

Entre los numerosos antibioticos, la penicilina y la estreptomicina son los mas frecuentemente utilizados como terapeuticos veterinarios para el control de la mastitis [16], y si no hay un control sobre el ordeno de vacas tratadas, la leche cruda destinada a la elaboracion de productos lacteos puede llegar a contener residuos de antibioticos. La penicilina y la estreptomicina, asi como otros antibioticos han sido empleados con frecuencia en el estudio de microorganismos lacticos, con el objeto de evaluar el grado de resistencia. En este particular, Erkinkyan y col. [8] mencionan la sensibilidad de cultivos en leche descremada con cepas de Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus y Lactococcus lactis frente a concentraciones de 0,1 U.l./ml de penicilina, lo cual causa disminucion de la produccion de acidez por parte de dichas bacterias. Ramakrishna y col. [15] resalta la sensibilidad que muestran los lactobacilos frente a la estreptomicina, aun en concentraciones de 0,5 pg/ml causando alteraciones en la actividad fermentativa de dichos microorganismos en cultivos iniciadores. Los efectos de la presencia de penicilina sobre la actividad de cultivos iniciadores con estreptococos y lactobacilos pueden ser mas drasticos que aquellos causados por la estreptomicina. Se ha llevado a cabo una serie de investigaciones acerca de los controles a seguir para minimizar el efecto de los antibioticos en la leche. Uno de ellos es el uso de cultivos con cepas resistentes. El presente trabajo tiene como objetivo conocer el efecto de diferentes concentraciones de penicilina y estreptomicina sobre la actividad fermentativa de cepas de Enterococcus faecalis y Lactobacillus casei utilizadas como cultivos iniciadores en la elaboracion del queso pasteurizado venezolano tipo Palmita. El resultado de esta investigacion contribuira con el desarrollo de la tecnologia de la produccion de dicho queso, mediante el uso de cultivos iniciadores multiples con cepas resistentes, que garantice la actividad fermentativa de los mismos durante el proceso de elaboracion de dicho queso.

MATERIALES Y METODOS

Cultivos bacterianos

Once cepas de Enterococcus faecalis (Ef) y siete cepas de Lactobacillus casei (L), aisladas en otros estudios 4, 9, se cultivaron en leche descremada reconstituida esteril (LDRE con 10% solidos, esterilizada a 112 [grados]C por 12 min) y se incubaron durante 18 h a 35 [grados]C y se mantuvieron como cultivos madres hasta el momento de su uso. El porcentaje de inoculo para ambas especies fue del 2%.

Resistencia a los antibioticos

Este ensayo se llevo a cabo de acuerdo a lo descrito por Harrigan y Me. Canee [11]. Para ello se utilizaron soluciones base de 10.000 U.l. de penicilina G/ ml (Fischer) y de 400 mg de sulfato de estreptomicina/ml (Fischer), preparadas con agua destilada esteril. Los antibioticos fueron anadidos a 10 mi de LDRE con 10% solidos, a las concentraciones siguientes: desde 1.000 U.l. hasta 0,008 U.l. de penicilina/ml, y desde 1 mg hasta 0,007 mg de estreptomicina/ml. Luego cada tubo fue inoculado con 2% de las cepas bacterianas (cultivos madres) e incubados a 35 [grados]C por 18 h. Como controles se utilizaron tubos con leche descremada y cepa bacteriana y tubos con leche descremada sin antibiotico y sin cepa bacteriana. Todas las muestras se hicieron por duplicado. La actividad de los cultivos se evaluo en base a la produccion de acidez titulable. Los valores se graficaron como concentraciones del antibiotico (U.l. o mg/ml) contra acidez titulable (mi NaOH 0,1 N/100 mi).

Acidez titulable

Se determino por titulacion de 10 mi de un cultivo en LDRE con NaOH 0,1 N y 1 ml del indicador fenolftaleina al 0,5%. El resultado se reporto como mi de NaOH gastados por 100 mi de cultivo [11].

