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Efecto de la criopreservacion sobre la integridad de la membrana plasmatica y acrosomal de espermatozoides de toros.

Effect of Cryopreservation on Integrity of Plasmatic and Acrosomal Membrane of Bulls Sperm

INTRODUCCION

La membrana espermatica (ME) es una estructura heterogenea y dinamica que presenta 5 dominios diferentes: acrosoma, segmento ecuatorial, region post-acrosomal, pieza intermedia y cola, ademas; participa en el reconocimiento y transporte de moleculas, con funciones especificas que permiten que el espermatozoide adapte su metabolismo al medio circundante, proporcionandole un sistema molecular para el reconocimiento del oocito [12]. De aqui deriva que, la evaluacion morfologica o estructural del espermatozoide hace enfasis en la valoracion de la integridad de su membrana plasmatica (MP) y acrosomal (MA), pudiendo en algunas casos evaluarlas juntas o por separado realizando tinciones sencillas y observando con un microscopio optico, observando mediante el uso de optica de contraste diferencial de interferencia o Nomarski, o utilizando microscopia electronica de transmision o de barrido. Sin embargo, aun cuando algunas tecnicas morfologicas proveen informacion veraz sobre los danos ocurridos a la MP y MA, no siempre se asocia a la fertilidad del toro (Bos taurus indicus), a menos que la injuria presente en los espermatozoides de una muestra seminal sea muy notable [18, 25]. La integridad de la ME es fundamental para el metabolismo espermatico e imprescindible en varios eventos involucrados en la fecundacion, como lo son la capacitacion, la reaccion acrosomica y la fusion con el oocito [18, 26, 38], lo cual, garantiza la fertilidad del macho reproductor.

El proceso de congelacion-descongelacion seminal afecta considerablemente la integridad estructural y funcional de los dominios de estas membranas, produciendose un efecto deletereo que menoscaba los resultados de la valoracion de motilidad, vitalidad y viabilidad espermatica postdescongelacion [18, 21, 24, 27, 36]. Para la valoracion de la integridad funcional de la MP y MA puede ser facilmente determinada usando pruebas muy sencillas y practicas que valoran la capacidad funcional de estas membranas a los cambios osmoticos, las cuales se basan en la reaccion de estas membranas cuando se exponen a soluciones hipo-osmoticas [21, 36], observando una alta correlacion entre la respuesta del espermatozoide a un medio hiposmotico y su capacidad de penetracion en oocito de hamster libre de zona pelucida [15]. Dentro de las pruebas desarrolladas a partir de este fenomeno destacan dos: el test de endosmosis o hiposmotico (HOST) y el test de resistencia osmotica (ORT), los cuales valoran dos distintas regiones del espermatozoide. El primer caso, es una prueba sencilla y rapida denominada test HOST "Hypoosmotic Swelling Test" y se basa en el concepto fisiologico de la semi-permeabilidad de las membranas plasmaticas intactas y bioquimicamente activas de los espermatozoides vivos, las cuales absorben agua cuando son expuestas a una solucion hiposmotica [26, 36]. Para que esta respuesta se produzca, la membrana plasmatica del espermatozoide debe estar integra y con los mecanismos de intercambio de fluidos funcionando correctamente. En los espermatozoides funcionalmente alterados no se produce la captacion selectiva de agua de forma adecuada alcanzandose asi un equilibrio pasivo entre los medios intra y extracelular que no provoca cambios morfologicos apreciables [18, 36].

Esta prueba se ha aplicado en el semen del hombre (Homo sapiens sapiens) [15, 35], del toro [6, 26], del perro (Canis familiares) [29], del caballo (Equus caballus) [3] y del cerdo (Sus scrofa domesticus) [8, 20], utilizando varias formulas. En bovinos, se ha sugerido el uso de fructosa o citrato de sodio diluido en agua destilada a 100 mOsm/L para realizar el test [6, 26]. Otros autores [27, 34, 36] utilizan medios con concentraciones un poco mas elevadas (150 mOsm/L) para evitar la aparicion de falsos negativos, producto de la ruptura de la membrana plasmatica que fisiologicamente deberia estar en condiciones isosmoticas a 300-320 mOsm/L.

En el segundo caso, el test de valoracion de la funcionalidad acrosomal, es una prueba denominada Osmotic Resistance Test (ORT) que permite valorar la integridad del acrosoma al someter los espermatozoides a un medio hiposmotico, de forma que aquellos funcionales no mostraran alteraciones estructurales evidentes a nivel acrosomico [6, 10, 20]. La evaluacion del estado de los acrosomas permite comparar la resistencia osmotica de las membranas de distintos eyaculados, asi como medir de manera indirecta la capacidad para soportar la criopreservacion [22, 30] y predecir el potencial reproductivo del toro [30, 31]. Al realizar esta prueba se evaluan dos grupos de muestras sometidas a dos diferentes condiciones, una en hiposmosis (150 mOsm/L) y otra en condiciones isosmoticas a 320 mOsm/L que sirve como grupo control al test [6]. Los resultados se reflejan de manera porcentual, luego de sumar los porcentajes de acrosomas intactos en las muestras evaluadas de ambos grupos y dividirlos entre dos, para obtener asi un cociente que representa el porcentaje de resistencia acrosomal al medio hiposmotico (%ORT) [10, 20].

El objetivo de este estudio fue determinar el efecto del proceso de criopreservacion sobre la integridad estructural y funcional de la MP y MA de espermatozoides bovinos, valorando para tal fin el porcentaje de vitalidad (VIT), el porcentaje de acrosomas danados "reaccionados o perdidos" (Damaged Acrosoma Ridge--DAR), y la respuesta de los espermatozoides a cambios osmoticos derivados del uso de los tests HOST y ORT.

MATERIALES Y METODOS

Localizacion del ensayo

El experimento fue realizado en el Centro de Inseminacion Artificial y Transferencia de Embriones (VIATECA[R]), ubicado en el km 104 de la carretera que conduce a Perija, Villa del Rosario, estado Zulia, Venezuela. Esta zona se clasifica agroecologicamente como bosque seco tropical y posee una temperatura anual entre 28 y 29,5[grados]C.

Coleccion y procesado del semen

Se estudiaron los eyaculados de 4 toros adultos, evaluando 5 diferentes muestras de semen fresco recien colectado y sus respectivas 5 muestras criopreservadas de los mismos lotes de congelacion. Cada muestra seminal (fresca o criopreservada) pertenecia a un dia distinto de colecta, evaluando en total 5 muestras frescas y 5 pajuelas por toro. Estos ejemplares fueron de comprobada calidad genetica y excelentes caracteristicas seminales, con edades comprendidas entre los 3 y 10 anos y pesos corporales que oscilan entre los 800 y 1000 kg.

Los eyaculados fueron colectados los dias viernes (la frecuencia de coleccion seminal fue dos veces por semana, evaluando solo una vez por semana, durante cinco semanas continuas) entre las 5:00 y 7:00 de la manana mediante vagina artificial. Despues de la evaluacion seminal de rutina, las muestras clasificadas como idoneas para congelar fueron diluidas, identificadas y envasadas en forma automatica en pajuelas de 0,54 mL, a una concentracion espermatica minima de 30 millones de espermatozoides por dosis. Luego las pajuelas fueron congeladas en tanques (Millenium 2000, YC 20, Minnesota, EUA) que contenian nitrogeno liquido en un proceso que constaba de dos pasos (estabilizacion y congelacion final a -196[grados]C). Una semana despues de la congelacion, las muestras fueron evaluadas nuevamente para obtener los resultados del semen criopreservado.

Analisis de laboratorio del semen fresco y descongelado

Solo fueron congeladas las muestras seminales con volumen, color, olor y aspecto de acuerdo a los patrones establecidos por el centro para las razas utilizadas, ademas de esto, el eyaculado debia obtener una concentracion espermatica superior a 850 millones de espermatozoides por mL, motilidad individual progresiva igual o superior al 60% y con menos del 30% de las anomalias primarias y secundarias.