RESULTADOS Y DISCUSION

Las FIGS. 1a y 1b, muestran el efecto de varias concentraciones de penicilina sobre la produccion de acidos de cultivos con E. faecalis. En ellas se observa que los enterococos resultaron inhibidos en su crecimiento a 5, 10, 20 y 40 U.l./ml de penicilina, donde el valor de acidez titulable fue comparable con la acidez de 14 que presento el cultivo control de leche descremada sin antibiotico y sin cepa bacteriana. Este valor proviene de la titulacion de los iones hidronios libres y de los hidronios potencialmente libres asociados a grupos carboxilos de acidos (acido lactico) y aminoacidos de las proteinas y pre sento un valor tipico [5]. El cultivo control con las cepas de E. faecalis mostro un valor promedio de acidez titulable de 37, el cual fue disminuyendo a medida que el crecimiento era afectado por el antibiotico. Las cepas de E. faecalis que mostraron mayor resistencia fueron Ef8 y Ef9, FIG.1b, lo que representa el 18,2%, resultando ser inhibidas en su crecimiento a concentraciones de penicilina de 40 U.l./ml. En dichas cepas ademas se observo que la velocidad de inhibicion del crecimiento fue gradual en comparacion con el resto de las cepas, a medida que se incrementaba la concentracion de penicilina. En el caso de las cepas Ef4, Ef6 y Ef11 que resultaron sensibles a concentraciones de 20 U.l./ml de penicilina, se observa en la FIG. 1b que la linea de produccion de acidez se hace mas pronunciada a valores menores de penicilina, sobre todo por parte de la cepa Ef11. La concentracion mas baja que logro inhibir el crecimiento de enterococos fue 5 U.l./ml de penicilina lo que respresenta el 36% de cepas sensibles. Resultados de sensibilidad a la penicilina de enterococos han sido reportados por otros autores. Segun Garg y Mital [10] la mayoria de las especies del genero Enterococcus resultan inhibidas por niveles de bencilpenicilina entre 50 y 1000 U.l./ml siendo su efecto bactericida. Por otro lado, Sonne y Jawetz [17], reportan la alta resistencia de cepas de Enterococcus a valores de 40 U.l./ml de penicilina. Batish y col. [2] mencionan tambien la alta resistencia a la penicilina de 51 cepas de E. faecalis var. faecalis, E. faecalis var. zymogenes y E. faecium, de un total de 59 cepas previamente aisladas de leche, queso, leche infantil, leche condensada y helado. La resistencia que pueden mostrar los enterococos frente a la penicilina, resulta debida a la actividad de la penicilinasa presente en estos microorganismos [10].

En las FIGS. 2a y 2b, se observan los valores de acidez titulable obtenidos en cultivos con L. casei, por efecto de diferentes concentraciones de penicilina. Alli se observa que de las siete cepas estudiadas, L1 y L3, FIG. 2b, fueron las mas resistentes, resultando inhibidas por concentraciones de 20 U.l./ml. Para las cepas de L. casei, el valor promedio de acidez titulable del control con la bacteria fue de 35. A diferencia de los enterococos, la concentracion mas baja de penicilina que logro inhibir a los lactobacilos fue 0,5 U.l./ml, FIG. 2a, lo que representa un 28,6% de cepas de L. casei sensibles. En general se observa que las cepas de L. casei resultaron mas sensibles a la penicilina que las cepas de E. faecalis. En un estudio de sensibilidad a varios antibioticos entre los que estuvo la penicilina, cepas de L. casei resultaron sensibles a concentraciones de 0,1 U.l./ml de penicilina [8], es decir, niveles mas bajos que los empleados en el presente trabajo.