Para la valoracion de la integridad estructural de la membrana plasmatica y acrosomal se utilizo la tincion eosina-nigrosina [1] tomando una alicuota (10[micron]uL) de semen fresco y descongelado y sobre una platina termorregulable (Osaka, OK 51, Espana) a 37[grados]C se mezclaba suavemente con la misma cantidad del colorante para realizar un frotis donde se evaluo el porcentaje VIT y DAR.

Para la valoracion de la funcionalidad de la membrana espermatica y acrosomal (integridad funcional), se utilizo el test HOST y ORT, tanto para el semen fresco, como para el descongelado. En ambas pruebas se incubo el semen durante 30 minutos en un medio hiposmotico de citrato de sodio (2,7 g/ 100 mL) a 150 mOsm/ L en un bano Maria termoestable (Water Bath YCW-035, Taiwan) a 37[grados]C, despues se centrifugaban a 0,3 RCF (Relative Centrifuge Force) por 2,5 minutos en una micro-centrifuga (Minispin plus eppendorf 22331 Hamburg, Alemania). De la centrifugacion se obtuvo un sedimento (espermatozoides) y un sobrenadante, el cual se desecho en un 80%. El sedimento se resuspendio con el sedimento sobrante y se extrajo un alicuota de 10 [micron]L para realizar la tincion de eosina-nigrosina [1], luego se observaron 200 espermatozoides por muestra analizada en un microscopio optico (Globe, modelo 1600, Alemania) utilizando el objetivo de inmersion a 1000X de aumento. En el primer caso (HOST) se observaron las reacciones positivas al test, las cuales fueron medidas al verificar los flagelos de los espermatozoides enrollados totalmente, enrollados parcialmente, acodados o acodados tenues. El resultado final se expresaba porcentualmente. Para el segundo caso (ORT) las muestras fueron dividas en dos alicuotas e incubadas en dos medios distintos, uno hiposmotico (150 mOsm/L) y otro isosmotico (300 mOsm/L) y se cuantificaron las reacciones acrosomicas (acrosomias parciales y perdidas totales del acrosoma) en cada uno de los dos medios. El resultado final se expresaba en porcentaje, luego de aplicar una formula y obtener un cociente simple (%ORT = % de acrosomias contadas en las muestras tenidas provenientes del medio hiposmotico + % de acrosomias cuantificadas en el medio isosmotico [Control], el resultado de la suma directa de estas dos variables se dividia en dos "2").

Analisis estadistico

Todos los datos grabados fueron analizados por SAS/ Statistical Analysis System software 8,2, para Windows (SAS Inst. Inc.; Carry, NC. EUA). Las variables evaluadas (Vitalidad, DAR, ORT, HOST) de 5 muestras de semen fresco recien colectado y 5 pajuelas de semen descongelado proveniente de 4 toros adultos distintos, se analizaron en varios eyaculados de cada toro utilizando el Modelo Lineal General (Proc GLM). Cuando se encontraron diferencias entre las medias se cuantifico el efecto mediante el procedimiento LSMEANS.

El modelo matematico utilizado fue:

[Y.sub.ijk] = [my] + [T.sub.i] + A[(T).sub.j(i)] + [xi]ijk

donde:

[Y.sub.ijk] = Respuesta traducida en: Parametros de valoracion de la calidad seminal, que incluyeron Pruebas de valoracion de la integridad estructural de la MP y MA (Vitalidad y DAR), y pruebas de valoracion de la integridad funcional de la MP y MA (ORT y HOST).

[my] = Media general.

Ti = Efecto del i-esimo tratamiento (i = semen fresco/ descongelado).

A[(T).sub.j(i)] = Efecto del j-esimo animal anidado dentro del i-esimo tratamiento.

[[xi].sub.ijk] = Error experimental, asumido normal e independientemente distribuido con media cero y varianza [[sigma].sup.2] DNI~(0,[[sigma].sup.2] DNI).

Este modelo estadistico evalua el efecto de la congelacion-descongelacion seminal (anidando la variable animal) sobre los parametros de integridad de la MP y MA, como ha sido documentado por otros autores al cuantificar el dano que produce este proceso sobre los diferentes dominios de membrana, principalmente, en lo que respecta a su integridad estructural y funcional [24, 27, 34, 39].

RESULTADOS Y DISCUSION

Las medias generales ([my]) y el error estandar (EE) de las caracteristicas evaluadas en semen fresco y descongelado de los toros, asi como el efecto detrimental de la criopreservacion, se muestran en la TABLA I. Al evaluar el semen fresco se evidencio que el volumen (8,35 [+ o -] 0,60 mL), la concentracion espermatica (1265,30 [+ o -] 49,36 x [10.sup.6] spz/ mL), la motilidad masal (3,25 [+ o -] 0,13) e individual (62,91 [+ o -] 1,4) de los eyaculados estaban dentro de los rangos normales descritos para toros utilizados en centros de IA [17, 36], por lo tanto, se procedio a criopreservar los eyaculados.

Se pudo evidenciar el efecto detrimental del proceso de criopreservacion seminal sobre los parametros que valoran la calidad espermatica en semen descongelado. El porcentaje de motilidad individual progresiva y la vitalidad se afectaron durante el proceso de criopreservacion, disminuyendo su valor de 62,91 a 40,00% y de 92,95 a 72,80%, respectivamente (P<0,01), y ubicandose en el limite inferior recomendado para los toros destinados a IA [17, 36], sin embargo, este hallazgo es similar a un reporte previo hecho en Venezuela [37]. Es conocido que los espermatozoides de mamifero son sensibles al proceso de crioprervacion [12], debido a que pasos como la adicion del crioprotector, el proceso de enfriamiento, la congelacion, el almacenamiento en nitrogeno liquido y la descongelacion causan un marcado deterioro en la MP y MA [22, 39], viendose reflejado en una disminucion de la motilidad individual y viabilidad cuando se evalua el semen descongelado [11, 38].

La integridad morfologica de MA fue evaluada con la tincion de eosina-nigrosina, el cual no es un colorante de eleccion para la valoracion del acrosoma, como lo son la tincion de Giemsa, Naphtol amarillo o eritrosina B, sin embargo, ha sido usado satisfactoriamente al utilizar el objetivo de de 1000X (inmersion), como lo corroboran trabajos previos en diferentes especies [1, 24]. El DAR despues de la criopreservacion presento un aumento considerable del 10,00% al 35,25% (P<0,01), lo cual concuerda con los resultados de otros experimentos [22, 37] y pudiera estar relacionado con una concentracion lipidica atipica en la MP y MA, que predispone a un incremento de la susceptibilidad de estas membranas al enfriamiento [12], los espermatozoides de ciertas especies animales (como el toro, verraco y morueco), en cuyas membranas la relacion acidos grasos insaturados/acidos grasos saturados es muy alta, son mas sensibles al frio [36]. Mas del 35% de DAR en las muestras seminales descongeladas, resulta ser alto para conseguir una tasa de fertilidad idonea, ya que ha sido indicado que una alta proporcion de acrosomas alterados o ausentes suele relacionarse con una fertilidad baja [7, 22, 23, 27, 28]. Este hecho pudiera afectar notablemente la tasa de fertilidad, debido a que, la reactividad de la membrana acrosomal representa un requisito absoluto para la fertilizacion in vivo y solo los espermatozoides que pueden realizar la reaccion acrosomal de manera sincronizada con la fase de penetracion del oocito, tienen la habilidad de pasar a traves de la zona pelucida y, como consecuencia, fusionarse con este, para formar un embrion [13].