Con respecto a los niveles de estreptomicina que resultaron inhibidores de la produccion de acidos por parte de cultivos con cepas de E. faecalis, se observa en las FIGS. 3a y 3b que siete de las once cepas (Ef2, Ef4, Ef5, Ef7, Ef8, Ef9 y Ef10) resultaron afectadas en su crecimiento por concentraciones de 0,1 mg/ml de estreptomicina. En este caso dichas cepas (63,6%) fueron las mas resistentes. La concentracion mas baja de estreptomicina ensayada que logro inhibir el crecimiento de los enterococos fue 0,03 mg/ml y en este caso la cepa fue Ef1. Los resultados en general, difieren de lo reportado por Garg y Mital [10] los cuales mencionan que niveles de 0,02 mg/ml no resulta inhibidor de los enterococos. Cabe senalar que para especies lacticas como los Streptococcus niveles de 1 mg/ml de estreptomicina puede incidir sobre la actividad fermentativa de dichos microorganismos en cultivos iniciadores [15]. En general, los enterococos analizados en este estudio, resultaron sensibles a concentraciones menores de estreptomicina que las reportadas en la literatura. Batish y col. [2] resaltan la resistencia de los enterococos no solo a la estreptomicina sino a la penicilina e indican que existe una correlacion entre tal resistencia con la actividad termonucleasica, alta resistencia al calor y produccion de enterocinas.

La FIG. 4 muestra los resultados de la influencia de diferentes concentraciones de estreptomicina sobre cultivos con cepas de L. casei. En este caso, los lactobacilos analizados resultaron mas sensibles que los enterococos, ya que un nivel de 0,05 mg/ml logro inhibir completamente la actividad del 42,9% de los cultivos. El resto de las cepas fueron inhibidas a una concentracion de 0,03 mg/ml. Estos resultados difieren de los reportados por Erkinkyan y col. [8] los cuales resaltan la sensibilidad de cepas de L. casei frente a concentraciones de 0,006 mg/ml de estreptomicina. Por otro lado, especies relacionadas como Lactobacillus bulgaricus y Lactobacillus acidophilus tambien resultan afectadas en su produccion de acidos a concentraciones similares cuyo rango va de 0,001 a 0,005 mg/ml [15].

El conocimiento de los niveles de sensibilidad que presentan los cultivos iniciadores lacticos resultan de gran importancia [12] ya que facilitan la practica de seleccion de cepas que mantengan la actividad fermentativa aun en presencia de niveles de antibioticos en la leche. En este sentido hay autores que mencionan niveles de 0,002 U.l. de penicilina por mi de leche y de 0,004-0,005 mg/ml de estreptomicina por mi de leche [6] Sin embargo, niveles mayores de estos dos antibioticos han podido ser detectados en leche de vaca utilizada en la elaboracion de quesos [11], lo que trae como consecuencia fallas en el crecimiento normal de cultivos iniciadores utilizados en la industria de productos lacteos. Cogan [7] reporta la inhibicion de la actividad fermentativa de cultivos iniciadores lacticos utilizados en la elaboracion de yogurt y queso por presencia de niveles de estreptomicina de 3,5 x [10.sup.-4] a 0,012 mg/ml en la leche destinada para la elaboracion de dichos productos.

CONCLUSIONES

Los resultados de este estudio indican que tanto la penicilina como la estreptomicina, a una determinada concentracion, pueden tener efectos inhibitorios sobre la actividad fermentativa de especies lacticas utilizadas como cultivos iniciadores que puede afectar la velocidad de produccion de compuestos, como acidos organicos, relacionados con las caracteristicas organolepticas de un alimento fermentado. El conocimiento de los niveles de sensibilidad antibiotica de los cultivos iniciadores favorece la seleccion de aquellos cultivos con mayores niveles de resistencia que puedan asegurar un producto final con las caracteristicas organolepticas deseables y asi evitar grandes perdidas economicas. En base a estas consideraciones las cepas Ef8, Ef9, L1 y L3 resultan las mas adecuadas para este fin.