En cuanto a la evaluacion de la funcionalidad de la MP y MA, los resultados del ORT mostraron diferencias altamente significativas (P<0,01), al comparar las muestras frescas y descongeladas (88,75% vs. 52,20%). Un porcentaje de resistencia acrosomal superior al 85% para las muestras frescas pudiera ser indicativo de una excelente capacidad de conservacion de los eyaculados [22, 30]; sin embargo, el 52,20% luego de la descongelacion, junto con, el alto porcentaje de acrosomas alterados (35,25%) hace presumir que el acrosoma es una de las estructuras mayormente afectadas luego de la criopreservacion [12, 22, 27], lo cual es muy relevante motivado a que el ORT ha demostrado tener una correlacion alta y positiva con la capacidad fecundante del espermatozoide [22, 23].

En la prueba de funcionalidad de la MP luego de la incubacion en un medio hiposmotico (HOST), es imperante recalcar que se realizo una pequena modificacion a la prueba original usada en 1984 [15] basando en los estudios realizados en 1991 en la Universidad de Loma Linda, California por Chan y col. [4] quienes introdujeron una modificacion a la tecnica ya descrita, donde se combina este test con una tincion supravital. Es asi como en este experimento, los resultados mostraron diferencias estadisticas significativas (71,85% vs. 50,82%) entre los eyaculados frescos y las muestras descongeladas, lo que lleva a pensar, que el proceso criopreservacion bajo las condiciones en que se realizo este estudio, afecta tanto la funcionalidad de la MA como de la MP, mostrada en el DAR y en la capacidad de reaccion de los espermatozoides a producir una torsion helicoidal del flagelo, en las muestras incubadas en hiposmosis. La funcionalidad espermatica puede verse afectada por la crio injuria, causando un efecto deletereo sobre la funcion del acrosoma [7, 16, 22], de la membrana plasmatica [21], potencial de membrana mitocondrial e integridad del ADN [2].

Es importante acotar que, el hinchamiento de las celulas se puede provocar mediante otras vias distintas al descenso de la osmolaridad del medio que rodea a las celulas. Soluciones isosmoticas de solutos polares como el glicerol, pueden provocar el hinchamiento celular debido a la capacidad de estas sustancias de arrastrar agua cuando atraviesan la membrana celular, alterando asi el equilibrio de las presiones osmoticas internas y externas [12]. De esta manera, las alteraciones celulares atribuidas al glicerol parecen estar mas relacionadas con un shock osmotico que con la toxicidad quimica [9]. A pesar de todo ello, todavia existe un gran desconocimiento sobre los mecanismos moleculares especificos que el espermatozoide utiliza para reaccionar frente a un medio hiposmotico [23]

La integridad estructural de la MP y MA se vieron notablemente afectadas por la criopreservacion al comparar las muestras frescas y descongeladas de cada uno de los toros muestreados en este ensayo (TABLA II). Se mostro como estas estructuras son marcadamente afectadas por la accion deleterea del proceso criogenico, evidenciando un deterioro de la vitalidad y viabilidad de todas las muestras seminales evaluadas, sin embargo, se sabe que, los resultados de estos dos parametros de evaluacion de calidad seminal no siempre estan correlacionados con la fertilidad del semen [33], a menos que el dano que presenten los espermatozoides sea muy importante [25, 27].

Las variables que valoran la integridad estructural de la MP y MA (vitalidad y DAR) en las muestras de semen fresco, no mostraron diferencias (P>0,05) entre los toros evaluados. Sin embargo, las muestras seminales descongeladas si mostraron distintos patrones de resistencia a la incubacion hiposmotica luego de haber sido sometidos a la criopreservacion, lo que corrobora la informacion aportada por otros investigadores [14, 32]. Se pudo evidenciar que las muestras seminales de los toros resisten de manera distinta el proceso de congelacion-descongelacion seminal, de alli que muchas veces se puede encontrar toros destinados a IA, con excelentes parametros de calidad seminal en las muestras frescas y que sean catalogados posteriormente como malos congeladores, obteniendo diferentes fertilidades a nivel de campo [18, 27].

El toro C mantuvo una excelente integridad de MP y MA y mostro el mejor desempeno al realizar las pruebas antes y despues de la criopreservacion (P>0,05), evidenciando solo diferencias estadisticas significativas a su favor, al evaluar la integridad del acrosoma en las muestras criopreservadas y al compararlas con el toro A. Resultado que es logico si se toma en cuenta que este ejemplar (A) fue el de peor respuesta de todos. Los toros B y D mostraron resultados intermedios. El toro A fue el que tuvo peor desempeno al evaluar la integridad morfologica de la MP y MA en las muestras seminales frescas y descongeladas (P<0,05). Asi mismo, fue el que obtuvo la menor motilidad individual progresiva (P<0,05) al evaluar las muestras 7 dias postcongelacion. Todos estos parametros de valoracion de la calidad seminal resultan determinantes para alcanzar una fertilidad optima en toros [16, 37]. La integridad de la MP, integridad de la MA y la motilidad individual progresiva postcongelacion, reflejan la viabilidad espermatica y el proceso de criopreservacion tiene un efecto directo sobre estas variables al afectar las membranas celulares ocasionando danos como hinchamiento y disrupcion, cambios en la fluidez, alteracion del flujo de calcio y cambios en la actividad enzimatica que pueden inducir una capacitacion espermatica anticipada y/o reaccion acrosomica, viendose afectada la fertilidad de los toros destinados a IA [14, 34, 37].

Los resultados de las pruebas que evaluan la funcionalidad espermatica de cada uno de los toros evaluados se muestran en la TABLA III. Se pudo evidenciar como la funcionalidad de la MA de los espermatozoides de cada toro se afecto notablemente debido al proceso de criopreservacion. Sin embargo, en semen fresco, no se evidencio diferencias estadisticas significativas entre toros, al realizar el ORT. Empero, el toro C presento un porcentaje de resistencia acrosomal de 91,90 y 66%, que estuvo por encima de los demas toros evaluados en los eyaculados frescos (P>0,05) y en los criopreservados, respectivamente (P<0,05). Lo que llevaria a aseverar que presentara un fertilidad optima, debido a que el ORT ha sido altamente correlacionado con la fertilidad in vitro e in vivo [31]. Se ha referido que el proceso de congelacion-descongelacion seminal puede afectar, tanto la integridad estructural [19, 22], como la funcion de las enzimas del acrosoma (proteasas y acrosina) [16]. La relacion entre la funcionalidad acrosomal y la fertilidad del semen bovino parece ser suficientemente estrecha para sugerirla como prueba de prediccion de la capacidad fecundante del semen de toros reproductores [5, 22] o en su defecto, complementar los parametros rutinarios de valoracion seminal [28]. Los toros B y D luego de la criopreservacion tuvieron un incremento en el porcentaje de acrosomas reaccionados por encima del 40% (P>0,05), lo que hace pensar que estos dos toros perdieron viabilidad acrosomal al ser sometidos al proceso de congelaciondes-congelacion seminal. La determinacion de la presencia del acrosoma en semen descongelado se considera como un buen indicador de calidad seminal optima [37] [TABLA III].

En otro orden de ideas, se ha descrito que el dano criogenico sobre la cabeza y el flagelo espermatico pueden ocurrir independientemente uno del otro, y la presencia de la membrana flagelar intacta, no indica necesariamente membrana acrosomal integra [39]. Razon por la cual en este experimento, se realizaron dos pruebas evaluacion de funcionalidad espermatica de dos distintas partes (MP y MA) del espermatozoide, para la mejorar la fiabilidad y predictividad de los resultados, como lo sugirieron en otros trabajos [7, 21]. Para el caso del HOST, no se evidenciaron diferencias estadisticas significativas entre toros, en los eyaculados frescos y en las muestras criopreservadas. Sin embargo, los resultados contribuyeron a complementar las pruebas de valoracion de la integridad morfologica de la MP y MA (VIT y DAR), debido a que el toro A tambien mostro con el HOST una propension numerica desfavorable al evidenciar el peor desempeno en las muestras frescas y criopreservadas (P>0,05). Este toro junto con el ejemplar D, al realizar las pruebas de integridad estructural y funcional mostraron pobres desempenos, al compararlos con sus coetaneos; sin embargo, fueron los menos afectados en lo que respecta al efecto de la criopreservacion sobre funcionalidad de la MP (menor al 15% ambos), esto pudiera deberse a que fueron mayormente afectados en la integridad de la MA y que su MP no fue marcadamente afectada por el procesado. Tambien pudiera ser que la presion osmotica (150 mOsm/L) utilizada en el test no fue lo suficientemente baja para inducir que los espermatozoides reaccionaran adecuadamente, debido a que algunos investigadores han sugerido para el semen bovino el uso de fructosa o citrato de sodio a una presion osmotica de 100 mOsm/L [6, 15, 26].