AGRADECIMIENTO

Los autores expresan su agradecimiento al Consejo de Desarrollo Cientifico y Humanistico (CONDES) por el soporte financiero recibido, al Personal del Laboratorio de Alimentos del Departamento de Quimica de la Facultad Experimental de Ciencias de la Universidad del Zulia por la contribucion con equipos necesarios, y a Luis Jimenez Segura & Asociados, Ingenieros Consultores C.A., Maracaibo, por su colaboracion.

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Recibido: 04/12/97. Aceptado: 03/07/98.

Lilibeth Cabrera Salas, Alexis Ferrer Ocando, Graciela Ojeda de Rodriguez y Betzabe Sulbaran de Ferrer

Laboratorio de Alimentos, Departamento de Quimica, Facultad de Ciencias, Universidad del Zulia Apartado postal 526. Maracaibo, estado Zulia, Venezuela. E-mail: cabrera@solidos.ciens.luz.ve

Leyenda: FIGURA 1A. EFECTO DE PENICILINA SOBRE LA ACTIVIDAD DE CULTIVOS INICIADORES CONTENIENDO CEPAS DE Enterococcus faecalis. CEPAS INHIBIDAS A 5 o 10 U.l./ml: Ef1 (O), Ef2 ([]), Ef3 ({}), Ef5 (X), Ef7 (+) Y Ef10 ([DELTA].)

Leyenda: FIGURA 1B. EFECTO DE PENICILINA SOBRE LA ACTIVIDAD DE CULTIVOS INICIADORES CONTENIENDO CEPAS DE Enterococcus faecalis. CEPAS INHIBIDAS A 20 o 40 U.IVml: Ef4 (O), Ef6 (?), Ef8 (0), Ef9 (X), Ef11 (+).

Leyenda: FIGURA 2A. EFECTO DE PENICILINA SOBRE LA ACTIVIDAD DE CULTIVOS INICIADORES CONTENIENDO CEPAS DE Lactobacillus casei. CEPAS INHIBIDAS A 0,5 o 1,0 U.IVml: L2 (O), L4 ([]), L6 ({}), Y L7(X).

Leyenda: FIGURA 2B. EFECTO DE PENICILINA SOBRE LA ACTIVIDAD DE CULTIVOS INICIADORES CONTENIENDO CEPAS DE Lactobacillus casei. CEPAS INHIBIDAS A 10 o 20 U.I7ml: L1 (O), L3 ([]), L5 ({}).

Leyenda: FIGURA 3. EFECTO DE ESTREPTOMICINA SOBRE LA ACTIVIDAD DE CULTIVOS INICIADORES CONTENIENDO CEPAS DE Enterococcus faecalis. (A) CEPAS INHIBIDAS A 0,03; 0,05; 0,07 o 0,1 mg/ml: Ef1 (O), Ef3 ([]), Ef4 ({}), Ef5 (X), Ef6 (+) Y Ef11 (A). (B) CEPAS INHIBIDAS A 0,1 mg/ml: Ef2 (O), Ef7 ([]), Ef8 ({}), Ef9 (X), Ef10 (+).

Leyenda: FIGURA 4. EFECTO DE ESTREPTOMICINA SOBRE LA ACTIVIDAD DE CULTIVOS INICIADORES CONTENIENDO CEPAS DE Lactobacillus casei. CEPAS INHIBIDAS A 0,03 o 0,05 mg/ml: L1 (O), L2 ([]), L3 ({}), L4 (X), L5 (+), L6 ([DELTA]) Y L7 ([gradacion]).
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Author:Cabrera Salas, Lilibeth; Ferrer Ocando, Alexis; Ojeda de Rodriguez, Graciela; Sulbaran de Ferrer, Be
Publication:Revista Cientifica de la Facultad de Ciencias Veterinarias
Date:Jan 1, 1999
Words:3550
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