CONCLUSIONES

Se sabe que la criopreservacion, tiene como proposito garantizar la supervivencia de los espermatozoides, sin embargo, en una elevada y variable proporcion de ellos suele ocasionar danos irreversibles a la membrana plasmatica y acrosomal que pueden causar muerte celular e infertilidad. Los resultados de este experimento demuestran que el proceso de congelacion-descongelacion afecta la integridad de estas membranas, tanto a lo referente a morfologia como funcionalidad. Sin embargo, se pudo demostrar como los espermatozoides de los diferentes toros evaluados, resisten de manera distinta los efectos detrimentales de la criopreservacion. Asi mismo, el estudio confirma que el dano criogenico puede ocurrir indistintamente sobre la integridad estructural y funcional MP y MA, lo que pudiera afectar la capacidad fecundante de las muestras seminales destinadas a IA.

Recibido: 15/04/2008. Aceptado: 02/10/2008.

AGRADECIMIENTO

Al Consejo de Desarrollo Cientifico y Humanistico de la Universidad del Zulia, por el aporte economico brindado mediante el proyecto No: CC-0006-07, para realizar esta investigacion. A la empresa privada VIATECA por el apoyo en el desarrollo de esta investigacion.

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Jorge L. Rubio-Guillen, Armando A. Quintero-Moreno * y Decio M. Gonzalez Villalobos

Unidad de Investigacion en Produccion Animal (UNIPA), Laboratorio de Andrologia, Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad del Zulia (LUZ). FCV-LUZ. Apdo. 15252, Maracaibo 4005-A. * E-mail: arturo93@cantv.net. Telf.: 02617596111.
TABLA I

EFECTO DE LA CRIOPRESERVACION (Media [+ o -] EE) SOBRE LOS
PARAMETROS QUE VALORAN LA CALIDAD ESPERMATICA DE TOROS/
CRYOPRESERVATION EFFECT (Media [+ o -] EE) ON SEMINAL
QUALITY PARAMETERS IN BULL SEMEN

Caracteristicas        Semen Fresco        Semen descongelado

Volumen (mL)         8,35 [+ o -] 0,60             --
                        (7,10-9,59)
Concentracion      1265,30 [+ o -] 49,36           --
  (spz/ mL)            x [10.sup.6]
                      (1161,9-1368,6)
Motilidad masal      3,25 [+ o -] 0,13             --
  (0-4)                 (2,96-3,53)
Motilidad           62,91 [+ o -] 1,40     40,00 [+ o -] 2,87
  individual (%)      (60,0-65,8) (a)      (33,97-46,02) (b)
Vitalidad (%)       92,95 [+ o -] 0,59     72,80 [+ o -] 3,81
                     (91,72-94,18) (a)     (64,80-80,79) (b)
DAR (%)             10,00 [+ o -] 0,70     35,25 [+ o -] 2,87
                     (8,54-11,45) (a)      (29,22-41,27) (b)
ORT (%)             88,75 [+ o -] 0,81     52,20 [+ o -] 3,91
                     (87,24-90,20) (a)     (47,81-58,38) (b)
HOST (%)            71,85 [+ o -] 3,51     50,82 [+ o -] 3,90
                     (64,50-79,19) (a)     (42,65-58,99) (b)

Valores entre parentesis denotan intervalos de confianza de
la variable estudiada. (spz/ mL): numero de espermatozoides
por mililitro de semen. DAR (%): porcentaje de acrosomas
reaccionados o perdidos. ORT (%): espermatozoides reaccionados
al test de resistencia osmotica. HOST (%): espermatozoides
positivos al test de endosmosis. (a, b): letras diferentes en
las filas denotan diferencias estadisticas significativas
(P<0,05).

TABLA II

PARAMETROS DE VALORACION DE LA INTEGRIDAD ESTRUCTURAL DE LA
MEMBRANA PLASMATICA Y ACROSOMAL (MEDIAS [+ o -] EE) EN EL
SEMEN FRESCO Y DESCONGELADO DE LOS TOROS/ EVALUATION
PARAMETERS OF STRUCTURAL INTEGRITY OF PLASMATIC AND ACROSOMAL
MEMBRANE (MEANS [+ or -] EE) IN FRESH AND THAWED BULL SEMEN

Parametro   Tratamiento              Toros

                                 A               B

VIT (%)        Fresco      92,50 [+ o -]   92,50 [+ o -]
                             2,81 (a)        2,81 (a)
            Descongelado   48,40 [+ o -]   81,40 [+ o -]
                             3,08 (b)        3,08 (a)
DAR (%)        Fresco      12,50 [+ o -]   9,83 [+ o -]
                             3,01 (a)        3,01 (a)
            Descongelado   49,60 [+ o -]   31,40 [+ o -]
                             3,29 (a)        3,29 (b)

Parametro             Toros

                  C               D

VIT (%)     95,16 [+ o -]   91,66 [+ o -]
              2,81 (a)        2,81 (a)
            81,40 [+ o -]   80,00 [+ o -]
              3,08 (a)        3,08 (a)
DAR (%)     8,50 [+ o -]    9,16 [+ o -]
              3,01 (a)        3,01 (a)
            28,40 [+ o -]   31,60 [+ o -]
              3,29 (bc)       3,29 (b)

(a, b): letras diferentes en las filas denotan diferencias
estadisticas significativas (P<0,05). VIT (%): porcentaje
de espermatozoides vivos (negativos a la tincion eosina).
DAR (%): porcentaje de acrosomas reaccionados o perdidos.

TABLA III

PARAMETROS DE VALORACION DE LA FUNCIONALIDAD ESPERMATICA
(MEDIAS [+ o -] EE) EN EL SEMEN FRESCO Y DESCONGELADO DE
LOS TOROS/EVALUATION PARAMETERS OF SPERM FUNCTIONALITY
(MEANS [+ or -] EE) IN FRESH AND THAWED BULL SEMEN

Parametro   Tratamiento               Toros

                                 A               B

ORT (%)        Fresco      86,40 [+ o -]   90,30 [+ o -]
                             2,74 (a)        2,74 (a)
            Descongelado   52,40 [+ o -]   50,00 [+ o -]
                             2,74 (b)        2,74 (b)
HOST (%)       Fresco      55,90 [+ o -]   86,00 [+ o -]
                             6,62 (a)        6,62 (a)
            Descongelado   43,10 [+ o -]   54,20 [+ o -]
                             6,62 (a)        6,62 (a)

Parametro              Toros

                  C               D

ORT (%)     91,90 [+ o -]   86,91 [+ o -]
              2,74 (a)        2,74 (a)
            66,00 [+ o -]   44,00 [+ o -]
              2,74 (a)        2,74 (b)
HOST (%)    80,90 [+ o -]   64,60 [+ o -]
              6,62 (a)        6,62 (a)
            56,20 [+ o -]   49,80 [+ o -]
              6,62 (a)        6,62 (a)

(a, b): letras diferentes en las filas denotan diferencias
estadisticas significativas (P<0,05). ORT (%): espermatozoides
reaccionados al test de resistencia osmotica. HOST (%):
espermatozoides positivos al test de endosmosis.
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Author:Rubio-Guillen, Jorge L.; Quintero-Moreno, Armando A.; Gonzalez Villalobos, Decio M.
Publication:Revista Cientifica de la Facultad de Ciencias Veterinarias
Date:Jul 1, 2009
Words:5768
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